2 н: Правописание причастий. Русский язык, 7 класс: уроки, тесты, задания.

alexxlab | 29.12.1998 | 0 | Разное

Содержание

Правописание причастий. Русский язык, 7 класс: уроки, тесты, задания.

1. Гласные в суффиксах действительных причастий настоящего времени

Сложность: среднее

4
2. Гласная перед суффиксом действительных причастий прошедшего времени

Сложность: среднее

3
3. Гласная в суффиксе страдательного причастия

Сложность: среднее

2
4. Гласная перед НН в страдательных причастиях

Сложность: лёгкое

1,5
5. НН в причастиях

Сложность: среднее

3
6. Решение задач

Сложность: сложное

4
7. Н и НН в причастиях

Сложность: среднее

1,5
8. Причастие или наречие

Сложность: среднее

3
9. Безударные окончания причастий

Сложность: лёгкое

2
10. НЕ — слитно или раздельно?

Сложность: сложное

2
11. Слитно или раздельно (1)

Сложность: сложное

1,5
12. Слитно или раздельно (2)

Сложность: сложное

3

ОГЭ/ГИА по физике: комплект №2-Н

Комплект предназначен для выполнения экспериментальных заданий ОГЭ по физике в соответствии со Спецификацией КИМ для проведения в 2021 г. ОГЭ по физике, утвержденной ФГБНУ «ФИПИ». Комплект позволяет измерять жесткость пружины, коэффициент трения скольжения, работу силы трения и силы упругости, а также исследовать зависимость силы трения скольжения от силы нормального давления и от рода поверхности, зависимость силы упругости, возникающей в пружине, от степени деформации.

Комплект поставки

1

Основание штатива

1

2

Муфта штатива

1

3

Стержень штатива ∅8х545 мм с гайкой

1

4

Стержень ∅6х160 мм

1

5

Динамометр 1 Н (С = 0,01 Н)

1

6

Динамометр 5 Н (С = 0,1 Н)

1

7

Пружина 1 (жёсткость 50 Н/м) на планшете со шкалой 100 мм

1

8

Пружина 2 (жёсткость 10 Н/м) на планшете со шкалой 100 мм

1

9

Груз №1, №2, №3 (m = 100 г каждый)

3

10

Набор отдельных грузов (m = 30 г – 2 шт., m = 10 г – 2 шт)

1

11

Линейка (длина 300 мм)

1

12

Транспортир

1

13

Брусок с крючком (m = 50 г)

1

14

Нить суровая – длина 1м

1

15

Направляющая длиной 500 мм (с поверхностями различных коэффициентов трения)

1

16

Рожковый ключ размером S 10 мм.

1

17

Ложемент

1

30/2-Н (настенный) облучатель-рециркулятор бактерицидный закрытого типа

Облучатель предназначен для обеззараживания воздуха помещений, как в присутствии, так и в отсутствии людей:

  • помещения лечебно-профилактических учреждений I-V категорий, где требуется постоянное поддержание асептических условий (особенно в случаях высокой степени риска распространения заболеваний, передающихся воздушно-капельным и воздушным путем)
  • помещения с повышенным риском распространения инфекционных заболеваний (общественные учреждения, в том числе школьные и дошкольные учреждения, предприятия общественного питания, коммунальные объекты)
  • частные дома, особенно в период эпидемии острых респираторных заболеваний

Основные преимущества

  • в качестве пуско-регулирующего устройства лампы используется бесстартерное электронное устройство повышенной надежности
  • наличие таймера, отсчитывающего ресурс работы бактерицидной лампы
  • при остановке вентилятора электронная схема отключает рециркулятор, что повышает эффективность его работы
  • конструкция облучателя обеспечивает защиту присутствующих в помещении людей от коротковолнового ультрафиолетового излучения

Технические характеристики

Источник облучения и дезинфекции воздуха бактерицидная лампа TUV30W/G13T8 (PHILIPS)
Количество источников излучения 2
Производительность по потоку, не менее, м3/час 90
Диапазон установки таймера бактерицидной лампы, ч 0÷9999
Корректированный уровень звуковой мощности, не более, дБА 55
В качестве пуско-регулирующего устройства лампы используется бесстартерное электронное устройство повышенной надёжности Наличие
Отключение рециркулятора при остановке вентилятора для обеспечения эффективного использования лампы Наличие
Электропитание 220 В, 50 Гц
Потребляемая мощность, не более, ВА 120
Габаритные размеры облучателя, мм не более 250 x 132 x 1030
Масса не более, кг 4.5
Срок службы бактерицидной лампы, ч 8000

N-белок SARS-CoV-2 противодействует передаче сигналов интерферона типа I путем подавления фосфорилирования и ядерной транслокации STAT1 и STAT2

Вспышка коронавирусной болезни 2019 года (COVID-2019) быстро распространилась по всему миру с конца 2019 года и приобрела характер пандемии 1 . Возбудителем COVID-19 является новый штамм коронавируса, названный коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2).SARS-CoV-2 представляет собой оболочечный вирус с одноцепочечным геномом РНК с положительным смыслом, который принадлежит к роду Betacoronavirus семейства Coronaviridae и является третьим коронавирусом, который, как сообщается, вызывает тяжелые респираторные заболевания вместе с SARS. -CoV и коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV). Геномная РНК SARS-CoV-2 составляет ~30  т.п.н., которая содержит 12 открытых рамок считывания (ORF), кодирующих структурные белки оболочки (E), шипа (S), мембраны (M) и нуклеокапсида (N).

Противовирусный путь, опосредуемый интерфероном (ИФН), является одним из основных врожденных иммунных механизмов против вторжения вирусных патогенов, который состоит из двух стадий, включая активацию ИФН и передачу сигналов ИФН. В первом случае вирусная инфекция быстро индуцирует экспрессию и секрецию IFN I и III типов. На последней стадии секретируемые интерфероны типа I и III связываются с рецепторами клеточной поверхности, чтобы инициировать нижестоящую передачу сигналов янус-киназы (JAK) и активатора транскрипции (STAT).Связывание интерферонов с их рецепторами активирует и фосфорилирует внутриклеточные тирозинкиназы, включая JAK1, JAK2, JAK3 и тирозинкиназу 2 (TYK2), что приводит к последующему фосфорилированию и активации STAT1 и STAT2. Фосфорилированные STAT1 и STAT2 могут образовывать гетеродимеры и взаимодействовать с регуляторным фактором 9 IFN (IRF9) с образованием транскрипционного комплекса IFN-стимулированного гена фактора 3 (ISGF3), который перемещается в ядро ​​и связывается с IFN-стимулируемым ответным элементом (ISRE) Промотор IFN-стимулированного гена (ISG), активирующий экспрессию ISG для установления противовирусного состояния хозяина 2 .

Было обнаружено, что иммунная сигнализация интерферона I типа (IFN-I) ослаблена в случаях COVID-19, что подтверждает гипотезу о том, что SARS-CoV-2 использует некоторый механизм (механизмы) для уклонения от опосредованного IFN-I противовирусного врожденного иммунитета. , что способствует патогенности SARS-CoV-2. Действительно, во время совместной эволюции и гонки вооружений с иммунной системой хозяина многие вирусы разработали сложные стратегии обхода передачи сигналов IFN. Однако остается в значительной степени без ответа, кодирует ли SARS-CoV-2 какой-либо белок для противодействия системе IFN.

Мы стремились выяснить, подавляет ли белок N SARS-CoV-2 передачу сигналов IFN, изучив влияние белка N на индуцированную вирусом Сендай (SeV) активацию промотора ISRE с помощью репортерного анализа люциферазы. Мы обнаружили, что эктопическая экспрессия белка N значительно ингибировала активацию ISRE, индуцированную инфекцией SeV (рис. 1а), и анализ количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) также показал, что SeV-индуцированная экспрессия ISG56, ISG54 и ISG15 значительно ингибировались в присутствии белка N (фиг.1b и дополнительный рисунок S1a, b). Наши дальнейшие результаты показали, что N-белок SARS-CoV-2 также проявлял значительный ингибирующий эффект на активацию промотора ISRE, индуцированную либо IFN-2α, либо IFN-β (рис. 1c, d), указывая на то, что N-белок SARS-CoV-2 может действовать как антагонист передачи сигналов IFN.

Рис. 1: Белок SARS-CoV-2 N противодействует передаче сигналов IFN.

a , c , d Клетки 293T котрансфицировали плазмидами, как указано. Через 24 ч после трансфекции (hpt) клетки затем инфицировали SeV ( a ) или обрабатывали IFN-2α ( c ) или IFN-β ( d ), а через 12 hpi репортерная активность был обнаружен двойной репортерной системой люциферазы.Клетки b 293T трансфицировали плазмидой, как указано. Затем через 24 часа клетки инфицировали SeV. Суммарные РНК экстрагировали при 12 HPI. Уровни мРНК ISG56 измеряли с помощью qRT-PCR. Клетки e 293T трансфицировали плазмидой, как указано. Затем через 24 hp клетки инфицировали SeV, собирали клеточные лизаты и анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Клетки f 293T трансфицировали плазмидой, как указано. Через 24 часа клетки обрабатывали IFN-β или без него в течение 15 или 30 минут.Клеточные лизаты собирали и анализировали вестерн-блоттингом. г клеток 293T трансфицировали плазмидами, как указано. Через 24 часа клетки подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию антителами, как указано. Масштабные линейки, 20  мкм. ч Клетки 293T трансфицировали плазмидой, как указано. Через 48 hp клетки собирали и подвергали co-IP анализу. Клетки i 293T трансфицировали плазмидой, как указано. Через 24 часа клетки обрабатывали IFN-β или без него в течение 30 мин.Клетки подвергали анализу клеточного фракционирования. Клетки j , k HepG2 трансфицировали плазмидой, как указано. Через 24 ч клетки были инфицированы SARS-CoV-2 при множественности инфекций 0,1. При 24 HPI экстрагировали общие РНК и измеряли уровни РНК SARS-CoV-2 ( j ) и ISG15 ( k ) с помощью анализа qRT-PCR. 1 клеток HepG2 трансфицировали плазмидой, как указано. Через 24 hp клетки были инфицированы SARS-CoV-2 или без него при MOI 0.1, и при 24 HPI собирали клеточные лизаты и анализировали с помощью вестерн-блоттинга. м Рабочая модель. Структурный белок N, кодируемый SARS-CoV-2, взаимодействует со STAT1 и STAT2 и подавляет фосфорилирование и ядерную транслокацию STAT1 и STAT2, что блокирует передачу сигналов IFN. Критерий Стьюдента t использовали для оценки статистической значимости. * P  < 0,05 и ** P  < 0,01. Данные представлены как среднее ± ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. Плотность пятен анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ.

Для дальнейшего изучения подробного механизма, с помощью которого N SARS-CoV-2 подавляет передачу сигналов IFN, мы исследовали активацию/экспрессию компонентов пути JAK/STAT в ответ на инфекцию SeV. С этой целью клетки 293T, временно или стабильно экспрессирующие белок N, инфицировали SeV в течение 12 часов, а затем анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на рис. 1e и дополнительном рис. S1c, эктопическая экспрессия N SARS-CoV-2 не влияла на стационарные уровни STAT1 и STAT2, в то время как фосфорилирование STAT1 и STAT2 (p-STAT1, Tyr701 и p -STAT2, Tyr690) были явно снижены в клетках, экспрессирующих белок N, по сравнению с таковыми в контрольных клетках.Эти результаты показывают, что белок N SARS-CoV-2 может ингибировать фосфорилирование STAT1 и STAT2, вызванное инфекцией SeV. Мы также обнаружили, что p-STAT1 и p-STAT2 снижались в присутствии белка N через 15  или 30 минут после индукции IFN-β (рис. 1f). В совокупности наши результаты показывают, что белок N SARS-CoV-2 может противодействовать передаче сигналов IFN-I путем ингибирования фосфорилирования STAT1 и STAT2.

Мы стремились выяснить, может ли N-белок связываться со STAT1 и STAT2, исследуя их субклеточную локализацию с помощью конфокальной микроскопии.Наши результаты показали, что белок N, очевидно, совместно локализован как со STAT1, так и со STAT2 в цитоплазме (рис. 1g). Более того, белок N, меченный Flag, может быть ко-иммунопреципитирован (co-IP) вместе с меченым HA STAT1 или STAT2 (рис. 1h). Эти результаты показывают, что SARS-CoV-2 N может взаимодействовать со STAT1 и STAT2 в клетках. Более того, наш результат показал, что N SARS-CoV-2 мешал взаимодействиям STAT1 с JAK1 и STAT2 с TYK2 (дополнительный рис. S1d, e) соответственно, что позволяет предположить, что белок N SARS-CoV-2 может конкурентно связываться со STAT1/ STAT2 с нижестоящими киназами и, в свою очередь, ингибирует их фосфорилирование.

ИФН-индуцированная ядерная транслокация STAT1/STAT2 является важным этапом для передачи противовирусного сигнала. Затем мы исследовали, может ли N-белок влиять на ядерную транслокацию STAT1/STAT2, индуцированную IFN. Клетки 293T, экспрессирующие белок N, разделяли на цитоплазматическую и ядерную фракции через 30 мин после индукции IFN-β. Наши результаты показали, что уровни p-STAT1 и p-STAT2 были снижены в ядерной фракции в присутствии белка N (рис. 1i). Вместе наши результаты показывают, что белок N SARS-CoV-2 может взаимодействовать со STAT1 и STAT2 и подавлять их ядерную транслокацию, индуцированную IFN.

Предыдущие исследования показали, что различные функциональные домены белка N SARS-CoV имеют решающее значение для антагонизма IFN-I 3 . Мы сконструировали векторы для остатков 1–361 (N 1–361 ) и 362–422 (N 362–422 ) N SARS-CoV-2 и исследовали их влияние на активацию промотора ISRE, индуцированную SeV в клетки 293Т. Мы обнаружили, что N-концевой 1-361 аминокислоты N SARS-CoV-2 было достаточно для подавления активации ISRE-промотора (дополнительная фиг.С2а). Соответственно, уровни p-STAT1 были явно снижены в присутствии N 1–361 или полноразмерного белка N, тогда как N 362–422 демонстрировал минимальное влияние на фосфорилирование STAT1 (дополнительная рис. S2b). Кроме того, анализ конфокальной микроскопии показал, что, подобно полноразмерному белку N, N 1–361 также совместно локализован со STAT1 и STAT2 в цитоплазме, тогда как N 362–422 утратил совместную локализацию со STAT1 или STAT2. Дополнительный рис. S2c, d).Более того, анализы co-IP также подтвердили, что N 1–361 взаимодействует со STAT1 и STAT2 в клетках, в то время как N 362–422 этого не делает (дополнительная рис. S2e, f). В совокупности эти результаты показывают, что N-концевых аминокислот 1-361 N-белка SARS-CoV-2 достаточно для его антагонистической активности по отношению к IFN-I. Более того, чтобы локализовать ключевые аминокислотные остатки для функции N-белка, мы выровняли аминокислотные последовательности N-белков SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 (дополнительная рис.S3), а затем построил серию усечений на основе сохранившихся мотивов (дополнительный рисунок S4a). Белок-белковые взаимодействия этих мутантов со STAT1 и STAT2 исследовали с помощью анализа co-IP. Наши данные показали, что удаление аминокислот 319–422 (Flag-N Δ 319–422 ) привело к полной потере взаимодействия между белком N и HA-STAT1/STAT2 (дополнительный рисунок S4b, c), что указывает на что С-концевые 319–422 аминокислоты белка N SARS-CoV-2 необходимы для его связывания со STAT1 и STAT2.

После определения того, что N-белок SARS-CoV-2 обладает активностью, противодействующей передаче сигналов IFN-I, мы попытались выяснить, играет ли он роль в инфекции SARS-CoV-2. С этой целью клетки HepG2, экспрессирующие белок N или пустой вектор, инфицировали SARS-CoV-2 при MOI 0,1, а накопление вирусной РНК в клетках определяли через 24 часа после заражения (hpi). Наши результаты показали, что репликация вирусной РНК была значительно повышена в клетках, инфицированных SARS-CoV-2, при наличии сверхэкспрессии N (рис.1к). Соответственно, уровни мРНК ISG15 также были снижены в клетках, инфицированных SARS-CoV-2, со сверхэкспрессией N (рис. 1k и дополнительная рис. S5). Более того, эктопическая экспрессия N SARS-CoV-2 ингибировала фосфорилирование STAT1 в контексте инфекции SARS-CoV-2 (рис. 1l). В совокупности наши результаты показали, что сверхэкспрессия белка N может эффективно усиливать репликацию SARS-CoV-2 посредством противодействия передаче сигналов IFN-I в инфицированных клетках человека.

Коронавирусный белок N представляет собой многофункциональный вирусный белок, участвующий в таких процессах, как сборка вируса, почкование, репликация РНК и клеточный ответ хозяина 4 .Кроме того, было обнаружено, что N-белки SARS-CoV-2 и SARS-CoV противодействуют противовирусной РНК-интерференции в клетках человека благодаря своей РНК-связывающей активности 5 . Наши результаты демонстрируют, что SARS-CoV-2 N может действовать как мощный антагонист IFN во время вирусной инфекции, и предлагают новый механизм, лежащий в основе этой антагонистической функции IFN (рис. 1m).

Таким образом, наше исследование впервые раскрывает механизм, с помощью которого SARS-CoV-2 избегает ответа IFN, и демонстрирует белок N как антагонист IFN, кодируемый SARS-CoV-2, который может представлять собой многообещающую мишень для противовирусного вмешательства. .Наши результаты расширяют наши знания о взаимодействии вируса и хозяина SARS-CoV-2 и должны помочь лучше понять патогенез COVID-19.

Ссылки

  1. ВОЗ. Коронавирусная болезнь (COVID-19) Еженедельное эпидемиологическое обновление. Отчеты о ситуации с коронавирусной болезнью (COVID-2019). https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200824-weekly-epi-update.pdf?sfvrsn=806986d1_4. (2020).

  2. Платаниас, Л.C. Механизмы передачи сигналов, опосредованной интерфероном типа I и типа II. Нац. Преподобный Иммунол. 5 , 375–386 (2005).

    Артикул КАС Google ученый

  3. Hu, Y. et al. Нуклеокапсид коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома ингибирует выработку интерферона типа I, препятствуя опосредованному TRIM25 убиквитинированию RIG-I. Дж. Вирол. 91 , e02143–16 (2017).

    ПабМед ПабМед Центральный КАС Google ученый

  4. МакБрайд, Р., Zyl, M. & Fielding, B. Нуклеокапсид коронавируса представляет собой многофункциональный белок. Вирусы 6 , 2991–3018 (2014 г.).

    Артикул КАС Google ученый

  5. Mu, J. et al. Нуклеокапсидный белок, кодируемый SARS-CoV-2, действует как вирусный супрессор РНК-интерференции в клетках. Sci China Life Sci. 63 , 1–4 (2020).

    Артикул КАС Google ученый

Скачать ссылки

Благодарности

Мы благодарим Dr.Дин Гао и главный центр Уханьского института вирусологии за техническую помощь, а также д-р Синьвэнь Чен (Ухань, Китай) за любезно предоставленные материалы. Эта работа была поддержана Стратегической программой приоритетных исследований CAS (XDB2

00 до XZ), Национальным крупным проектом по науке и технологиям (2018ZX10101004 до XZ), Национальным фондом естественных наук Китая (31800140 до JM, 81873964 до YQ и 31670161 и 31970169 до X.Z.), Ассоциация содействия инновациям молодежи CAS (2020332 до Y.Q.), стипендию Newton Advanced от Академии медицинских наук Великобритании (NAF005\1002 до XZ), академический фонд Yunde Hou от Национального института контроля и профилактики вирусных заболеваний (от 2019HYDQNJJ10 до JM) и Китайский фонд докторантуры (с 2020T130021ZX по QY, с 2020M672452 по TS).

Информация об авторе

Филиалы

  1. Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии, Центр биобезопасности мега-науки, Китайская академия наук (CAS), Ухань, провинция Хубэй 430071, Китай

    Jingfang Mu, Yaohui Fang Mu, Yaoo002 , Qi Yang, Ting Shu, An Wang, Muhan Huang, Fei Deng, Yang Qiu и Xi Zhou

  2. Объединенная лаборатория инфекционных заболеваний и здоровья, Уханьский институт вирусологии и Уханьская больница Цзиньинтань, CAS, Ухань, Хубэй 430023, Китай

    Jingfang Mu, Ting Shu, Muhan Huang, Fei Deng, Yang Qiu & Xi Zhou

  3. Университет Академии наук Китая, Пекин 100049, Китай

    An Wang & Xi Zhou

    2 Институт микробологии Академия наук Цзянси, Наньчан, Цзянси 330029, Китай

    Лян Цзинь и Си Чжоу

Взносы

Дж.М. провел эксперименты с помощью Ю.Ф., К.Ю., Т.С., А.В., М.Х., Л.Дж. и Ф.Д., Дж.М., Ю.К. и Х.З. проектировал эксперименты. Дж.М., Ю.К. и X.З. интерпретировал результаты и написал рукопись.

Авторы переписки

Переписка с Ян Цю или Си Чжоу.

Декларации этики

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Дополнительная информация

Примечание издателя Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Дополнительная информация

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставьте ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала.Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатки и разрешения

Об этой статье

Процитировать эту статью

Mu, J., Fang, Y., Yang, Q. et al. Белок N SARS-CoV-2 противодействует передаче сигналов интерферона типа I, подавляя фосфорилирование и ядерную транслокацию STAT1 и STAT2. Cell Discov 6, 65 (2020). https://doi.org/10.1038/s41421-020-00208-3

Скачать цитату

Поделиться этой статьей

Любой, с кем вы поделитесь следующей ссылкой, сможет прочитать этот контент:

Получить общую ссылку

Извините, общедоступная ссылка в настоящее время недоступна для этой статьи.

Предоставлено инициативой Springer Nature SharedIt по обмену контентом.

Addgene: pLVX-EF1alpha-SARS-CoV-2-N-2xStrep-IRES-Puro

Эти плазмиды были созданы вашими коллегами.Пожалуйста, подтвердите Главный исследователь, процитируйте статью, в которой были описаны плазмиды, и включите Addgene в материалы и методы ваших будущих публикаций.

  • Для секции материалов и методов :

    pLVX-EF1alpha-SARS-CoV-2-N-2xStrep-IRES-Puro был подарком от Неван Кроган (Плазмида Addgene # 141391; http://n2t.сеть/аддген:141391 ; RRID:Addgene_141391)

    Для вирусных препаратов замените (плазмида Addgene # 141391) в приведенном выше предложении с: (Вирусный препарат Addgene # 141391-LV)

  • Для вашего Каталожные номера Раздел:

    Карта взаимодействия между белками SARS-CoV-2 и человека показывает мишени для лекарств и потенциальное повторное использование лекарств .Гордон Д.Э. и др.. БиоРксив март 2020 г. 10.1101/2020.03.22.002386

Нуклеокапсид SARS-CoV-2 | N-Fc и N-His

Нуклеокапсид SARS-CoV-2 с C-концом His- или Fc-метки


Описание белка



Возможное применение растворимых меченых нуклеокапсидных белков

Нуклеокапсид (N) SARS-CoV-2 (2019-nCoV) — это структурный белок, который играет важную роль в жизненном цикле вируса, включая репликацию, транскрипцию и упаковку генома [1].SARS-CoV-2 N имеет два важных функциональных домена NTD и CTD [1-6]. NTD взаимодействует как с геномом РНК, так и с белками мембраны/матрикса (М) с образованием частиц вириона. Взаимодействие белка N с РНК формирует ядро ​​рибонуклеопротеина вируса, которое упаковано в виде спиральной конформации «бусинки на нитке». CTD обеспечивает синтез РНК за счет связывания комплексов репликации-транскрипции (RTC), олигомеризации множества N-белков через его домен димеризации и включения генома в новый вирион.
N является основным иммуногеном SARS-CoV-2. Действительно, в сыворотке пациентов с COVID-19 сообщалось о повышенных титрах антител IgG и IgM к SARS-CoV-2 N [7-9]. Эти наблюдения делают SARS-CoV-2 N привлекательным инструментом для ранней диагностики [7-9] и стратегий лечения [3].

Nucleocapsid-His и Nucleocapsid-Fc были созданы путем слияния полноразмерного SARS-CoV-2 N [M1-A419] с С-концевой полигистидиновой последовательностью и Fc области IgG01 человека. , соответственно.Следует отметить, что используемая вирусная последовательность SARS-CoV-2 взята из изолята Wuhan-Hu-1 (D614).

Nucleocapsid-His и Nucleocapsid-Fc были получены в клетках CHO и клетках HEK293   соответственно и очищены с помощью аффинной хроматографии ().

Приложения


  • Вакцинационные исследования: использование комбинаций антигенов нуклеокапсидных белков и адъювантов
  • Скрининг антител :  обнаружение антинуклеокапсидных антител в сыворотке пациентов с COVID-19
  • Скрининг ингибиторов: поиск небольших молекул, способных блокировать взаимодействие нуклеокапсида SARS-CoV-2 с комплексами репликации-транскрипции (RTC)

Контроль качества


  • Размер и чистота подтверждены SDS-PAGE
  • Белок подтвержден с помощью ELISA с использованием покрытых антител против нуклеокапсида SARS.

Узнайте больше о инфекционном цикле SARS-CoV-2, иммунных реакциях и потенциальных терапевтических средствах.

Рекомендации

1. Mu, J. et al., 2020. Нуклеокапсидный белок, кодируемый SARS-CoV-2, действует как вирусный супрессор РНК-интерференции в клетках. Sci China Life Sci 63, 1-4.
2. Чанг С. и др., 2006 . Модульная организация нуклеокапсидного белка коронавируса SARS. Дж. Биом. науч. 13:59-72.
3. Крохин О. и др., 2003 . Масс-спектрометрическая характеристика белков вируса SARS.Мол. & Клетка. прот. 2:346-356.
4. Cubuk, J. et al. , 2020. Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 является динамичным, неупорядоченным, и его фазы разделяются с РНК. bioRxiv. дои: 10.1101/2020.06.17.158121.
5. Kang, S. et al., 2020. Кристаллическая структура РНК-связывающего домена нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 выявляет потенциальные уникальные сайты нацеливания лекарств. Acta Pharm Sin B. doi: 10.1016/j.apsb.2020.04.009.
6. Хан М.T. et al., 2020. Нуклеокапсид SARS-CoV-2 и связывание Nsp3: исследование in silico. Арка микробиол. doi: 10.1007/s00203-020-01998-6.
7. Liu, W. et al., 2020. Оценка иммуноферментных анализов на основе нуклеокапсида и шиповидных белков для обнаружения антител против SARS-CoV-2. J Clin Microbiol 58.
8. Guo L. et al. , 2020. Профилирование раннего гуморального ответа для диагностики нового коронавирусного заболевания (COVID-19).Клинические инфекционные заболевания. 71(15):778-785.
9. К. К-В. и др. , 2020. Временные профили вирусной нагрузки в образцах слюны из задней части ротоглотки и ответы сывороточных антител во время инфекции SARS-CoV-2: наблюдательное когортное исследование. Ланцет Инфекционные заболевания. 20(5):565-574.

Вернуться к вершине

Содержимое

Состав Nucleocapsid-His и Nucleocapsid-Fc :

  • 50 мкг лиофилизированного белка
  • 1.5 мл воды без эндотоксинов

Продукт поставляется при комнатной температуре.

Лиофилизированный белок следует хранить при температуре -20 ̊C.

Ресуспендированный белок стабилен до 1 месяца при хранении при 4°С и 1 год при хранении при -20°С.

Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания.

Вернуться к вершине

Уровень на 2 Север 6 Pl. в Вильямсбурге: Продажи, Аренда, Планы этажей

Мы с гордостью представляем вам новый жилой комплекс Level, расположенный в приморском анклаве Вильямсбурга, Бруклин.Мы тщательно спланировали каждую деталь этой уникальной собственности, чтобы вы могли сосредоточиться на праздновании жизни, над созданием которой вы работали.

Мы с гордостью представляем вам новый поселок Level, расположенный в прибрежном анклаве Вильямсбурга, Бруклин. Мы тщательно спланировали каждую деталь этой уникальной собственности, чтобы вы могли сосредоточиться на праздновании жизни, над созданием которой вы работали.
Знаменитый бруклинский район Вильямсбург постоянно развивается и напоминает нам о своей важности на пульсе мирового культурного компаса.Присоединяйтесь к этому процветающему сообществу, чтобы открыть немедленный доступ к некоторым из лучших мест города, где можно купить еду, напитки, магазины и искусство.

В дополнение к потрясающим видам и быстрому доступу к лучшему в Вильямсбурге, Level предлагает ряд превосходных удобств на территории отеля для повышения вашего уровня жизни. Раскройте свой ежедневный потенциал со следующими удобствами.

Членство уровня 9 (при условии ежемесячной платы) включает:

– Крытый/открытый бассейн с потолочным окном, джакузи и паровой баней

– Круглосуточный фитнес-центр с кардиотренажерами, силовыми тренажерами и функциональным оборудованием для фитнеса

– Зал йоги с оборудованием для растяжки и виртуальными фитнес-классами по требованию

– Клубная гостиная с игровыми столами и демонстрационной кухней

– Комната для вечеринок с кухней и медиа

– Меблированная терраса на 9 этаже с камином, грилем и общей гостиной/обеденной зоной

– Мероприятия и мероприятия для участников еженедельно координируются игровой площадкой URBN

.

– Услуги консьержа

Удобства для жителей также включают:

– Меблированный вестибюль с камином и круглосуточным консьержем

– Пакет Valet с химчисткой, возможна уборка

– Хранение велосипедов на территории

– Доступна услуга парковщика (вход за угол, 34 N 7th St)

– Детская игровая комната, стилизованная под лес, со сценой и столами для классной доски

– Бизнес-центр с видеоконференцсвязью и рабочими местами

– Бесплатный wi-fi в местах общего пользования

Дизайн лежит в основе всего в Level.От создания безмятежных палитр в качестве основы для дома вашей мечты до красивых уютных общественных пространств, помогающих вам поддерживать свое тело, разум и дух. Уровень — это баланс. Позвольте нам помочь вам найти ваш и назначить встречу сегодня.

Быстрый анализ на обнаружение антигена SARS-CoV-2 в сравнении с анализом ОТ-ПЦР в реальном времени для лабораторной диагностики COVID-19 в Таиланде | Virology Journal

Молекулярные тесты являются стандартной лабораторной диагностикой для подтверждения инфекции SARS-CoV-2; Анализы RT-PCR для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в клинических образцах широко используются в диагностических лабораториях COVID-19.В Таиланде насчитывалось 183 клинические лаборатории, в том числе наша лаборатория в больнице Сирирадж, которая прошла внешний контроль качества ОТ-ПЦР-тестов Департамента медицинских наук (DMSC) Министерства здравоохранения и была уполномочена лабораторией для диагностики COVID-19 [ 15, 16]. Быстрые иммуноанализы на антигены с чувствительностью и специфичностью, эквивалентными ОТ-ПЦР в реальном времени, помогут ускорить скрининг заболеваний. В этом исследовании коммерчески доступный набор для быстрого обнаружения антигена SARS-CoV-2 (тест Standard Q COVID-19 Ag) сравнивали с анализом RT-PCR (анализ Allplex™ 2019-nCoV) для обнаружения инфекции SARS-CoV-2. .

Чувствительность и специфичность стандартного теста Q COVID-19 Ag для быстрого обнаружения антигена SARS-CoV-2, заявленные производителем (всего n = 202; положительные n = 32; отрицательные n = 170) составили 84,38% (95 % ДИ, 67,21–94,72 %) и 100,00 % (95 % ДИ, 97,85–100 %), соответственно. Чувствительность этого теста оценивали в испытательном центре в Малайзии с использованием 32 ОТ-ПЦР-положительных мазков из носоглотки от пациентов с симптомами. Специфичность этого теста была оценена группой разработчиков SD Biosensor с использованием 170 ОТ-ПЦР-отрицательных образцов.Моноклональное антитело, специфичное к N-антигену SARS-CoV-2, нанесенное на тест Standard Q COVID-19 Ag, было получено из штамма WUHAN-01, который генетически тесно связан со штаммами SARS-CoV-2, обнаруженными в Таиланде [17, 18]. ]. Наши результаты показали более высокую чувствительность (98,33% против 84,38%), но меньшую специфичность (98,73% против 100,00%), чем результаты производителя. Отличие результатов нашего теста от производителя может быть связано с различными факторами, включая партию реагентов набора, качество образца и уровень экстрагированного антигена, а также методы обработки и обработки образцов.Мы уменьшили вязкость образца с помощью стеклянных шариков и встряхивания перед добавлением в экстракционный буфер. Крышка насадки фильтра, входящая в комплект, также минимизировала клейкость образцов. Отрицательный результат теста может быть связан с более низким уровнем извлеченного антигена, чем предел обнаружения теста. Наша партия клинических образцов, как правило, может иметь более высокую вирусную нагрузку (низкое значение Ct), чем у испытательного центра производителя, что повышает вероятность обнаружения антигена в нашем исследовании.

Из 60 ОТ-ПЦР-положительных образцов в нашем исследовании единственным ложноотрицательным результатом был мазок из носоглотки и мазка из горла пациентки с пневмонией, протестированные на антиген SARS-CoV-2 через семь дней после начала заболевания (ОТ-ПЦР- положительный случай №39). Результат ОТ-ПЦР этого образца имел относительно высокие значения Ct: 31,18 для гена E , 39,2 для гена RdRp и 35,54 для гена N , что может объяснить отрицательный результат теста Standard Q COVID-19. Аг тест. Однако тест Standard Q COVID-19 Ag правильно обнаружил антиген SARS-CoV-2 у другой пациентки, у которой также были относительно высокие значения Ct: 33,49 для гена E , 36,94 для гена RdRp и 37,17 для N. ген (случай ОТ-ПЦР-положительный №.23). У этого пациента была инфекция верхних дыхательных путей (URI), и он был протестирован через четыре дня после появления симптомов [см. Дополнительный файл 1]. Вирусная нагрузка SARS-CoV-2 в образцах верхних дыхательных путей была обнаружена на более высоком уровне вскоре после появления симптомов [19]; таким образом, можно предположить более высокую вероятность обнаружения положительного антигена на ранней стадии. Этот набор для обнаружения антигена SARS-CoV-2 может быть рекомендован пациентам в ранние сроки после появления симптомов, когда ожидается более высокая вирусная нагрузка.Как упоминалось выше, на интерпретацию результатов могут влиять некоторые другие факторы, такие как клинические проявления, продолжительность от начала заболевания до лабораторного исследования, тип образцов и способы их сбора и обработки (методы обращения с образцами и обработки). Из 394 ОТ-ПЦР-отрицательных образцов из дооперационных случаев пять мазков из носоглотки и зева дали положительный результат на антиген SARS-CoV-2 с использованием теста Standard Q COVID-19 Ag. Хотя неясно, что вызвало противоречивый результат, мы заметили, что густая и очень вязкая слизь имеет тенденцию давать ложноположительные результаты при тестировании с помощью набора для обнаружения антигена.Для пациентов с отрицательным результатом обнаружения SARS-CoV-2 с помощью ОТ-ПЦР клинические данные (такие как основные заболевания или инфицирование другими патогенами) не включались в исследование. Поэтому нельзя исключать возможность перекрестной реактивности с другими антигенами.

Наши результаты показали более высокую чувствительность экспресс-теста на антиген SARS-CoV-2 (98,33% по стандартному тесту Q COVID-19 Ag), чем другие экспресс-тесты на антиген, о которых сообщалось ранее. Предыдущие исследования сообщали о чувствительности 93,9% (95% ДИ, 86,5–97.4%) с помощью флуоресцентного иммунохроматографического анализа для теста 2019-nCoV Ag (Bioeasy Biotechnology Co., Шэньчжэнь, Китай), 50,0% с помощью COVID-19 Ag Respi-Strip CORIS® и 11,1–45,7% с помощью BIOCREDIT COVID-19 Ag (BioVendor). Исследования и диагностические продукты) [10,11,12]. Положительные и отрицательные прогностические значения (PPV и NPV) анализа не могли быть точно рассчитаны без текущей распространенности COVID-19 среди населения. Однако было пять ложноположительных образцов, протестированных с помощью теста Standard Q COVID-19 Ag.Мы можем оценить, что в районе с низкой распространенностью COVID-19 PPV для этого теста низкий. Гипотетически, при уровне распространенности COVID-19, равном 10%, PPV и NPV стандартного теста Q на COVID-19 Ag будут составлять 89,59% (95% ДИ, 78,27–95,37%) по сравнению с 99,81% (95% ДИ, 98,71–99,97). %). В то время как при уровне распространенности COVID-19 1%, PPV по сравнению с NPV стандартного теста Q COVID-19 Ag будет составлять 43,91% (95% ДИ, 24,66–65,17%) по сравнению с 99,98% (95% ДИ, 99,88–100,00%). ). Таким образом, тест Standard Q COVID-19 Ag может быть полезен в районах с высокой распространенностью.

Преимуществом теста Standard Q COVID-19 Ag в качестве скрининга на COVID-19 является его простая процедура и быстрые результаты с высокой NPV, но его недостатком является низкий PPV в районе с низкой распространенностью. Таким образом, тест на нуклеиновые кислоты (NAT) для обнаружения гена SARS-CoV-2, который является более чувствительным и специфичным, чем этот иммуноанализ с латеральным потоком, по-прежнему является стандартным тестом для диагностики COVID-19. Несмотря на свои ограничения, экспресс-тест на антиген SARS-CoV-2 может помочь всем работникам здравоохранения в своевременном эффективном лечении инфицированных людей, особенно в сельских районах и районах вспышек.Поэтому перед внедрением следует провести проспективное исследование экспресс-теста на антиген SARS-CoV-2 в этих областях.

Границы | Пептиды, полученные из S- и N-белков тяжелого острого респираторного синдрома Коронавируса 2, индуцируют Т-клеточные ответы: доказательство концепции Т-клеточных вакцин

Введение

Возникновение коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), вызванной коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), который генетически связан с SARS-CoV, представляет угрозу для глобального общественного здравоохранения и экономики.В связи с быстрым глобальным распространением SARS-CoV-2 Всемирная организация здравоохранения объявила вспышку COVID-19 пандемией 11 марта 2020 г. (Валенсия, 2020 г.). По состоянию на 22 февраля 2021 года более 111 миллионов человек были инфицированы SARS-CoV-2, а 2,46 миллиона умерли от этой болезни. Поэтому несколько мировых институтов и компаний активизировали разработку вакцин в ответ на пандемию COVID-19.

Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома состоит приблизительно из 30 000 нуклеотидов и кодирует четыре структурных белка, а именно гликопротеин шипа (S), гликопротеин малой оболочки (E), гликопротеин мембраны (M) и белок нуклеокапсида (N) (Huang et al., 2020; Мусавизаде и Гасеми, 2020 г.). Белок S состоит из двух субъединиц, S1 и S2; субъединица S1 связывается с рецепторами клеток-мишеней через свой рецептор-связывающий домен (RBD), тогда как S2 опосредует слияние вирусной мембраны посредством конформационных изменений (Huang et al., 2020). Поскольку белок S отвечает за связывание с клетками-хозяевами, большинство современных вакцин-кандидатов против SARS-CoV-2 основаны на полноразмерном белке S, а также на субъединице S1 и RBD (Krammer, 2020; Yang et al., 2020).

Белки

N обладают высокой иммуногенностью и обильно экспрессируются во многих коронавирусах (Dutta et al., 2020). Было показано, что ДНК-вакцины, кодирующие белок N SARS-CoV, вызывают сильный N-специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей C57BL/6 и значительно снижают титры вируса после антигенного заражения (Kim et al., 2004). Между тем, Буххольц и соавт. (2004) сообщили, что иммунизация N-белком не индуцирует реакции нейтрализующих антител и не обеспечивает защиты от инфекции на модели SARS-CoV у хомяков.Хотя белок N SARS-CoV может вызывать как гуморальный, так и Т-клеточный ответ у людей, необходимы дальнейшие исследования для выяснения его защитных эффектов при разработке вакцины.

Эффективность вакцин в первую очередь зависит от индукции высоких уровней нейтрализующих антител; однако Т-клетки также играют важную роль в элиминации вируса и защите от вирусной инфекции. В частности, цитотоксические CD8 + T-клетки (CTL) непосредственно уничтожают инфицированные вирусом клетки, продуцируя цитотоксические гранулы, такие как перфорин, гранзим B и интерферон-γ (IFN-γ).Кроме того, Т-клетки CD4 + необходимы для создания эффективных клеточных и гуморальных иммунных ответов за счет продукции достаточного количества цитокинов и активации передачи сигналов костимулирования (Swain et al., 2012). Хотя большинство исследований, проведенных по разработке вакцины против SARS-CoV-2, были сосредоточены на выявлении гуморального ответа (Dong et al., 2020), последние данные также подчеркивают важность формирования ответов, опосредованных Т-клетками. Например, Thevarajan et al. (2020) продемонстрировали, что уровни активированных Т-клеток увеличиваются во время элиминации SARS-CoV-2 (Thevarajan et al., 2020). Клональность Т-клеточного рецептора также выше у пациентов с легкими симптомами по сравнению с пациентами с тяжелой формой COVID-19 (Bacher et al., 2020).

Появление вариантов SARS-CoV-2, таких как B.1.1.7 и B.1.351, которые, как было показано, избегают индуцированных вакциной нейтрализующих антител (Fontanet et al., 2021), сместило акцент на Т-клеточные вакцины (Hellerstein , 2020; Ledford, 2021; Tarke et al., 2021). Ранее было обнаружено, что Т-клетки памяти, специфичные для SARS-CoV, реагируют с мембранными белками, и было показано, что белок N сохраняется до 11 лет после заражения у выздоровевших пациентов, тогда как антитела, специфичные для SARS, продемонстрировали ослабление реакции через несколько лет. Нг и др., 2016). Эти результаты позволяют предположить, что индукция антиген-специфических Т-клеточных ответов может быть полезной для разработки успешных вакцин. Однако остается неясным, могут ли одни Т-клеточные ответы оказывать защитное действие против инфекции SARS-CoV-2.

Таким образом, основной целью настоящего исследования является идентификация эпитопов SARS-CoV-2, которые индуцируют Т-клеточный ответ, и оценка защитных эффектов этого ответа. С этой целью было синтезировано 20 пептидов, полученных из наиболее консервативных областей белков SARS-CoV-2S и N, и в их состав были добавлены РНК-адъюванты для повышения иммуногенности Т-клеток in vivo .Кроме того, хомяк, а также мышиные модели с трансгенным (Tg) ангиотензинпревращающим ферментом человека 2 (hACE2) были использованы для определения того, обеспечивает ли Т-клеточный ответ, индуцированный иммунизацией смесью РНК-адъювант + пептид, защиту от инфекции SARS-CoV-2. .

Материалы и методы

Мыши и хомяки

Шестинедельные самки мышей C57BL/6 и золотистые сирийские хомячки были приобретены у Samtako Biokorea (Осан, Республика Корея) или Dae-Han Bio-Link (Чунгбук, Республика Корея), а мыши hACE2 (JAX Stock# 034860 , В6.Cg-Tg(K18-ACE2)2 Prlmn/J/) были приобретены в лаборатории Джексона (Мэн, США).

Животные содержались в Католическом университете Кореи в условиях, свободных от специфических патогенов, и со стандартным световым циклом (12-часовой цикл свет/темнота). Все протоколы экспериментов на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при Католическом университете Кореи (номер утверждения: CUK-IACUC-2020-015, BA-2008-301-071-01), чьи животные полностью аккредитованы Корейская ассоциация лабораторных животных (2018-027, 24 августа 2018 г.).Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу и использованию животных Католического университета Кореи.

Иммунизация

мыши C57BL/6 WT были иммунизированы посредством внутримышечных инъекций (40 мкл) в верхнюю часть бедра дважды с интервалом в 2 недели 20 пептидами SARS-CoV-2 (каждый 10 мкг, всего 200 мкг пептидов), четырьмя пептидами ( ST5, ST7, NT5 и NT6; 20 мкг на пептид, всего 80 мкг) с адъювантом РНК CUK2 или без него (40 мкг) или только с адъювантом РНК CUK2 (40 мкг).

Трансгенным мышам с ангиотензинпревращающим ферментом 2 человека дважды вводили внутримышечно в верхнюю часть бедра либо адъювант РНК CUK2, либо два пептида (ST5 и ST7; 20 мкг на пептид, всего 40 мкг), либо адъювант РНК CUK2 и четыре пептида (ST5, ST7). , NT5 и NT6; 20 мкг на пептид, всего 80 мкг) с интервалом в 2 недели.

Золотистых сирийских хомячков иммунизировали три раза с интервалом в 2 недели пептидами SARS-CoV-2 (по 15 мкг каждого при общем количестве пептидов 300 мкг) и РНК-адъювантом CUK2 (60 мкг).

Вызов SARS-CoV-2

Мышей, трансгенных по человеческому ангиотензинпревращающему ферменту 2, заражали SARS-CoV-2 через 1 неделю после последней иммунизации. После внутрибрюшинного введения анестезии с применением тилетамина + золазепама (Золетил 50; 30 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) каждую мышь инфицировали интраназально 1,0×10 4 бляшкообразующих единиц на 50 мкл SARS-CoV- 2, и были определены показатели выживаемости. Все зараженные мыши содержались в условиях BSL-3 в Корейском центре фенотипирования мышей Сеульского национального университета.Все экспериментальные процедуры на мышах проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу и использованию животных Сеульского национального университета (номер утверждения: BA-2008-301-071-01).

золотистых сирийских хомячка были заражены SARS-CoV-2 через 1 неделю после последней иммунизации. После внутрибрюшинного введения анестезии с применением тилетамина + золазепама (Золетил 50; 30 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) каждого хомяка интраназально инфицировали 5,0×10 5 бляшкообразующих единиц 50 мкл -1 SARS-CoV. -2.Все зараженные хомяки содержались в помещениях BSL-3 Корейского научно-исследовательского института зоонозов Национального университета Чонбук (JBNU). Все экспериментальные процедуры на хомяках проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу и использованию животных JBNU (номер утверждения: JBNU2020-0155).

Культура вируса и титрование

Вирус коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (NCCP 43326), полученный из Национальной коллекции культур патогенов (NCCP) Национального института здравоохранения, был размножен в клетках Vero E6 (CRL-1586; Корейская коллекция типовых культур) в DMEM (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением пенициллина-стрептомицина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Life Technologies) в соответствии с ранее описанными методами (Kim et al., 2020). После определения цитопатического эффекта SAR-CoV-2 на 3-й день титры вируса измеряли с использованием средней инфекционной дозы культуры тканей TCID 50 и анализа бляшек.

Прогнозирование и синтез Т-клеточных пептидов (эпитопов) для SARS-CoV-2

Последовательности пептидов эпитопов Т-клеток SARS-CoV-2 были предсказаны с использованием алгоритмов in silico и методов, описанных в предыдущих исследованиях SARS-CoV. Штамм SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (MN7) был выбран в соответствии с информацией, представленной в различных обзорах и банке данных NCBI.Последовательности поверхностного гликопротеина (S; инвентарный номер QHD43416.1) и нуклеокапсидного фосфопротеина (N; инвентарный номер QHD43423.2) были получены из базы данных NCBI GenBank с номером доступа в формате FASTA. Эпитопы коронавирусных Т-клеток были предсказаны с использованием онлайн-сервера прогнозирования эпитопов Immune Epitope Database (IEDB) и инструментов прогнозирования Т-клеточных эпитопов NetMHCPan (PMID: 28978689). Эпитопы, выбранные из сервера прогнозирования, имели самый низкий процентильный ранг и значения IC 50 в соответствии с методом CONSENSUS.

Используются следующие пептидные последовательности: S 277–297 (ASTEKSN), S 1132–1161 (KCYGVSPTKL), S 1309–1341 (NSNNLDSKVGG), S 1342–1373 NY, 1411-1449 9052 1411-1449 (Eiyqagstpcngv), S 1459-1503 1459-1503 (NCYFPLQSYGFQPTN), S 1603-1659 (KNKCVNFNFNGLTGTGVLT), S 1924-1968 1924-1968 (VFQTRAGCLIGAEHV), S 1969-2016 (NNSYECDIPIGAGICA), N 40-72 (Ritfggpsdst), N 148-192 (Aswftaltqhgkedl), N 247-300 (QIGYRRATRIRIRGHDGK), N 328-372 (FyylgTgPealpyg), N 385-444 (GIIWVVEATATALNNTPTPKDHIGT), N 652-681 9052 652-681 (ALALLLLDRL), N 715-762 715-762 (QQQQGQTVTKKSAAAEA), N 934-963 (Saffmmsrig), N 988-1032 (WLTYTGAIKLDDKDP), N 1048-1092 (VillnkhidayKTFP) и N 1219–1242 (LQQSMSSA).

Все последовательности были синтезированы с чистотой 95% или выше (Peptron, Тэджон, Республика Корея). Каждый пептид был синтезирован с использованием стандартного протокола твердофазного синтеза пептидов. Защитную группу Fmoc удаляли встряхиванием в 20% пиперидине в N,N-диметилформамиде (ДМФ) в течение 10 минут (дважды) и проводили связывание с использованием аминокислоты Fmoc (6 экв.), HOBT (6 экв.), HBTU (6 экв.) и DIPEA (12 экв.) в ДМФА в течение 2 часов. На каждом этапе смолу промывали с использованием ДМФ и метанола по два раза каждый.Когда желаемая последовательность была завершена, неочищенный пептид отщепляли от смолы, используя смесь TFA/EDT/тиоанизола/TIS/DW (объем 90/2,5/2,5/2,5/2,5) в течение 2 часов. Раствор осаждали холодным эфиром, центрифугированием получали палетки, собирали и затем сушили на воздухе. Неочищенный пептид растворяли в деионизированной воде (DW) и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке с обращенной фазой C18. Элюирование проводили линейным градиентом вода-ацетонитрил [10~75% (об./об.) ацетонитрила], содержащим 0.1% (об./об.) трифторуксусной кислоты. Чистую часть пептида собирали и лиофилизировали.

In vitro Транскрипция и очистка РНК-адъюванта

ДНК-платформа была разработана с использованием внутреннего сайта посадки рибосомы 5′-UTR и 3′-UTR межгенной области вируса энцефаломиокардита с 50 аденилатами на 3′-конце (Ko et al., 2019) и названа CUK2. Матрицы ДНК линеаризовали с использованием Not I. . Транскрипцию in vitro проводили с использованием набора EZ T7 High Yield in vitro Transcription Kit (Enzynomics, Тэджон, Республика Корея) в соответствии с инструкциями производителя.Реакции транскрипции содержали 3 мкг матричной ДНК, вырезанной с использованием Not I, 5x буфера для транскрипции, 10x MgCl 2 , DTT (10 мМ конечный), rNTP (5 мМ конечный), 20x раствор энхансера, РНК-полимераза T7 и вода, не содержащая нуклеазы. Смеси инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Для удаления ДНК к смесям добавляли свободную от РНКазы ДНКазу I (Promega, Висконсин, США) в количестве 1 ед/мкг матричной ДНК и инкубировали 30 мин при 37°С. Для очистки РНК РНК осаждали добавлением 7,5 М раствора LiCl 0.5 томов и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После центрифугирования в течение 15 мин при 13000 g и 4°С надосадочную жидкость удаляли, добавляли 600 мкл 70% этанола и центрифугировали 15 мин при 13000 g и 4°С для промывки. Супернатант удаляли, а осадок после высушивания на воздухе ресуспендировали в воде, не содержащей РНКазы. Чистоту и концентрацию ДНК и РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, США).

Количественное определение вируса

Количество вирусной РНК в шести долях легких было определено с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR).Образцы легких гомогенизировали с использованием гомогенизатора Precellys (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Франция) в 10-кратном (w/v) стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS; pH 7,4). Вирусную РНК экстрагировали из супернатантов образцов мазков и тканей с использованием мини-набора QIAamp Viral RNA (Qiagen, Джермантаун, Мэриленд, США). Одноэтапную ОТ-ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием набора Ezplex® SARS-CoV-2G (SMLgenetree, Южная Корея) в соответствии с инструкциями производителя. Количество копий вирусной РНК в образцах тканей рассчитывали с использованием стандартного контроля панели Accuplex™ SARS-CoV-2 Verification (Seracare, Милфорд, Массачусетс, США).

Связанный с ферментом иммуноанализ

Связанный с ферментом иммуноспот (ELISPOT) использовали для выявления Т-клеток, продуцирующих IFN-γ и интерлейкин-4 (IL-4), в соответствии с инструкциями производителя (Mabtech, Стокгольм, Швеция; R&D Systems. Миннеаполис, Миннесота, США). Состояния). Планшеты из поливинилиденфторида активировали обработкой 70% этанолом на лунку в течение 2 мин. После пятикратного промывания планшета PBS добавляли покрывающие антитела (15 мкг/мл) и образцы инкубировали в течение ночи при 4°C.После пятикратного промывания планшета PBS добавляли среду RPMI, содержащую 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и образцы инкубировали в течение 30 минут. После удаления среды спленоциты от иммунизированных мышей, собранные в конце экспериментов, добавляли в количестве 5×10 5 клеток/лунку и стимулировали 5 мкг на лунку пептидных антигенов в течение 48 часов при 37°С. Затем планшеты пять раз промывали PBS, добавляли меченные биотином антитела против IFN-γ или IL-4 и инкубировали в течение 2 ч при 18–23°C.После промывки планшеты обрабатывали разбавленным стрептавидином-APL (1:1000) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После пятикратной промывки PBS добавляли стоп-раствор (BCIP/NBT) и проявляли до появления отчетливых пятен. Реакцию останавливали промывкой водопроводной водой. Планшеты сушили, пятна подсчитывали с помощью считывателя ELISpot и анализировали с помощью программного обеспечения для считывания AID Elispot 7.0 (AID GmbH, Strassberg, Germany).

Проточная цитометрия

Для поверхностного окрашивания спленоциты и изолированные иммунные клетки из дренирующих лимфатических узлов окрашивали следующими антителами в течение 30 минут при 4°C: Fixable Viability Dye eFluor™ 520 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США), анти-CD4 ( клон ГК1.5; eBioscience), анти-CD8 (клон 53–6.7; Invitrogen), анти-CD44 (клон IM7; eBioscience; BD Pharmingen), анти-CD62L (клон MEL-14; eBioscience) и анти-CD103 (клон 2E7; eBioscience) . Затем клетки фиксировали в 4% параформальдегиде и анализировали с использованием проточного цитометра Cytek Aurora (Cytek Biosciences, Фремонт, Калифорния, США).

Для окрашивания фактора транскрипции Ki-67 окрашенные поверхности спленоцитов и изолированные иммунные клетки из дренирующих лимфатических узлов пермеабилизировали с использованием набора буферов для окрашивания Foxp3/транскрипционного фактора (eBioscience) и окрашивали Ki-67 (клон SolA15; eBioscience) в течение 30 минут. при 18 – 25°С.Затем клетки анализировали с использованием проточного цитометра Cytek Aurora.

Для окрашивания внутриклеточных цитокинов изолированные спленоциты повторно стимулировали 5 мкг на лунку смеси пептидов SARS-CoV-2 при 37°C. Брефельдин А (Golgi-Plug; BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) добавляли через 4 часа, и после инкубации в течение еще 12 часов спленоциты обрабатывали анти-CD16/CD32 (eBioscience) в течение 30 минут при 4°C, а затем окрашивали следующими антителами в течение 30 минут при 4°C: Fixable Viability Dye eFluor™ 520, анти-CD4 (клон GK1.5) и анти-CD8 (клон 53–6.7). Окрашенные клетки пермеабилизировали с помощью набора Cytofix/Cytoperm (eBioscience), а затем окрашивали антителами против IFN-γ (клон XMG1.2; eBioscience), против фактора некроза опухоли-α (TNF-α; клон MP6-XT22; eBioscience). ), антитела против гранзима В (QA16A02; BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) и антитела против перфорина (S16009A; BioLegend). Клетки анализировали с использованием проточного цитометра Cytek Aurora.

Цитокиновый иммуноферментный анализ

Для измерения уровней цитокинов в супернатантах культур спленоцитов спленоциты мышей собирали и выделяли из иммунизированных мышей.Спленоциты высевали с плотностью 5×10 5 клеток на лунку (96-луночный планшет). Для повторной стимуляции спленоцитов в культуральную среду добавляли по 5 мкг на лунку смеси пептидов SARS-CoV-2 на 4 дня, после чего среду оценивали с помощью ИФА для определения концентраций IFN-γ, IL-2, IL. -6 и TNF-α (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя. Далее 96-луночные планшеты покрывали захватывающими антителами IFN-γ, IL-2, IL-6 и TNF-α и инкубировали в течение ночи при 4°C.После инкубации планшеты трижды промывали 0,05% Tween-20 в PBS и блокировали 1x разбавителем на 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшетов добавляли 50 мкл культуральных супернатантов и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты снова промывали, обрабатывали разведенными детектирующими антителами IFN-γ, IL-2, IL-6 и TNF-α и инкубировали в течение 1 часа. После промывания планшетов добавляли разбавленный авидин-HRP или стрептавидин-HRP и образцы инкубировали в течение 30 минут. После пятикратной промывки добавляли 100 мкл 1x раствора ТМВ и инкубировали в течение 15 минут, а для прекращения реакции использовали 2N H 2 SO 4 .Значения оптической плотности измеряли при 450 нм с использованием многорежимного считывателя микропланшетов GloMax Explorer (Promega, WI, США). Концентрации цитокинов рассчитывали по стандартным кривым, и полученные результаты представлены в виде IFN-γ, IL-2, IL-6 и TNF-α пг на мл супернатанта.

Анализ in vivo CTL

мыши C57BL/6 были иммунизированы смесью пептидов или каждым из четырех пептидов (ST5, ST7, NT5 и NT6), или пептидами S1 (ST5+ST7), или пептидами N (NT5+NT6) вместе с РНК-адъювантом CUK2, дважды в интервал 2 недели.Были получены донорные спленоциты от неиммунизированных мышей, затем их отмыли и разделили на две группы в зависимости от клеточных популяций. Одну группу обработали 10 мкг/мл пептида SARS-CoV-2 в течение 30 минут при 37°C, отмыли с помощью PBS и пометили высокой концентрацией (2,5 мкМ) сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE). Другая контрольная группа была помечена низкой концентрацией CFSE (0,25 мкМ). Клетки (5×10 6 ) каждой популяции смешивали с 200 мл PBS и внутривенно вводили каждой мыши, иммунизированной пептидом + адъювантом РНК CUK2, через 7 дней после второй иммунизации.Специфическую цитотоксичность in vivo определяли путем сбора селезенки мышей-реципиентов через 24 часа после инъекции для определения количества клеток в каждой популяции клеток-мишеней с помощью проточной цитометрии . Соотношение между процентом неимпульсных и импульсных пептидов (CFSE низкий /CFSE высокий ) количественно оценивали для определения цитотоксичности. Дополнительные контроли включали наивных и иммунизированных PBS мышей-реципиентов. Процент специфического лизиса в контроле по сравнению симмунизированных мышей рассчитывали по следующему уравнению:

% Специфический лизис = 100-[100×(%CFSE высокая иммунизированная мышь/%CFSE низкая иммунизированная мышь)/(%CFSE высокая наивная мышь/%CFSE низкая наивная мышь)].

Гистологический анализ

Образцы срезов ткани печени, полученные от мышей, погружали в 10% (об./об.) нейтральный забуференный формалин, обезвоживали, заливали парафином и делали срезы толщиной 3 мкм для проведения гистологического анализа.Репрезентативные гистопатологические изображения были получены и оценены с использованием Aperio ImageScope (версия 12.3; Leica Biosystems, Wetzlar, Germany). Тяжесть гистопатологических изменений определяли по пятибалльной шкале следующим образом: 0 — отклонений не обнаружено; 1, минимальный; 2, легкая; 3, умеренный; 4 — средней степени тяжести; и 5, тяжелая, и распространение было зафиксировано как очаговое, многоочаговое и диффузное. Рекрутирование воспалительных клеток в печень (кровеносный сосуд или область печеночной паренхимы) и морфологические изменения (синусоидальная дилатация, некроз и баллонная дегенерация) ткани оценивали после выполнения окрашивания гематоксилином и эозином и визуализации под световым микроскопом.

Статистический анализ

Все значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. Для оценки существенных различий между группами лечения использовался однофакторный дисперсионный анализ; если с помощью критерия Левена выявлялись значительные отклонения от однородности дисперсии, то выполнялся непараметрический Н-критерий Крускала-Уоллиса. Критерий Стьюдента t использовали для оценки значимых различий между двумя группами; если с помощью критерия Левена выявлялись значительные отклонения от однородности дисперсии, то выполнялся непараметрический U-критерий Манна–Уитни.Статистический анализ проводился с использованием SPSS для Windows (выпуск 14.0K, IBM, Armonk, NY) или GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Различия считались достоверными при значениях p ≤0,05.

Результаты

In silico Прогнозирование и выбор пептидов SARS-CoV-2

Для разработки пептидной вакцины против SARS-CoV-2 Т- и В-клеточные эпитопы пептидов SARS-CoV-2 были предсказаны с использованием алгоритмов in silico и IEDB с эталонным вирусным штаммом Wuhan-Hu-1 (MN7) как описано в разделе «Материалы и методы».Вкратце, были выбраны 9 последовательностей S-пептида с консервативной областью S1 в SARS-CoV-1 (AAP 41037.1) и 11 последовательностей N-пептида с консервативной областью в белке N SARS-CoV-1 (AAP 41047.1) (рис. 1A, B). . Мы также проанализировали гомологию каждого пептида с другими коронавирусами и вариантами SARS-CoV-2 (α, β, γ и δ). Как показано на рисунке 1C, 20 пептидов продемонстрировали наибольшую гомологию белка S1 и N с SARS-CoV (36,4–100%), и большинство из этих выбранных пептидов также имеют гомологию с другими сезонными коронавирусами, но в меньшей степени по сравнению с таковыми у SARS-CoV. CoV (рис. 1С).Пятнадцать пептидов, кроме SB2, ST2, SBT1, ST3 и ST6, показали 100% гомологию с вариантами SARS-CoV-2 (α, β, γ и δ; рисунок 1D). Поскольку мы стремились проверить иммуногенность этих пептидов на мышах, было предсказано, что 20 пептидов будут связываться с H-2K b , H-2D d , H-2D b , H-2K d [главный комплекс гистосовместимости ( MHC) class I] и H-2IE d и H-2-IA b . Все пептиды были синтезированы, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рисунок 1 .Обзор 20 пептидов, полученных из белков S и N коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2). (A) Список из 20 пептидных последовательностей. (B) Расположение 20 сконструированных пептидов в белках S и N. (C,D) Процент гомологии каждого пептида с другими коронавирусами [варианты SARS-CoV, OC43, NL63, HKU1, 229E и SARS-CoV-2 (α, β, γ и δ)].

Индукция Т-клеточного ответа после иммунизации смесью адъювантов из 20 пептидов и РНК, производных от SARS-CoV-2

В отличие от квасцов, в качестве адъюванта использовалась РНК, полученная из внутреннего сайта посадки рибосомы в 5′-нетранслируемой области вируса энцефаломиокардита (обозначенного CUK2), поскольку ранее было установлено, что пептиды или белки, приготовленные с этим РНК-адъювантом, могут индуцировать антиген- специфическая активация Т-клеток (Nam et al., 2020). Для оценки индукции Т-клеточного иммунного ответа in vivo мышей C57BL/6 иммунизировали внутримышечно смесью из 20 пептидов с адъювантом РНК CUK2 или без него (рис. 2А, В). Как показано на рисунках 2C,D, иммунизация пептидами CUK2 значительно увеличивала долю CD44 hi CD62L low эффекторной памяти CD4 + и CD8 + Т-клеток (клетки T EM ) в селезенке и CD8. + клеток T EM в дренирующих лимфатических узлах по сравнению с неиммунизированной группой (G1).Хотя только пептиды (G3) или адъювант РНК CUK2 (G2), по-видимому, увеличивали долю Т-клеток эффекторного типа памяти в дренирующих лимфатических узлах, разница была незначительной (рис. 2D). Кроме того, экспрессия Ki-67, маркера недавно пролиферирующих клеток, по-видимому, увеличивается в клетках CD8 + T EM мышей, иммунизированных смесью адъювант РНК CUK2 + пептид, без статистической значимости (G4; рис. 2E). .

Рисунок 2 . Анализ активации Т-клеток после иммунизации смесью 20 пептидов SARS-CoV-2 и адъювантом РНК CUK2. (A) Обзор экспериментальных групп. (B) Схема иммунизации мышей. Мышей C57BL/6 иммунизировали дважды с двухнедельными интервалами смесью 20 пептидов SARS-CoV-2 + адъювант РНК CUK2 и умерщвляли через 1 неделю после последней иммунизации. (C,D) Процентное содержание эффекторной памяти типа CD4+ и CD8 + Т-клеток (CD62L низкая CD44 высокая ) в селезенке и лимфатических узлах анализировали с помощью проточной цитометрии. (E) Популяцию Ki-67+ в эффекторных Т-клетках памяти CD8 + в селезенке оценивали с помощью проточной цитометрии. (F) Количество 20 пептид-специфических клеток, продуцирующих интерферон-γ (IFN-γ) и интерлейкин (IL)-4, в спленоцитах измеряли с помощью иммуноферментного анализа (ELISPOT; n = 5 мышей) . (G) IFN-γ- и фактор некроза опухоли-α (TNF-α)-продуцирующие CD8 + и CD4 + Т-клетки в селезенке исследовали с помощью проточной цитометрии. (H) Гранзим B- и перфорин-продуцирующие CD8 + Т-клетки в селезенке анализировали с использованием проточной цитометрии.Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение. * р ≤0,05; ** р ≤0,01; и *** р ≤0,005.

Чтобы оценить, влияет ли смесь РНК-адъювант + 20-пептид на продукцию цитокинов Т-клетками, а не на фенотип и субпопуляции Т-клеток, количество клеток, продуцирующих цитокины, определяли количественно с помощью ELISPOT и проточной цитометрии. В селезенке наблюдалось заметное увеличение количества IFN-γ- и IL-4-продуцирующих клеток, а также увеличение процентного содержания IFN-γ- и TNF-α-продуцирующих CD4 + и CD8 + . Т-клетки в смеси мышей, иммунизированных адъювантом РНК CUK2 + пептидом (G4; фиг. 2F, G).Мы наблюдали аналогичное увеличение IFN-γ- и TNF-α-продуцирующих CD4 + и CD8 + Т-клеток у мышей Balb/c, иммунизированных смесью РНК адъюванта CUK2 + пептида (данные не показаны). Точно так же супернатанты культуры спленоцитов из группы, иммунизированной смесью РНК-адъювант + пептид (G4), показали значительно повышенные уровни IFN-γ, TNF-α, IL-2 и IL-6 (дополнительная фигура S1). Только смесь пептидов или РНК-адъювант не вызывали значительного увеличения уровней IFN-γ или TNF-α. Хотя продукция IL-6 увеличилась в группе, иммунизированной пептидом (G3), степень увеличения была выше в группе, иммунизированной смесью РНК-адъювант + пептид (G4; дополнительная фигура S1).Для дальнейшей оценки цитотоксической активности Т-клеток была оценена продукция гранзима В CD8 + Т-клетками, и было обнаружено, что она значительно увеличилась в группе, иммунизированной смесью РНК-адъювант + пептид (G4; фигура 2H). Таким образом, результаты показывают, что смесь пептидов может индуцировать Т-клеточные иммунные ответы in vivo в сочетании с РНК-адъювантом.

Идентификация сильных Т-клеточных эпитопов SARS-CoV-2 у мышей

Затем, чтобы идентифицировать наиболее активные Т-клеточные эпитопы среди 20 пептидов, спленоциты иммунизированных или неиммунизированных мышей стимулировали каждым пептидом, и с помощью ELISTPOT определяли количество клеток, продуцирующих IFN-γ (рис. 3).Было обнаружено, что пептиды ST5 и ST7 субъединицы S1, а также пептиды NT5 и NT6 белка N сильно индуцируют продукцию IFN-γ (рис. 3). Эти выбранные ST5, ST7, NT5 и NT6 были почти идентичны SARS-CoV и показали 100% гомологию с вариантами SARS-CoV-2 (α, β, γ и δ; рисунок 1D). Поэтому последующие эксперименты были проведены с четырьмя пептидами ST5, ST7, NT5 и NT6.

Рисунок 3 . Анализ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, после стимуляции каждым отдельным пептидом.Мышей C57BL/6 дважды иммунизировали с 2-недельными интервалами смесью 20 пептидов SARS-CoV-2 + адъювант РНК CUK2 (ниже). Нулевая группа включала неиммунизированных мышей C57BL/6 в качестве отрицательного контроля (верхний). Каждую пептид-специфическую Т-клетки, продуцирующие IFN-γ, в селезенке определяли количественно с использованием ELISPOT. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение. * р ≤0,05; ** р ≤0,01; и **** р ≤0,001.

Пептиды ST5, ST7, NT5 и NT6 индуцируют ответы Т-клеток CD8

+

Для определения подходящей дозы выбранных пептидов мышей иммунизировали 0.1, 1, 10 и 20 мкг каждого пептида (ST5, ST7, NT5 и NT6) в присутствии адъюванта РНК CUK2 (рис. 4A, B). Значительное увеличение уровней экспрессии Ki-67 в эффекторных Т-клетках CD8 + , но не в Т-клетках CD4 + , наблюдалось только при концентрации пептида 20 мкг (G5; рис. 4C, D). Примечательно, что в отличие от смеси из 20 пептидов эти четыре пептида не индуцировали CD4 + Т-клеточных ответов (рис. 4D, F). Кроме того, хотя смесь РНК-адъювант CUK2 + четыре пептида не увеличивала количество ИЛ-4-продуцирующих клеток, она увеличивала процент IFN-γ- и TNF-α-продуцирующих CD8 + Т-клеток в зависимости от дозы. способом (рис. 4E,G).Таким образом, результаты показывают, что ST5, ST7, NT5 и NT6 представляют собой эпитопы CD8 + Т-клеток.

Рисунок 4 . Анализ активации Т-клеток после иммунизации четырьмя пептидами SARS-CoV-2 и адъювантом РНК CUK2. (A) Обзор экспериментальных групп. (B) График иммунизации мышей. Мышей C57BL/6 дважды иммунизировали с двухнедельными интервалами смесью четырех пептидов SARS-CoV-2 + адъювант РНК CUK2 и умерщвляли через 1 неделю после последней иммунизации. (C) Процентные проценты CD62L LOW CD44 Высокий T EM Клетки в Spreenic CD8 + T-клетки и Ki67-положительные клетки в CD8 + CD62L LOW CD44 Высокий T EM CD8 + Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. (d) Процент CD62L низкий CD44 Высокий T EM Клетки в Splenic CD4 + T Клетки и Ki67-положительные клетки в CD8 + CD62L низкий CD44 Высокий T EM CD4 + Т-клеток анализировали с использованием проточной цитометрии. (E) Количество четырех клеток, продуцирующих IFN-γ и IL-4, специфичных к смеси пептидов, определяли количественно с использованием ELISPOT. (F) IFN-γ- и TNF-α-продуцирующие клетки в CD4 + Т-клеток в ответ на четыре смеси пептидов исследовали с помощью проточной цитометрии. (G) IFN-γ- и TNF-α-продуцирующие клетки в CD8 + Т-клеток в ответ на четыре смеси пептидов исследовали с помощью проточной цитометрии. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение. * р ≤0,05; ** р ≤0.01; *** р ≤0,005; и **** р ≤0,001.

ST5, ST7, NT5 и NT6 индуцируют

in vivo ответы ЦТЛ

Учитывая, что четыре выбранных пептида повышали экспрессию CD8 + Т-клетками перфорина и гранзима B (рис. 4G), которые играют решающую роль в прямой элиминации инфицированных вирусом или раковых клеток, впоследствии было определено, индуцируют ли эти пептиды также ЦТЛ. ответы in vivo с использованием анализа ЦТЛ.Мышей иммунизировали каждым из выбранных пептидов, как показано на фиг. 5А, В. Мыши, иммунизированные каждым из четырех пептидов (ST5, ST7, NT5 или NT6) + адъювант РНК CUK2, демонстрировали пептид-специфические литические ответы с процентом специфического лизиса в диапазоне от 30 до 40% (фиг. 5C). Мыши, иммунизированные смесью из 20 пептидов + адъювант РНК CUK2, также показали пептид-специфический лизис; однако лизис происходил в меньшей степени, чем в группах, иммунизированных одним пептидом (дополнительные рисунки S2A-C).Более того, иммунизация двумя пептидами S (ST5 и ST7) + адъювантом РНК CUK2 или двумя пептидами N (NT5 и NT6) + адъювантом РНК CUK2 индуцировала ответ in vivo CTL (дополнительная фигура S2D).

Рисунок 5 . Тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2 пептид-специфические ответы ЦТЛ in vivo . (A) Обзор экспериментальных групп. (B) График иммунизации мышей. Мышей C57BL/6 иммунизировали дважды с 2-недельными интервалами каждой смесью пептидов SARS-CoV-2 + адъювант РНК CUK2 и умерщвляли через 1 неделю после последней иммунизации.Был использован сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE), флуоресцентный краситель для окрашивания клеток. (C) Количественное определение специфических литических реакций по данным проточного цитометрического анализа. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение. * р ≤0,05; ** р ≤0,01; и *** р ≤0,005.

Оценка защитного действия пептидов SARS-CoV-2

in vivo

Учитывая, что РНК-адъювант и смесь пептидов индуцируют ответы Т-клеток, было определено, обеспечивают ли индуцируемые пептидами ответы Т-клеток защиту от заражения SARS-CoV-2.Золотистых сирийских хомяков иммунизировали три раза с использованием 15 мкг каждого из 20 пептидов (всего 300 мкг) и 60 мкг РНК-адъюванта CUK2 с интервалом в 2 недели, а затем через 1 неделю после проведения последней иммунизации заражали SARS-CoV-2 (рис. 6А, Б). Хотя это и не является статистически значимым, количество копий РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) и белка N уменьшилось в группе, иммунизированной смесью адъюванта РНК CUK2 и пептида, по сравнению с контрольной группой через 4 дня после заражения (фиг. 6C).

Рисунок 6 . Иммунизация пептидами SARS-CoV-2 частично снижала титр вируса у хомяков и обеспечивала защиту мышей hACE2 от инфекции SARS-CoV-2. (A) Обзор экспериментальных групп. (B) График иммунизации и заражения вирусом. (C) ПЦР в реальном времени вирусной геномной РНК в легких. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. (D) Обзор экспериментальных групп. (E) График иммунизации и заражения вирусом. (F) Показатели выживаемости мышей hACE2 Tg после заражения SARS-CoV-2. (G) Патологические оценки легких через 7 дней после заражения. (H) Репрезентативные гистологические изображения срезов легочной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином. А, легочная артерия; B, бронх или бронхи; и V, легочная вена. Стрелки указывают на воспалительные клетки (нейтрофилы и лимфоциты), стрелки указывают на кровоизлияния, а крестики указывают на слизь. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение.

Затем оценивали защитный эффект выбранных пептидов на мышиной модели hACE2 Tg.Мышей hACE2 Tg дважды иммунизировали адъювантом РНК CUK2 и двумя пептидами (ST5 и ST7; 20 мкг на пептид, всего 40 мкг) или четырьмя пептидами (ST5, ST7, NT5 и NT6; 20 мкг на пептид, всего 80 мкг) через 2 недели. интервал, а затем заражение SARS-CoV-2 через 1 неделю после проведения последней иммунизации (рис. 6D, E). Обе группы показали улучшенную выживаемость (80%) через 7 дней после заражения по сравнению с таковой у контрольных мышей (40%; рис. 6F), но не было значительным. Кроме того, патологические оценки (воспаление, отек и расширение капилляров), по-видимому, были снижены в группе адъюванта РНК + четыре пептида по сравнению с контролем без статистической значимости; в частности, у четырех из пяти мышей наблюдалось уменьшение воспалительных поражений наряду с изменениями характера отечной реакции вокруг дыхательных путей по сравнению с контрольной группой (рис. 6G, H).

Прогноз связывания пептидов, полученных из SARS-CoV-2, с антигеном лейкоцитов человека

Чтобы определить, взаимодействуют ли эти 20 выбранных пептидов с MHC класса I и индуцируют ли CTL-ответы у людей, была определена аффинность связывания между человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA) класса I и 20 пептидами, которые в значительной степени способствовали бы иммуногенному эффекту CTL. предсказано с использованием NetMHCPan (PMID: 28978689). Учитывая аффинность связывания пептидов, в качестве эпитопов были выбраны пептиды с низким процентильным рангом (≤10) (данные не представлены).Было предсказано, что все четыре пептида связываются с несколькими человеческими HLA класса I, такими как HLA-A*02, A*024, A*11, C*03 и C*07, как показано на фигуре 7A, и предсказано связывание NT6. к донорам HLA-A*02-типа с высоким сродством. Таким образом, мы экспериментально определили, может ли NT6 индуцировать ответы Т-клеток CD8 + у доноров HLA-A*02-типа. Т-клетки CD8 + совместно культивировали и подвергали размножению с аутологичными дендритными клетками (DC), импульсно обработанными NT6 или без него. Уровень IFN-γ, продуцируемый Т-клетками CD8 + , совместно культивируемыми с DC с импульсом NT6, был в пять раз выше, чем уровень, продуцируемый Т-клетками CD8 + , культивируемыми без NT6 (фиг. 7B).Таким образом, этот результат указывает на то, что NT6, нагруженный HLA-A*02, может активировать CD8 + Т-клеток (фиг. 7B).

Рисунок 7 . Прогнозирование связывания пептидов, полученных из SARS-CoV-2, с HLA человека и ответом in vitro CTL в PBMC человека. (A) Предполагается, что HLA человека связывается с выбранными четырьмя пептидами. Красный цвет указывает на то, что HLA, по прогнозам, связывается в основном с каждым пептидом. (B) Обнаружение пептид-специфических ЦТЛ NT6 в человеческих Т-клетках HLA-A*02 посредством индукции in vitro с использованием пептид-специфического анализа ЦТЛ.

Профиль безопасности смеси РНК-адъювант + пептид

Чтобы определить, безопасна ли смесь адъювант РНК CUK2 + пептид для использования, было проведено тестирование токсичности in vivo (дополнительные рисунки S3A, B). Мышей иммунизировали дважды по 200 мкг каждого из 20 пептидов SARS-CoV-2 (всего 4 мг) с адъювантом РНК CUK2 или без него или только с адъювантом РНК CUK2 с интервалом в 2 недели и умерщвляли через 1 неделю после второй иммунизации. Хотя уровни аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке несколько повысились в группах, получавших адъювант РНК CUK2 + пептиды и только пептиды, соответственно, они оставались в пределах нормы.Все другие показатели токсичности, такие как общий билирубин, креатинин и альбумин, существенно не изменились и не отклонились от нормальных диапазонов (дополнительная фигура S3C). Более того, образцы ткани печени, полученные от иммунизированных мышей, не показали каких-либо заметных морфологических изменений из-за токсичности (дополнительные рисунки S5D, E).

Обсуждение

Традиционно анализы с использованием нейтрализующих антител считались золотым стандартом для оценки эффективности вакцин (Kwong et al., 2011; Классе, 2014). Однако ответ Т-клеток остается важным. В связи с появлением вариантов SARS-CoV-2, которые устойчивы к нейтрализующим антителам, вырабатываемым предшествующей инфекцией или вакцинацией (Weisblum et al., 2020; Fontanet et al., 2021), возрастает интерес к разработке вакцин, индуцирующих T клеточные ответы. Помимо расширения и улучшения эффекторной функции иммунных клеток, Т-клетки также элиминируют инфицированные вирусом клетки (Pennock et al., 2013). У пациентов с COVID-19 повышенная клональность расширенных CD8 + Т-клеток наблюдалась у пациентов с легкой формой COVID-19, чем у пациентов с тяжелой формой COVID-19 (Chen and John Wherry, 2020; Sekine et al., 2020). Кроме того, у пациентов с тяжелой формой COVID-19 наблюдается не только более низкое количество цитотоксических CD8 + Т-клеток, но и сниженная способность продуцировать IFN-γ и перфорин (Mazzoni et al., 2020). Эти результаты предполагают связь Т-клеток с клиренсом инфицированных вирусом клеток. Напротив, сообщалось, что иммунизация вакциной, которая избирательно индуцирует CD4 + Т-клеточный ответ, приводит к увеличению частоты воспалений и смертности после инфицирования вирусом хронического лимфоцитарного хориоменингита (Penaloza-MacMaster et al., 2015). Кроме того, иммунопатология, опосредованная CD8 + T-клетками, наблюдается в моделях инфекций респираторно-синцитиального вируса и вируса гриппа (Schmidt et al., 2018). Поэтому установление баланса между иммунной защитой и иммунной патологией Т-клетками имеет решающее значение для разработки успешных вакцин.

В этом исследовании были отобраны 20 пептидов, связанных с белками S и N, которые являются высококонсервативными среди SARS-CoV и SARS-CoV-2, и были оценены на их иммуногенность Т-клеток.Чтобы повысить низкую иммуногенность пептидов, CUK2 использовали в качестве адъюванта РНК, поскольку мы уже показали, что он индуцирует Th2-ответы даже у старых мышей. Хотя Т-клеточные эпитопы SARS-CoV-2 были предсказаны в нескольких исследованиях с помощью анализа in silico (Dagur and Dhakar, 2020; Kiyotani et al., 2020; Wang et al., 2020), они не были подтверждены в естественных условиях . В настоящем исследовании было обнаружено, что пептиды ST5, ST7, NT5 и NT6 индуцируют опосредованные Т-клетками ответы in vivo .У мышей, иммунизированных смесью этих пептидов и адъюванта РНК CUK2, наблюдались повышенные уровни Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, и повышенная частота пролиферации клеток T EM . Кроме того, было определено, что аминокислотные последовательности пептидов ST5, ST7, NT5 и NT6 являются потенциальными эпитопами для цитотоксических CD8 + Т-клеток, поскольку мыши, иммунизированные этими пептидами, и адъювант РНК CUK2 показали устойчивые ответы CTL in vivo . Однако in vivo эффективность выбранных пептидов может различаться у людей из-за различий, присущих молекулам MHC человека и мыши.Тем не менее, было подтверждено, что пептиды NT6 распознаются Т-клетками CD8 + от доноров HLA-A*02 (данные не показаны), что требует дальнейшего скрининга пептидов с Т-клетками человека для применения в клинических испытаниях.

Хотя у хомяков и мышей hACE2 Tg, иммунизированных смесью РНК-адъювант + пептид, наблюдалось небольшое снижение вирусных титров и вызванных вирусом поражений легких после заражения SARS-CoV-2, это не было статистически значимым. Это указывает на то, что индуцированные пептидами ответы Т-клеток полезны для элиминации SARS-CoV-2, но недостаточны для полной элиминации вируса.Следовательно, использование других адъювантов или стратегий, оптимизирующих иммунные ответы, индуцированные пептидами, может обеспечить более эффективную защиту. Кроме того, наши результаты показали, что ответы Т-клеток, индуцированные пептидами S и N, не полностью ослабляли патологию, вызванную SARS-CoV-2, что указывает на то, что стимуляция выработки нейтрализующих антител является ключевым требованием для получения полной защиты от инфекции SARS-CoV-2. . Тем не менее, мы идентифицировали связанные с белками S и N пептиды SARS-CoV-2, которые были способны индуцировать ответы Т-клеток in vivo , и представили доказательство концепции разработки Т-клеточных пептидных вакцин против SARS-CoV-2. .Основываясь на этих результатах, в настоящее время разрабатывается вакцина против SARS-CoV-2, состоящая из белков и пептидов, полученных из SARS-CoV-2, с целью максимизировать как гуморальный, так и Т-клеточный ответ.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью/дополнительный материал, дальнейшие запросы можно направлять соответствующему автору.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Католического университета Кореи.

Вклад авторов

J-HN задумал и руководил исследованием, разработал эксперименты и отредактировал рукопись. Y-SL, S-HH, H-JP, H-YL, J-YH, SK, JP, K-SC, JS, S-IP, S-ML, K-AH и J-WY выполнили сбор данных. S-HH, Y-SL и H-JP оказали помощь в составлении рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Работа

поддержана Исследовательскими центрами Кореи по контролю и профилактике заболеваний (номер гранта 2020-ER5303-00), Министерством безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств в 2020 году (номер гранта 20172MFDS290), Католическим университетом Кореи, Исследовательский фонд, 2021 г. , Проект фенотипирования мышей в Корее (номер гранта 2020M3A9I2109027) Национального исследовательского фонда (NRF), финансируемый Министерством науки и ИКТ, и Программа развития био- и медицинских технологий (номер гранта NRF-2021M3E5E3080558) Национального исследовательского фонда (NRF) финансируется Министерством науки и ИКТ и частично поддерживается программой Brain Korea 21 Plus.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.732450/full#supplementary-material

.

Сноски

Ссылки

Бахер П., Розати Э., Эссер Д., Мартини Г. Р., Саггау К., Шимински Э. и др. (2020). Реакция Т-клеток CD4+ с низкой авидностью на SARS-CoV-2 у не подвергавшихся воздействию людей и у людей с тяжелой формой COVID-19. Иммунитет 53, 1258–1271.е1255. doi: 10.1016/j.immuni.2020.11.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Buchholz, U.J., Bukreyev, A., Yang, L., Lamirande, E.W., Murphy, B.R., Subbarao, K., et al. (2004). Вклад структурных белков коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома в протективный иммунитет. Проц. Натл. акад. науч. США 101:9804. doi: 10.1073/pnas.0403492101

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дагур, Х.и Дакар, С. (2020). Дизайн вакцины на основе эпитопов против белка оболочки нового коронавируса SARS-CoV-2. EJMO 4, 201–208. doi: 10.14744/ejmo.2020.01978

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Донг Ю., Дай Т., Вэй Ю., Чжан Л., Чжэн М. и Чжоу Ф. (2020). Систематический обзор вакцин-кандидатов против SARS-CoV-2. Сигнальный преобразователь. Цель. тер. 5:237. doi: 10.1038/s41392-020-00352-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Датта, Н.К., Мазумдар К. и Горди Дж. Т. (2020). Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2: цель для разработки вакцины. Дж. Вирол. 94, e00647–e00620. doi: 10.1128/ОВИ.00647-20

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фонтанет, А., Отран, Б., Лина, Б., Киени, М.П., ​​Карим, С.С.А., и Шридхар, Д. (2021). Варианты SARS-CoV-2 и прекращение пандемии COVID-19. Ланцет 397, 952–954. doi: 10.1016/s0140-6736(21)00370-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хеллерштейн, М.(2020). Какова роль антител по сравнению с прочным, высококачественным Т-клеточным ответом в защитном иммунитете против SARS-CoV-2? Вакцина Х 6:100076. doi: 10.1016/j.jvacx.2020.100076

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хуанг, Ю., Ян, К., Сюй, X.-Ф., Сюй, В., и Лю, С.-В. (2020). Структурные и функциональные свойства шиповидного белка SARS-CoV-2: потенциальная разработка антивирусного препарата для COVID-19. Акта Фармакол. Грех. 41, 1141–1149.doi: 10.1038/s41401-020-0485-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Kim, J.-M., Chung, Y.-S., Jo, H.J., Lee, N.-J., Kim, M.S., Woo, S.H., et al. (2020). Выявление коронавируса, выделенного от пациента в Корее с COVID-19. Осонг. Общественное здравоохранение Res. Перспектива. 11, 3–7. doi: 10.24171/j.phrp.2020.11.1.02

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ким, Т. В., Ли, Дж. Х., Хунг, К.-Ф., Пэн, С., Roden, R., Wang, M.-C., et al. (2004). Создание и характеристика ДНК-вакцин, нацеленных на нуклеокапсидный белок коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома. Дж. Вирол. 78, 4638–4645. doi: 10.1128/ОВИ.78.9.4638-4645.2004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Киётани К., Тойошима Ю., Немото К. и Накамура Ю. (2020). Биоинформатическое предсказание потенциальных Т-клеточных эпитопов для SARS-Cov-2. Дж. Гум. Жене. 65, 569–575.doi: 10.1038/s10038-020-0771-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ко, Х.Л., Пак, Х.-Дж., Ким, Дж., Ким, Х., Юн, Х., и Нам, Дж.-Х. (2019). Разработка платформы экспрессии РНК, контролируемой сайтами посадки вирусных внутренних рибосом. J. Microbiol. Биотехнолог. 29, 127–140. doi: 10.4014/jmb.1811.11019

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Квонг, П. Д., Маскола, Дж. Р., и Набель, Г. Дж. (2011).Рациональный дизайн вакцин для получения широко нейтрализующих антител к ВИЧ-1. Гавань Колд Спринг. Перспектива. Мед. 1:а007278. doi: 10.1101/cshperspect.a007278

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Mazzoni, A., Salvati, L., Maggi, L., Capone, M., Vanni, A., Spinicci, M., et al. (2020). Нарушенная цитотоксичность иммунных клеток при тяжелом течении COVID-19 зависит от IL-6. Дж. Клин. Инвестировать. 130, 4694–4703. дои: 10.1172/JCI138554

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мусавизаде Л.и Гасеми, С. (2020). Генотип и фенотип COVID-19: их роль в патогенезе. J. Microbiol. Иммунол. Заразить. 54, 159–163. doi: 10.1016/j.jmii.2020.03.022

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нам, Дж. Х., Хонг, С. Х., Ли, Ю. С., и Парк, Х. Дж. (2020). Вакцинная композиция для профилактики или лечения заболевания SARS-CoV-2 . Заявка на патент Кореи. Патент №: 10–2020-0155583.

Академия Google

Нг, О.В., Чиа А., Тан А.Т., Джади Р.С., Леонг Х.Н., Бертолетти А. и соавт. (2016). Реакция Т-клеток памяти на коронавирус SARS сохраняется до 11 лет после заражения. Вакцина 34, 2008–2014 гг. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.02.063

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Penaloza-MacMaster, P., Barber, D.L., Wherry, E.J., Provine, N.M., Teigler, J.E., Parenteau, L., et al. (2015). Вызванные вакциной Т-клетки CD4 индуцируют иммунопатологию после хронической инфекции LCMV. Наука 347, 278–282. doi: 10.1126/science.aaa2148

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пеннок, Н. Д., Уайт, Дж. Т., Кросс, Э. У., Чейни, Э. Э., Тамбурини, Б. А., и Кедл, Р. М. (2013). Реакция Т-клеток: наивная память и все, что между ними. Доп. Физиол. Образовательный 37, 273–283. doi: 10.1152/advan.00066.2013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шмидт, М. Е., Кнудсон, С. Дж., Hartwig, S.M., Pewe, L.L., Meyerholz, D.K., Langlois, R.A., et al. (2018). Т-клетки памяти CD8 опосредуют тяжелую иммунопатологию после инфекции респираторно-синцитиального вируса. PLoS Патог. 14:e1006810. doi: 10.1371/journal.ppat.1006810

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Секин, Т., Перес-Потти, А., Ривера-Баллестерос, О., Стролин, К., Горин, Дж. Б., Олссон, А., и соавт. (2020). Надежный Т-клеточный иммунитет у выздоравливающих лиц с бессимптомным или легким течением COVID-19. Сотовый 183, 158–168.e114. doi: 10.1016/j.cell.2020.08.017

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тарке, А., Сидни, Дж., Кидд, С.К., Дэн, Дж.М., Рамирес, С.И., Ю, Э.Д., и соавт. (2021). Всесторонний анализ иммунодоминантности Т-клеток и иммунопревалентности эпитопов SARS-CoV-2 в случаях COVID-19. Cell Rep. Med. 2:100204. doi: 10.1016/j.xcrm.2021.100204

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тевараджан, И., Nguyen, T.H.O., Koutsakos, M., Druce, J., Caly, L., van de Sandt, C.E., et al. (2020). Широта сопутствующих иммунных реакций до выздоровления пациента: отчет о нетяжелом течении COVID-19. Нац. Мед. 26, 453–455. doi: 10.1038/s41591-020-0819-2

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, Д., Май, Дж., Чжоу, В., Ю, В., Чжан, Ю., Ван, Н., и др. (2020). Иммуноинформационный анализ Т- и В-клеточных эпитопов для разработки вакцины против SARS-CoV-2. Вакцина 8:355. doi: 10.3390/vaccines8030355

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Weisblum, Y., Schmidt, F., Zhang, F., DaSilva, J., Poston, D., Lorenzi, J.C., et al. (2020). Ускользание от нейтрализующих антител с помощью вариантов шиповидного белка SARS-CoV-2. eLife 9:e61312. doi: 10.7554/eLife.61312

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, Дж., Ван, В., Чен, З., Лу, С., Ян, Ф., Би, З., и другие. (2020). Вакцина, нацеленная на RBD белка S SARS-CoV-2, индуцирует защитный иммунитет. Природа 586, 572–577. doi: 10.1038/s41586-020-2599-8

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Электрохимическая фиксация N2 в Nh4 в условиях окружающей среды: наностержень Mo2N как высокоэффективный и селективный катализатор

Весьма привлекательной, но все еще ключевой задачей является разработка электрокатализаторов с высоким содержанием земли для эффективного электросинтеза NH 3 посредством реакции восстановления N 2 (NRR).В этом сообщении мы сообщаем о разработке наностержня Mo 2 N в качестве высокоэффективного и селективного электрокатализатора NRR для фиксации искусственного N 2 в кислых электролитах в условиях окружающей среды. В 0,1 М HCl этот катализатор достиг высокой фарадеевской эффективности 4,5% с выходом NH 3 78,4 мкг ч -1 мг кат. −1 при −0,3 В vs. является обратимым водородным электродом, таким образом, превосходя большинство известных электрокатализаторов NRR в условиях окружающей среды, а некоторые – в суровых условиях. Расчеты с помощью теории функционала плотности показали, что свободный энергетический барьер потенциально определяющей стадии NRR на MoO 2 резко снижается после азотирования.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.