34 нк: НК РФ Статья 430. Размер страховых взносов, уплачиваемых плательщиками, не производящими выплат и иных вознаграждений физическим лицам / КонсультантПлюс

alexxlab | 26.04.1984 | 0 | Разное

Содержание

НК РФ глава 34 Страховые взносы

Комментарии к главе 34 Налогового кодекса РФ — Страховые взносы

До 01.01.2017 года страховые взносы принадлежали, а именно начислялись и уплачивались в Пенсионном фонде РФ, далее согласно НК РФ, страховые взносы следует относить к полномочиям ФНС. Данное изменения регламентируется принятым Федеральным законом № 243-ФЗ от 03.07.2016 г. Как объясняют чиновники, этот переход поспособствует улучшению в части контроля как начисления страховых взносов, а также порядок уплаты в ПФР, ОМС и ФСС.

Застрахованные же физические лица, также как и прежде, будут все свои исчисления учитывать на личных лицевых счетах, которые ранее созданы в ПФР и не повлияют на начисления пенсий и пособий граждан РФ(N 03-04-05/21124от 13.04.2016 письма Минфина РФ)

База для исчисления страховых взносов и плательщики в 2017 году согласно НК РФ

Тут ничего не поменялось с прошлых периодов, как и прежде, остаются согласно Главы 34 статьи 419-420 НК РФ все организации, ИП, физические лица которые не относятся к индивидуальными предпринимателям, а также лица занимающиеся частной практикой (адвокат, нотариус, медиатор), которые производят выплаты или вознаграждения любому физическому лицу, согласно любых трудовых взаимоотношений или же в рамках гражданско-правовых договоров на выполнение работ и оказание услуг, договора в части авторских услуг, а также подлежат рассмотрению и договора отчуждений исключительного права, лицензирования. В случае, если плательщики принадлежат к нескольким категориям, указанным выше, то уплата обязательных страховых взносов и исчисление соответственно, происходит по каждому виду деятельности.

Базой для обложения обязательными страховыми взносами подлежат, в том числе выплаты в натуральном выражении, предварительно оценив величину, согласно рыночной стоимости, о чем гласит статься НК РФ 105.3.

Период и сроки предоставления отчетности по страховым взносам в 2017 и 2018 году

Период для исчисления и уплаты страховых взносов признается 1 квартал, полугодие, 9 месяцев и год.

Сдача деклараций расчетов по страховым взносам по срокам в 2017 и 2018 году в ИФНС :

Вид отчетности, Плательщики, Разъяснения и нормыЗа какой период представляетсяСрок представления в ИФНС
Расчет по страховым взносам (как на бумаге, так и в электронном виде) Плательщики страховых взносов, производящие выплаты и иные вознаграждения физическим лицам. ФЗ N 125 от 24.07.1998 ст. 3 Порядок заполнения расчета по страховым взносам (Приказ от 10.10.2016 N ММВ-7-11/551)За I квартал 2017 г.Не позднее 02.05.2017 г.
За I полугодие 2017 г.Не позднее 31.07.2017 г.
За 9 месяцев 2017 г.Не позднее 30.10.2017 г.
За 2017 г.Не позднее 30.01.2018г.
За I квартал 2018 г.Не позднее 03.05.2018 г.
За I полугодие 2018 г.Не позднее 30.07.2018 г.
За 9 месяцев 2018 г.Не позднее 30.10.2018 г

Статья 34. Полномочия таможенных органов и обязанности их должностных лиц в области налогообложения и сборов

1. Таможенные органы пользуются правами и несут обязанности налоговых органов по взиманию налогов при перемещении товаров через таможенную границу Таможенного союза в соответствии с таможенным законодательством Таможенного союза и законодательством Российской Федерации о таможенном деле, настоящим Кодексом, иными федеральными законами о налогах, а также иными федеральными законами.

2. Должностные лица таможенных органов несут обязанности, предусмотренные статьей 33 настоящего Кодекса, а также другие обязанности в соответствии с таможенным законодательством Таможенного союза и законодательством Российской Федерации о таможенном деле.

3. Утратил силу. – Федеральный закон от 29.07.2004 N 95-ФЗ.

Комментарий к ст. 34 НК РФ

1. Таможенные органы составляют единую федеральную централизованную систему.

Единая федеральная централизованная система таможенных органов включает в себя:

– Федеральную таможенную службу (ФТС).

Федеральная таможенная служба является федеральным органом исполнительной власти, осуществляющим в соответствии с законодательством Российской Федерации функции по контролю и надзору в области таможенного дела, а также функции агента валютного контроля и специальные функции по борьбе с контрабандой, иными преступлениями и административными правонарушениями.

ФТС находится в ведении Министерства экономического развития и торговли Российской Федерации.

ФТС является юридическим лицом, имеет печать с изображением Государственного герба Российской Федерации и со своим наименованием, иные печати, штампы и бланки установленного образца, а также счета, открываемые в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Федеральная таможенная служба имеет геральдический знак – эмблему, флаг и вымпел, утверждаемые в установленном порядке;

– ее территориальные органы (региональные таможенные управления, таможни и таможенные посты ФТС и т.п.).

Региональные таможенные управления, таможни и таможенные посты действуют на основании общих или индивидуальных положений, утверждаемых федеральной службой, уполномоченной в области таможенного дела, по согласованию с федеральным министерством, уполномоченным в области таможенного дела. Таможенные посты могут не обладать статусом юридического лица.

Федеральная таможенная служба осуществляет свою деятельность непосредственно, через таможенные органы и представительства Службы за рубежом во взаимодействии с другими федеральными органами исполнительной власти, органами исполнительной власти субъектов Российской Федерации, органами местного самоуправления, Центральным банком Российской Федерации, общественными объединениями и иными организациями.

Таможенные органы пользуются правами и несут обязанности налоговых органов по взиманию налогов при перемещении товаров через таможенную границу Российской Федерации в соответствии с таможенным законодательством Российской Федерации, настоящим Кодексом, иными федеральными законами о налогах, а также иными федеральными законами.

В соответствии со статьей 11 Таможенного кодекса РФ товаром признается любое перемещаемое через таможенную границу движимое имущество, а также перемещаемые через таможенную границу отнесенные к недвижимым вещам транспортные средства.

Таможенные органы пользуются правами и несут обязанности налоговых органов лишь в той мере, в какой это связано со взиманием налогов при перемещении товаров через таможенную границу РФ.

Органы государственной власти субъектов Российской Федерации, органы местного самоуправления, общественные объединения не могут вмешиваться в деятельность таможенных органов при осуществлении ими своих функций.

2. Должностные лица таможенных органов несут обязанности, предусмотренные статьей 33 настоящего Кодекса, а также другие дополнительные обязанности в соответствии с таможенным законодательством Российской Федерации.

Федеральную таможенную службу возглавляет руководитель, назначаемый на должность и освобождаемый от должности Правительством Российской Федерации по представлению министра экономического развития и торговли Российской Федерации.

Руководитель Федеральной таможенной службы несет персональную ответственность за осуществление возложенных на Службу полномочий.

Руководитель Федеральной таможенной службы имеет заместителей, назначаемых на должность и освобождаемых от должности министром экономического развития и торговли Российской Федерации по представлению руководителя Службы.

Количество заместителей руководителя Федеральной таможенной службы устанавливается Правительством Российской Федерации.

Также к должностным лицам таможенным органов относятся государственный советник таможенной службы I – III ранга, советник таможенной службы I – III ранга, инспектор таможенный службы I – III ранга и др.

Должностные лица таможенных органов несут обязанности, предусмотренные не только статьей 33 настоящего Кодекса, но и таможенным законодательством РФ, в частности:

– взимают таможенные пошлины, налоги и иные таможенные платежи;

– ведут борьбу с контрабандой, нарушениями таможенных правил;

– осуществляют таможенный контроль и таможенное оформление и т.п.

Судебная практика по статье 34 НК РФ

Определение Конституционного Суда РФ от 29.05.2019 N 1440-О

1. Гражданин А.И. Красников оспаривает конституционность Федерального закона от 24 июля 2009 года N 212-ФЗ “О страховых взносах в Пенсионный фонд Российской Федерации, Фонд социального страхования Российской Федерации, Федеральный фонд обязательного медицинского страхования” (утратил силу с 1 января 2017 года в связи с принятием Федерального закона от 3 июля 2016 года N 250-ФЗ), а также статей 34, 45, 46, 47, 69, 149, 419, 425, 430 и 432 Налогового кодекса Российской Федерации.


Апелляционное определение Апелляционной коллегии Верховного Суда РФ от 18.01.2018 N АПЛ17-494

Минфин России дает письменные разъяснения налоговым органам, налогоплательщикам, ответственному участнику консолидированной группы налогоплательщиков, плательщикам сборов, плательщикам страховых взносов и налоговым агентам по вопросам применения законодательства Российской Федерации о налогах и сборах в пределах своей компетенции в течение двух месяцев со дня поступления соответствующего запроса. При этом по решению руководителя (заместителя руководителя) соответствующего финансового органа указанный срок может быть продлен, но не более чем на один месяц (пункты 1 и 3 статьи 34 НК РФ).


Права налогоплательщиков НК ст.21 и ст.34.2

Налоговый кодекс РФ Статья 21. Права налогоплательщиков (плательщиков сборов)

 

1. Налогоплательщики имеют право:

1) получать по месту своего учета от налоговых органов бесплатную информацию (в том числе в письменной форме) о действующих налогах и сборах, законодательстве о налогах и сборах и принятых в соответствии с ним нормативных правовых актах, порядке исчисления и уплаты налогов и сборов, правах и обязанностях налогоплательщиков, полномочиях налоговых органов и их должностных лиц, а также получать формы налоговых деклараций (расчетов) и разъяснения о порядке их заполнения;

А так же смотри:  Регламент организации работы с налогоплательщиками, плательщиками сборов, страховых взносов на обязательное пенсионное страхование и налоговыми агентами, утвержденный приказом ФНС России от 9 сентября 2005 г. N САЭ-3-01/444

2) получать от Министерства финансов Российской Федерации письменные разъяснения по вопросам применения законодательства Российской Федерации о налогах и сборах, от финансовых органов субъектов Российской Федерации и муниципальных образований – по вопросам применения соответственно законодательства субъектов Российской Федерации о налогах и сборах и нормативных правовых актов муниципальных образований о местных налогах и сборах;

3) использовать налоговые льготы при наличии оснований и в порядке, установленном законодательством о налогах и сборах;

4) получать отсрочку, рассрочку или инвестиционный налоговый кредит в порядке и на условиях, установленных настоящим Кодексом;

5) на своевременный зачет или возврат сумм излишне уплаченных либо излишне взысканных налогов, пени, штрафов;

5.1) на осуществление совместной с налоговыми органами сверки расчетов по налогам, сборам, пеням и штрафам, а также на получение акта совместной сверки расчетов по налогам, сборам, пеням и штрафам;

6) представлять свои интересы в отношениях, регулируемых законодательством о налогах и сборах, лично либо через своего представителя;

7) представлять налоговым органам и их должностным лицам пояснения по исчислению и уплате налогов, а также по актам проведенных налоговых проверок;

8) присутствовать при проведении выездной налоговой проверки;

9) получать копии акта налоговой проверки и решений налоговых органов, а также налоговые уведомления и требования об уплате налогов;

10) требовать от должностных лиц налоговых органов и иных уполномоченных органов соблюдения законодательства о налогах и сборах при совершении ими действий в отношении налогоплательщиков;

11) не выполнять неправомерные акты и требования налоговых органов, иных уполномоченных органов и их должностных лиц, не соответствующие настоящему Кодексу или иным федеральным законам;

12) обжаловать в установленном порядке акты налоговых органов, иных уполномоченных органов и действия (бездействие) их должностных лиц;

13) на соблюдение и сохранение налоговой тайны;

14) на возмещение в полном объеме убытков, причиненных незаконными актами налоговых органов или незаконными действиями (бездействием) их должностных лиц;

15) на участие в процессе рассмотрения материалов налоговой проверки или иных актов налоговых органов в случаях, предусмотренных настоящим Кодексом.

2. Налогоплательщики имеют также иные права, установленные настоящим Кодексом и другими актами законодательства о налогах и сборах.

3. Плательщики сборов имеют те же права, что и налогоплательщики.

4. Любой из участников договора инвестиционного товарищества имеет право обжаловать в установленном порядке акты налоговых органов и действия (бездействие) их должностных лиц.

 

Статья 34.2. Полномочия финансовых органов в области налогов и сборов

 

1. Министерство финансов Российской Федерации дает письменные разъяснения налоговым органам, налогоплательщикам, ответственному участнику консолидированной группы налогоплательщиков, плательщикам сборов и налоговым агентам по вопросам применения законодательства Российской Федерации о налогах и сборах.

2. Финансовые органы субъектов Российской Федерации и муниципальных образований дают письменные разъяснения налогоплательщикам и налоговым агентам по вопросам применения соответственно законодательства субъектов Российской Федерации о налогах и сборах и нормативных правовых актов муниципальных образований о местных налогах и сборах.

3. Министерство финансов Российской Федерации, финансовые органы субъектов Российской Федерации и муниципальных образований дают письменные разъяснения в пределах своей компетенции в течение двух месяцев со дня поступления соответствующего запроса. По решению руководителя (заместителя руководителя) соответствующего финансового органа указанный срок может быть продлен, но не более чем на один месяц.

ПАО «НК «Роснефть» – Смоленскнефтепродукт», Смоленская область

Общая информация:

На рынке нефтепродуктов Смоленской области ПАО «НК «Роснефть» представлена предприятием нефтепродуктообеспечения ПАО «НК «Роснефть»-Смоленскнефтепродукт». Общество образовано и работает на рынке с 1958 г.

Общество осуществляет реализацию моторных топлив в розницу через собственную сеть АЗК и мелкооптовым потребителям с нефтебаз. В настоящее время нефтебазовое хозяйство Общества состоит из двух нефтебаз:

  • Вяземская нефтебаза

Адрес: 215119, Смоленская обл., г. Вязьма, ул. Песочная, д. 11

График работы: Понедельник – Пятница с 08-00 до 19-00

Суббота – Воскресение с 8-00 до 13-00

  • Смоленская нефтебаза

Адрес: 215012, Смоленская обл., Смоленский р-он, п. Талашкино

График работы: круглосуточно

Суббота – Воскресение с 8-00 до 13-00

Номер телефона: (4812) 38-28-33, группа оптовых продаж: (4812) 38-34-22

Номер факса: (4812) 32-56-35

  • Ярцевская нефтебаза

Адрес: 215801, Смоленская обл., г. Ярцево, ул. Прохорова, д. 17

График работы: ежедневно с 08-00 до 20-00

В автопарк ПАО «НК «Роснефть»-Смоленскнефтепродукт» входит около 27 единицы техники.

Номер телефона: (4812) 38-28-33, группа оптовых продаж: (4812) 38-34-22

Номер факса: (4812) 32-56-35

Реализация нефтепродуктов с нефтебаз:

Для реализации моторного топлива мелкооптовым потребителям Общество использует следующие механизмы продаж:

  •  Реализация с нефтебаз по типовому договору поставки.

В случае технической возможности ПАО «НК «Роснефть»-Смоленскнефтепродукт» может предложить дополнительную услугу доставки моторного топлива до пункта слива покупателя.

Направить заявку на заключение договора можно по адресу [email protected]

Дополнительную консультацию по вопросам поставки моторного топлива Вы можете получить у наших специалистов в регионе по тел.: (4812) 38-34-22.

Претензию по качеству нефтепродуктов Вы можете направить на Горячую линию Компании по тел. 8 800 200 10 70.

Адреса и платежные реквизиты

Полное наименование: Публичное акционерное общество “НК “Роснефть”-Смоленскнефтепродукт”

Сокращенное наименование: ПАО “НК “Роснефть”-Смоленскнефтепродукт”

ИНН: 6730017336

КПП: 673101001

Юр. адрес: 214014, г. Смоленск, ул. Володарского, д. 3

Адрес для корреспонденции: 214014, г. Смоленск, ул. Володарского, д. 3

р/с: 40702810207000000001 в Банк “ВБРР” (АО)

к/с: 30101810900000000880

БИК: 044525880

Контактный телефон: 8 (4812) 38-28-33, (4812) 32-56-35 (факс)

Для обращений и официальной корреспонденции: [email protected]

Генеральный директор: Завьялов Олег Анатольевич

Заместитель генерального директора по оптовым продажам и логистике: Коржаков Игорь Иванович.

Пресс-центр – Новости – Новости Законодательного Собрания

На 34-м очередном заседании Законодательного Собрания Ростовской области депутаты направили Обращение «К Государственной Думе Федерального Собрания Российской Федерации и Правительству Российской Федерации по вопросу освобождения от уплаты налога на доходы физических лиц при продаже жилого помещения лиц, которые приобрели долю в таком жилом помещении в силу требований закона «О дополнительных мерах государственной поддержки семей, имеющих детей».

Депутаты донского парламента обращают внимание федеральных органов власти на один момент в сфере налогообложения, который касается семей с детьми, купившими жилье в ипотеку с участием средств материнского капитала.

Федеральным законодательством предусмотрено, что в подобных случаях общая долевая собственность, в которую включаются все члены семьи, в том числе и дети, оформляется в течение шести месяцев после выплаты ипотеки. Средний срок ипотечного кредита в России – почти двадцать лет, поэтому с момента фактического приобретения жилья и до его оформления в общую долевую собственность проходит значительное время, а дети могут стать уже взрослыми.

За это время у семьи может появиться необходимость изменить место жительства либо снова улучшить жилищные условия, для чего приобретенное ранее жилье необходимо продать.

Однако согласно Налоговому кодексу РФ минимальный предельный срок владения объектом недвижимого имущества, чтобы можно было его продать без уплаты налога, составляет 5 лет, а в определенных случаях (например, недвижимость получена по наследству или в дар от близкого родственника, приватизирована или является единственным жильем) – 3 года.

Таким образом, при продаже жилья сразу после погашения ипотеки и оформления общей долевой собственности на него у детей возникает обязанность уплатить налог, поскольку для них срок владения жильем начал исчисляться только с момента оформления доли. Однако фактически они проживали все это время в продаваемом жилище с родителями с момента приобретения квартиры.

То есть исключительно в силу формальных причин при необходимости срочной продажи квартиры, приобретенной с использованием средств материнского капитала, сразу после погашения ипотеки дети должны фактически вернуть часть материнского капитала обратно государству.

С точки зрения депутатов донского парламента это является несправедливым, поэтому предлагается внести изменения в Налоговый кодекс РФ и освободить от уплаты налога на доходы физических лиц при продаже жилого помещения тех, кто приобрел в нем долю в силу требований федерального закона о материнском капитале. 

СПАРК — Проверка контрагента, узнать сведения об организации по ИНН, анализ рынка в системе СПАРК-Интерфакс

1 Москва 134,15 81 790 650,20 33,32 %
2 Санкт-Петербург 91,82 21 966 175,41 8,95 %
3 Московская область 91,34 17 507 467,77 7,13 %
4 Тюменская область 141,29 10 731 908,63 4,37 %
5 Краснодарский край 63,93 6 982 851,96 2,84 %
6 Свердловская область 55,70 6 544 378,94 2,67 %
7 Республика Татарстан 57,01 5 912 056,28 2,41 %
8 Нижегородская область 66,63 5 108 443,77 2,08 %
9 Красноярский край 75,79 4 602 145,74 1,87 %
10 Самарская область 51,39 4 555 909,94 1,86 %
11 Башкортостан (Республика) 54,74 4 143 430,64 1,69 %
12 Ростовская область 50,42 3 706 578,69 1,51 %
13 Кемеровская область 97,45 3 559 172,22 1,45 %
14 Челябинская область 47,14 3 516 332,30 1,43 %
15 Новосибирская область 35,84 3 401 496,76 1,39 %
16 Пермский край 50,19 2 862 888,77 1,17 %
17 Приморский край 48,74 2 578 156,83 1,05 %
18 Иркутская область 51,45 2 551 634,44 1,04 %
19 Воронежская область 52,35 2 345 212,33 0,96 %
20 Ленинградская область 70,54 2 302 998,03 0,94 %
21 Белгородская область 76,66 2 276 358,24 0,93 %
22 Калининградская область 54,25 1 942 842,15 0,79 %
23 Вологодская область 52,38 1 749 852,03 0,71 %
24 Хабаровский край 49,13 1 660 687,74 0,68 %
25 Калужская область 72,14 1 615 457,73 0,66 %
26 Волгоградская область 42,42 1 464 757,15 0,60 %
27 Ярославская область 43,31 1 439 430,46 0,59 %
28 Алтайский край 32,26 1 430 455,77 0,58 %
29 Ставропольский край 40,13 1 422 899,05 0,58 %
30 Оренбургская область 49,78 1 406 729,61 0,57 %
31 Саратовская область 34,80 1 400 069,26 0,57 %
32 Липецкая область 72,20 1 374 978,35 0,56 %
33 Удмуртская Республика 41,31 1 374 187,91 0,56 %
34 Тульская область 51,16 1 364 418,82 0,56 %
35 Томская область 50,40 1 293 777,11 0,53 %
36 Владимирская область 46,36 1 227 037,27 0,50 %
37 Мурманская область 88,47 1 212 648,17 0,49 %
38 Омская область 30,93 1 135 973,43 0,46 %
39 Саха (Республика) (Якутия) 50,29 1 072 922,52 0,44 %
40 Коми (Республика) 67,63 1 021 277,56 0,42 %
41 Рязанская область 40,83 976 300,88 0,40 %
42 Тверская область 33,99 962 786,05 0,39 %
43 Смоленская область 40,55 957 554,23 0,39 %
44 Курская область 52,17 924 692,72 0,38 %
45 Кабардино-Балкарская Республика 90,92 900 663,54 0,37 %
46 Пензенская область 36,16 770 981,00 0,31 %
47 Тамбовская область 52,61 744 194,46 0,30 %
48 Кировская область 26,73 740 951,77 0,30 %
49 Брянская область 44,82 723 485,40 0,29 %
50 Ульяновская область 31,12 720 926,67 0,29 %
51 Республика Крым 22,41 694 382,85 0,28 %
52 Сахалинская область 48,83 653 304,08 0,27 %
53 Архангельская область 33,54 649 333,35 0,26 %
54 Ивановская область 23,93 615 981,93 0,25 %
55 Чувашская Республика-Чувашия 29,30 584 117,98 0,24 %
56 Амурская область 42,41 571 451,56 0,23 %
57 Астраханская область 39,63 508 055,20 0,21 %
58 Дагестан (Республика) 16,79 491 514,98 0,20 %
59 Новгородская область 44,42 485 394,55 0,20 %
60 Орловская область 39,88 474 230,56 0,19 %
61 Мордовия (Республика) 41,12 473 335,20 0,19 %
62 Карелия (Республика) 24,90 457 107,43 0,19 %
63 Бурятия (Республика) 22,21 436 127,23 0,18 %
64 Магаданская область 113,14 433 443,68 0,18 %
65 Камчатский край 45,46 423 624,64 0,17 %
66 Марий Эл (Республика) 36,26 400 294,82 0,16 %
67 Псковская область 33,72 397 313,30 0,16 %
68 Забайкальский край 29,53 373 109,88 0,15 %
69 Костромская область 26,00 339 066,17 0,14 %
70 Курганская область 27,01 310 943,06 0,13 %
71 Хакасия (Республика) 39,49 303 267,57 0,12 %
72 Чеченская Республика 22,61 224 494,95 0,09 %
73 Севастополь 18,35 195 965,46 0,08 %
74 Карачаево-Черкесская Республика 32,06 184 881,47 0,08 %
75 Чукотский автономный округ 149,17 163 039,91 0,07 %
76 Северная Осетия-Алания (Республика) 17,94 157 057,85 0,06 %
77 Алтай (Республика) 31,24 151 552,92 0,06 %
78 Адыгея (Республика) (Адыгея) 23,69 144 104,55 0,06 %
79 Тыва (Республика) 14,27 50 890,17 0,02 %
80 Калмыкия (Республика) 14,55 50 805,52 0,02 %
81 Еврейская автономная область 18,69 43 913,11 0,02 %
82 Ингушетия (Республика) 8,60 43 447,69 0,02 %

MODIS

Как делать замеры

Одежда, дети 3-7 лет

Размер 26 28 28 30 30 
Российский размер 3 года 4 года 5 лет 6 лет 7 лет 
Рост (см) 98 104 110 116 122
Обхват груди (см) 52 56 56 60 60   
Обхват талии (см) 48 51 51 54 54   

Одежда, девочки 7-13 лет

Размер 30 32 34 36 38 40 40
Российский размер 7 лет 8 лет 9 лет 10 лет 11 лет 12 лет 13 лет
Рост (см) 122 128 134 140 146 152 158
Обхват груди (см) 60 64 68 72 76 80 80
Обхват талии (см) 54 57 60 63 66 66 66

Одежда, мальчики 7-13 лет

Размер 30 32 34 36 38 40 40
Российский размер 7 лет 8 лет 9 лет 10 лет 11 лет 12 лет 13 лет
Рост (см) 122 128 134 140 146 152 158
Обхват груди (см) 60 64 68 72 76 80 80
Обхват талии (см) 54 57 60 63 66 69 69

Одежда для новорожденных

Размер 3 мес 6 мес 9 мес 12 мес 18 мес 24 мес
Рост (см) 62 68 74 80 86 92
Обхват груди (см) 40 44 44 48 48 52

Обувь, дети 1-3 года

Размер обуви 17 18 19 20 21 22
Длина стопы,мм 105 110 115 125 130 135
Длина стельки ориентировочная (зависит от модели обуви) 110 115 120 130 135 140

Обувь, дети 3-7 лет

Размер обуви 23 24 25 26 27 28 29 30
Длина стопы,мм 145 150 155 165 170 175 185 190
Длина стельки ориентировочная (зависит от модели обуви) 150 155 160 170 175 180 190 195

Обувь, дети 7-13 лет

Размер обуви 31 32 33 34 35 36 37
Длина стопы,мм 195 205 210 215 225 230 235
Длина стельки ориентировочная (зависит от модели обуви) 200 210 215 220 230 235 240

Носки

Размер носков 18-20 20-22




Длина стопы, см 18-20 20-22




Фактический размер обуви (ноги) 29-31 32-34





SGPN 34 NK-40 G1 / 4-AG> Вакуумные присоски

Плоская присоска (круглая) для осторожного захват бумаги, полиэтиленовой пленки, и Т. Д.

6 Вакуумное соединение
Размер 34
Материал присоски Натуральный каучук NK
Твердость материала [Shore A] 40 Shore A
Материал ниппеля
G1 / 4 “-M
Атрибут Значение
dn 5.50 мм
Dmax (S) 37,50 мм
DS 34 мм
G1 G1 / 4 “-M
H 28 мм
LG1 10 мм
SW1 17 мм
Z (ход) 2.20 мм
Атрибут Значение
Сила всасывания (-600 мбар) 25 N
Объем 3.70 см³
Диаметр шланга (пустой) d 4 мм
Размер 34
Количество складок 0
Материал присоски Натуральный каучук NK
Твердость материала [по Шору A] 40 Shore A
Масса 12 г
Семейство продуктов SGPN

Информация для заказа: СГПН 34 НК-40 Г1 / 4-АГ

Присоска плоская SGPN (эластомерная часть + соединительный ниппель) поставляется в разобранном виде.В комплект поставки входят:

  • Присоска типа SGP – эластомерная часть, доступна в различных диаметрах и из различных материалов
  • Соединительный ниппель типа SA-NIP – доступна с различной резьбой

Доступные запчасти: присоска SGP, соединительный ниппель SA-NIP

Текущий прогресс и новые возможности

Реферат

Иммунотерапия рака прочно утвердилась в качестве новой вехи в терапии рака с развитием множественных иммунных клеток в качестве терапевтических инструментов.Клетки естественные киллеры (NK) – это клетки врожденного иммунитета, наделенные мощной цитолитической активностью против опухолей, и в то же время они действуют как регулирующие клетки для иммунной системы. Эффективность иммунотерапии, опосредованной NK-клетками, можно повысить за счет иммуностимуляторов, таких как цитокины и антитела, и адоптивного переноса активированных NK-клеток, увеличенных ex vivo . Кроме того, NK-клетки могут вооружаться химерными антигенными рецепторами (CAR), что может значительно усиливать их противоопухолевую активность. Совсем недавно внеклеточные везикулы (EV), полученные из NK-клеток, показали многообещающие противоопухолевые эффекты в доклинических исследованиях.Здесь мы внимательно рассматриваем текущий прогресс в этих основанных на NK-клетках иммунотерапевтических стратегиях (NK-клетки в сочетании со стимуляторами, адоптивный перенос NK-клеток, CAR-NK-клетки и NK-EV) для лечения рака, а также обсудили проблемы и возможности. для открытия новых горизонтов в иммунотерапии рака.

Ключевые слова: иммунотерапия рака, естественные клетки-киллеры, цитокины, антитела, адоптивная клеточная иммунотерапия, рецептор химерного антигена, внеклеточные везикулы

Введение

Иммунотерапия рака, которая работает за счет активации собственной иммунной системы организма, становится все более важной вариант лечения рака.В последние годы успехи в противоопухолевой терапии с использованием антител и клеточной иммунотерапии стали знаковыми событиями в истории лечения опухолей (1, 2). Как клетки врожденного иммунитета, естественные клетки-киллеры (NK) уникальны и играют решающую роль в иммунном надзоре за раком. NK-клетки могут устранять множество аномальных или подверженных стрессу клеток без предварительной сенсибилизации и даже предпочтительно убивать стволовые клетки или раковые стволовые клетки (3–5). После образования иммунных синапсов с клетками-мишенями NK-клетки высвобождают предварительно сформированные цитолитические гранулы, включая перфорин, и гранзимы, функция которых заключается в индукции лизиса клеток.В нескольких исследованиях успешно использовался адоптивный перенос NK-клеток против различных опухолей, особенно гематологических злокачественных новообразований.

Однако при раке используются различные тактики для задержки, изменения или даже остановки противоопухолевого иммунитета, что приводит к сбоям в контроле роста опухоли. Противоопухолевый ответ NK-клеток также сталкивается с множеством ограничений. Во-первых, низкая способность NK-клеток достигать опухолевых тканей ограничивает их применение в качестве терапии солидных опухолей. Это частая проблема стратегий клеточной иммунотерапии (6).Во-вторых, изменения в рецепторах, активирующих NK-клетки, и их лигандах в опухолях могут привести к снижению терапевтического ответа и прогрессированию опухоли (7). Например, высокие уровни лигандов NKG2D (Natural-killer Group 2, Member D) обнаруживаются на ранних стадиях колоректального рака, но их экспрессия снижается по мере прогрессирования заболевания (8). В-третьих, микроокружение опухоли (TME) остается основным барьером для эффективности адоптивно перенесенных NK-клеток. Например, проникающие в опухоль иммунные клетки, такие как дендритные клетки (DC), супрессивные или толерогенные макрофаги и регуляторные T (Treg) -клетки, а также связанные с раком фибробласты, которые встроены во внеклеточный матрикс, могут вмешиваться в активацию NK-клеток. через секрецию иммуносупрессивных цитокинов или вмешиваясь в экспрессию рецепторов (9, 10).Например, в TEM TGF-β распознается как главный ингибирующий цитокин NK-клеток, который ограничивает количество и антиметастатическую функцию NK-клеток. Другие факторы, такие как простагландин E2, аденозин или индоламин-2,3-диоксигеназа, также могут блокировать цитотоксическую активность NK-клеток путем, соответственно, индукции миелоидных супрессорных клеток (11), связывания с рецепторами аденозина A2A, экспрессируемыми на NK-клетках ( 12) или катализируя L-кинуренин, продуцирующий триптофан, для подавления экспрессии NKp46 и NKG2D на NK-клетках (7, 13).Кроме того, было обнаружено, что цитотоксичность NK-клеток ингибируется активированными тромбоцитами в злокачественной среде с помощью ряда механизмов, включая выделение и перенос их молекул MHC класса I в опухолевые клетки; подрыв эффекторной функции NK-клеток с помощью TGF-β, полученного из тромбоцитов (14), или защиты опухолевых клеток от атаки NK-клеток (15-17).

Для преодоления вышеуказанных проблем было исследовано множество стратегий, либо путем добавления иммуностимуляторов для получения синергетических эффектов, адоптивного переноса NK-клеток, увеличивающего in vitro , либо путем генетической модификации самих NK-клеток, чтобы они стали более сильными и устойчивыми.Кроме того, секретируемые NK-клетками структуры нановезикул, известные как внеклеточные везикулы (EV), привлекают внимание в связи с их применением в терапии рака.

Биология NK-клеток

NK-клетки, впервые идентифицированные в 1975 году, представляют собой врожденные эффекторные лимфоциты, которые отличаются от Т-клеток и В-клеток. NK-клетки могут распознавать и уничтожать аномальные клетки, у которых отсутствует ограничение MHC или предшествующая сенсибилизация, и они считаются наиболее эффективной субпопуляцией иммунных клеток для мониторинга и очистки больных клеток in vivo (18, 19).

NK-клетки развиваются из общих лимфоидных клеток-предшественников в костном мозге (BM) и существуют в первичной и вторичной лимфоидной ткани, а также в нелимфоидной ткани, включая легкие, печень и периферическую кровь (PB) (20 ). Из всех циркулирующих лимфоцитов 10-15% считаются NK-клетками. У человека эти клетки представляют собой лимфоциты CD3 , CD56 + , а у мышей фенотипически представляют собой CD3 NK1.1 + . NK-клетки человека были идентифицированы в две отдельные субпопуляции на основе плотности CD56 на клеточной поверхности, а именно: NK-клетки CD56 яркие CD16 dim NK-клетки, также известные как незрелые NK-клетки, являются продуцентами цитокинов, особенно интерферона гамма (IFNγ). , которые играют важную роль в иммуномодуляции; CD56 dim CD16 bright NK-клетки, известные как зрелые NK-клетки, составляют большинство (90%) NK-клеток в PB и играют важную роль в опосредовании иммунной функции NK-клеток (21).

NK-клетки играют ключевую роль в системах врожденной иммунной защиты в разрушении множества аномальных или стрессированных клеток (3, 4). В отличие от других лимфоцитов, распознавание NK-клеток контролируется не специфичностью антигена, а скорее интеграцией сигналов от активирующих и ингибирующих рецепторов, которые рекрутируются лигандами, экспрессируемыми на предполагаемых клетках-мишенях. Ингибирующие рецепторы, которые могут идентифицировать человеческий лейкоцитарный антиген класса I (HLA-I) или подобные молекулы класса I, охватывают два различных класса: киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы (KIR2DL и KIR3DL) и лектиновые рецепторы C-типа CD94 / NKG2A / B ( 22–24).Поскольку HLA-I почти экспрессируется на всех ядросодержащих клетках, ингибирующий ответ, следующий за набором ингибирующих рецепторов, служит распознаванием «себя», что подавляет активацию NK-клеток и предотвращает «самовоспроизводящуюся» литическую атаку (25). Кроме того, запрограммированная смерть-1 (PD-1), цитотоксический T-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA-4), Т-клеточный иммуноглобулин и муциновый домен, содержащий -3 (TIM-3), а также Т-клеточный иммунорецептор с Ig и Домены ITIM (TIGIT) действуют как серия иммунных контрольных точек, а также передают тормозные сигналы при связывании со своими лигандами.Устранение аномальных клеток усиливается отсутствием конститутивного собственного HLA-I. Распознавание стрессовых и аномальных клеток происходит за счет стимуляции рецепторов на их клеточной поверхности, таких как: KIR (KIR2DS и KIR3DS), NKG2D, ДНКX Accessory Molecule-1 (DNAM-1), комплекс рецепторов лектина C-типа клеток-киллеров CD94 / NKG2C и рецепторы естественной цитотоксичности (NKp30, NKp44, NKp46) (25).

Считается, что прямая цитотоксичность NK-клеток в отношении клеток-мишеней в значительной степени зависит от цитолитических гранул, таких как перфорин и гранзимы (26).Опосредованный рецептором смерти (DR) апоптотический процесс аномальных или подвергнутых стрессу клеток также является способом прямого уничтожения. Апоптоз, индуцированный ферментативным каспазным каскадом, запускается взаимодействием между DR (например, FasL, TRAIL), экспрессируемыми на NK-клетках, и их лигандами на клетках-мишенях (27). Другой механизм прямого уничтожения включает антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) (19). У людей ADCC обычно опосредуется иммуноглобулином G (IgG). Фрагмент Fab и фрагмент Fc антитела связываются с опухоль-ассоциированными антигенами (TAA) на опухолевой клетке и CD16A (FcγRIIIA), активирующим рецептором, экспрессируемым на NK-клетке, соответственно, с образованием иммунологического синапса между ними.Затем NK-клетки активируются и секретируют цитотоксические гранулы для уничтожения опухолевых клеток (более подробную информацию о ADCC NK-клеток см. В разделе «Использование опухолеспецифических антител для опосредования ADCC NK-клеток»). Кроме того, NK-клетки могут действовать косвенным образом, продуцируя хемокины и цитокины, чтобы убивать аномальные клетки и регулировать врожденные и приобретенные иммунные ответы (28).

Иммуностимулирующие молекулы для повышения противоопухолевой активности NK-клеток

Эндогенные NK-клетки у онкологических больных обычно имеют нарушенную функцию из-за изменения репертуара рецепторов в клетках.Это может включать подавление активирующих рецепторов и / или усиление ингибирующих рецепторов (7). Таким образом, основным методом иммунотерапевтического лечения является «подталкивание» к активации иммунной системы путем включения таких добавок, как цитокины и антитела, которые помогают модулировать механизмы, улучшающие количество и / или качество противоопухолевого иммунного ответа (29).

Различные подходы к иммунотерапии на основе NK-клеток. (A) Введение стимулирующих цитокинов и антител пациентам запускает активацию и размножение аутологичных NK-клеток и усиливает их цитотоксичность.(i) Цитокин. «Супер» агонист IL-2 улучшает его сродство к IL-2 / 15Rβ. Ширина стрелки указывает на ожидаемую интенсивность передачи сигналов IL-2. «Супер» агонист IL-15 имитирует физиологическую транс-презентацию IL-15 в NK-клетки без участия антигенпрезентирующих клеток. (ii) Антитела. Связывание CD16 с Fc-частью mAb TAA приводит к активации NK-клеток и ADCC. Применение мишени BiKE или TriKE к CD16 или NKG2D (на NK-клетках) и опухолевым антигенам способствует образованию иммунных синапсов между NK-клетками и опухолевыми клетками.mAb против ингибирующих рецепторов на NK-клетках усиливают цитотоксичность NK. (B) Адоптивный перенос NK-клеток. (i) NK-клетки, полученные из PBMC, линий NK-клеток или hPSC, можно вводить пациентам напрямую или в сочетании с иммуностимуляторами. (ii) NK-клетки конструируются для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), которым затем дают возможность размножаться ex vivo перед тем, как их снова перелить пациенту. (C) Инфузия сконструированных NK-клеток и EV, полученных из NK / CAR-NK-клеток.Среда для культивирования размноженных NK-клеток или CAR NK-клеток может использоваться для выделения EV и затем вливания пациенту. TAA, антиген, связанный с опухолью; PD-L1, лиганд-1 запрограммированной смерти; ECM, внеклеточный матрикс.

Цитокины для аргументации активности NK-клеток

Цитокины способствуют выживанию, пролиферации, дифференцировке и активации лимфоцитов. Интерлейкин (ИЛ) -2, -15, -12, -21, а также -18 улучшают противоопухолевую функцию NK-клеток и усиливают их пролиферацию in vitro и in vivo (30, 31).Здесь мы сосредоточимся на первых двух. Более подробный обзор можно найти в Fang et al. (32), Лин и Леонард (33).

IL-2 был первоначально открыт как фактор роста Т-клеток более 30 лет назад, и в настоящее время он является одним из самых популярных цитокинов, используемых для повышения цитотоксичности NK-клеток (30). Однако терапия высокими дозами ИЛ-2 может привести к серьезным побочным эффектам, включая утечку сосудов и повреждение органов, вызванное активацией эндотелия сосудов, где экспрессируется высокоаффинный рецептор ИЛ-2, ИЛ-2Rα βγ ( 34).Кроме того, Treg-клетки также экспрессируют высокоаффинные рецепторы IL-2Rα βγ и предпочтительно активируются IL-2, подавляя пролиферацию NK-клеток и цитотоксичность (35). Это привело к разработке альтернативных форм IL-2. Новый мутант IL-2, названный «super-2», был сконструирован с повышенным сродством к субъединице IL-2 / 15Rβ, присутствующей на NK-клетках, но с более низким сродством к субъединице IL-2Rα (36). Альтернативно, варианты IL-2, такие как F42K, демонстрируют пониженную аффинность in vitro к IL-2Rα (37).Другая стратегия состоит в создании рекомбинантного слитого белка, состоящего из связывающего белка NKG2D, кодируемого вирусом коровьей оспы, с мутированной формой IL-2, которая предпочтительно и сильно стимулирует IL-2 на клетках, несущих только NKG2D, без широкой активации клеток, несущих IL-2Rα, или вызывая побочные эффекты на животных моделях (38).

Превосходной альтернативой IL-2 является IL-15, который предпочтительно стимулирует память CD8 + Т-клеток, а также незрелых и зрелых NK-клеток. Рецепторы IL-15 состоят из IL-15Rα, IL-2 / 15Rβ и γc.IL15Rα, экспрессируемый на антигенпрезентирующих клетках, таких как DC и моноциты, может представлять IL-15 в транс- к рецепторам IL-2Rβγc, экспрессируемым на Т-клетках NK и CD8 + , без активации Treg (39). IL-15 является основным цитокином семейства γc, отвечающим за цитотоксичность, гомеостаз и развитие NK-клеток (30). В первом клиническом испытании, в котором рекомбинантный человеческий (rh) IL-15 вводили пациентам с метастатическими злокачественными новообразованиями, у пациентов наблюдалась пролиферация NK-клеток (40). Хотя у двух пациентов наблюдалось исчезновение поражений легких, объективных ответов не было.Кроме того, клиническое использование rhIL-15 может быть затруднено из-за его короткого периода полувыведения и плохой переносимости пациентами (MTD: 0,3 мкг / кг / день). Интересно, что было обнаружено, что rhIL-15 модулирует гомеостаз NK-клеток, Т-клеток памяти CD8 + и γδ Т-клеток, но не Treg-клеток (40). Более того, в самом последнем клиническом исследовании фазы I сообщалось, что подкожное введение rhIL-15 значительно повышает переносимую дозу rhIL-15 у пациентов с рефрактерной солидной опухолью (MTD: 3 мкг / кг / день).Подкожное введение rhIL-15 заметно способствовало пролиферации циркулирующих NK-клеток и T-клеток CD8 + , особенно NK-клеток CD56 bright (41). Биологическая функция rhIL-15 позволяет использовать его в сочетании с другими способами. Действительно, существует несколько клинических испытаний ({“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT03759184”, “term_id”: “NCT03759184”}} NCT03759184: обинутузумаб; {“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“текст”: “NCT02689453”, “term_id”: “NCT02689453”}} NCT02689453: алемтузумаб; {“тип”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“текст “:” NCT03388632 “,” term_id “:” NCT03388632 “}} NCT03388632: ниволумаб и ипилимумаб; {” type “:” клиническое испытание “,” attrs “: {” text “:” NCT035 “,” term_id “:” NCT035 “}} NCT035: авелумаб) в настоящее время исследуется rhIL-15 в сочетании с антителами.

ALT-803 является суперагонистом IL-15, содержащим IL-15Ra, слитый с IgG1Fc, который связан с мутеином IL-15 (N72D). Это специальное соединение разработано для имитации типичного trans представления IL-15 и имеет гораздо более длительный период полувыведения (25 часов против <40 минут), что может привести к усилению ADCC (42, 43). В первой фазе I клинического исследования ALT-803 33 пациента, у которых возник рецидив после трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток (алло-HCT), получали ALT-803 внутривенно или подкожно.ALT-803 обычно хорошо переносится, поскольку в обеих когортах не наблюдалось серьезной дозоограничивающей токсичности (DLT) и болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD). Девятнадцать процентов субъектов показали клиническое улучшение, одна полная ремиссия длилась 7 месяцев. У всех пациентов в этом исследовании наблюдались повышенные уровни циркулирующих NK-клеток CD56 , ярких и CD8 + Т-клеток, особенно при подкожном введении (44). Учитывая его длительный период полужизни и мощную активирующую способность для CD8 + T и NK-клеток, ALT-803 оценивается в ряде текущих клинических исследований в сочетании с антителами ({“тип”: “клиническое испытание”, ” attrs “: {” текст “:” NCT02523469 “,” term_id “:” NCT02523469 “}} NCT02523469: ниволумаб, {” тип “:” клиническое испытание “,” attrs “: {” текст “:” NCT02384954 “,” term_id “:” NCT02384954 “}} NCT02384954: ритуксимаб) или адоптивный перенос NK-клеток ({” type “:” клиническое испытание “,” attrs “: {” text “:” NCT01898793 “,” term_id “:” NCT01898793 ” }} NCT01898793, {“тип”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“текст”: “NCT02782546”, “term_id”: “NCT02782546”}} NCT02782546).В недавнем клиническом исследовании фазы 1b ALT-803 в сочетании с антителом против PD-1 ниволумабом хорошо переносился пациентами с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), и 6/21 пациентов показали объективный ответ. Примечательно, что среди 11 субъектов, ранее получавших только ниволумаб и имевших рецидив, у 3 наблюдался частичный ответ, что позволяет предположить, что добавление ALT-803 может усилить противоопухолевую активность антител (45). В клинических исследованиях, сочетающих ALT-803 с адоптивным переносом NK-клеток ({“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT01898793”, “term_id”: “NCT01898793”}} NCT01898793, { “type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT02782546”, “term_id”: “NCT02782546”}} NCT02782546), подкожно введенный ALT-803, как ожидается, усилит активацию in vivo , выживаемость и рост донорских NK-клеток без серьезных побочных эффектов (46).Учитывая тот факт, что ALT-803 обладает значительной противоопухолевой активностью и не усугубляет побочные эффекты, связанные с ниволумабом или Bacillus Calmette Guerin (BCG) (47), значимые результаты многообещают в этих продолжающихся исследованиях.

Антитела для перенаправления цитотоксичности NK

Моноклональные антитела (mAb) обладают сильной неотъемлемой эффективностью, которая подходит для иммунотерапии рака, поскольку они, как было показано, прямо и / или косвенно способствуют роли NK-клеток in vivo .В этом разделе мы обсудим опухолеспецифические антитела, специфические киллеры и антитела, нацеленные на ингибирующие рецепторы (на NK-клетках).

Использование опухолеспецифических антител для опосредования ADCC NK-клеток

Опухолевые антитела представляют собой моноклональные антитела, которые работают частично, способствуя ADCC NK-клеток посредством связывания части Fc IgG и его активирующего рецептора CD16A (FcγRIIIA), экспрессируемого на NK-клетках (48). Ранее Varchetta et al. обнаружили, что терапия трастузумабом вызвала ADCC NK- и NKT-клеток у 15 из 18 пациентов с раком груди, сверхэкспрессирующим Her2, а убивающая способность лимфоцитов CD16 + зависела от 158 V / F-полиморфизма CD16A (49).Это исследование показывает, что эффективность краткосрочной монотерапии трастузумабом может быть связана с ADCC. Однако на самом деле ADCC зависит от ряда факторов. Во-первых, разница в аффинности аллотипа CD16A у онкологических больных может вносить вклад в индивидуальную гетерогенность ADCC. Пациенты с аллелями CD16A 158VV показали более высокое сродство к mAb IgG, чем пациенты, несущие аллели 158FF и 158VF (49). Во-вторых, количество NK-клеток и NKT-клеток среди лимфоцитов периферической крови влияет на интенсивность ADCC (49).Было показано, что различные уровни ADCC у пациентов коррелируют с количеством эффекторных клеток. В-третьих, подклассы IgG различаются по аффинности к CD16A, и это различие в связывании определяет их способность вызывать ADCC. Было продемонстрировано, что IgG3 и IgG1 демонстрируют высокое сродство к CD16A, за ним следует IgG4, в то время как сродство IgG2 к CD16A чрезвычайно низкое (50). Кроме того, ADCC связан с концентрацией mAb IgG дозозависимым образом. Гуморальные компоненты могут подавлять ADCC, учитывая потенциальную конкуренцию между обычными mAb и человеческим сывороточным IgG за связывание CD16A (51, 52).

Некоторые исследования были сосредоточены на модификации mAb для усиления ADCC за счет увеличения сродства к рецепторам Fc посредством мутагенеза или гликозилирования. Сконструированное с помощью Fc антитело CD133, содержащее замену S239D / I332E, показало улучшенное сродство к NK-клеткам и сильную дегрануляцию NK-клеток в модели острого миелоидного лейкоза человека (AML) с ксенотрансплантатом (53). Альтернативно, полученные из трансгенной курицы моноклональные антитела к CD20, представляющие 14 паттернов N-гликанов, такие как терминальное галактозилирование, афукозилирование и высокое содержание маннозы, показали значительно улучшенные Fc-опосредованные роли, такие как ADCC и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), по сравнению с коммерческими ритуксимаб, химерное mAb против CD20 (54).

Недавно Ferrari de Andrade et al. генерировали mAb 7C6 против MICA / B (ген A / B, связанный с цепью главного комплекса гистосовместимости класса I), которые могли предотвращать протеолитическое шеддинг внеклеточных доменов MICA и MICB и опосредовать противоопухолевый иммунитет путем активации NKG2D и CD16 на NK-клетках. В модели метастазов, предварительно обработанной человеческими NK-клетками, mAb 7C6 эффективно ингибировало рост опухоли in vivo (55).

Иммуноцитокины – еще один выбор. Например, hu14.18-IL2 представляет собой гуманизированное mAb, ковалентно связанное с двумя молекулами IL-2 в области Fc. Было продемонстрировано, что он эффективно лечит пациентов с запущенной меланомой или нейробластомой (56).

Использование би- или триспецифических агентов-киллеров для усиления активности NK-клеток

Би-специфические или три-специфические агенты-киллеры (BiKEs или TriKEs) представляют собой сконструированные группы, содержащие одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) против как TAA, так и активация рецепторов на NK-клетках для создания иммунологического синапса между NK-клетками и опухолевыми клетками (57).

CD16 является привлекательным кандидатом для опосредования зависимого от NK-клеток уничтожения опухолевых клеток. Было продемонстрировано, что CD16-направленные биспецифические (CD16 × 19) и триспецифические (CD16 × 19 × 22) агенты scFv напрямую стимулируют NK-клетки через CD16, усиливая литическую активность NK-клеток и высвобождение цитокинов для атаки лимфоидных опухолей (58 , 59). Другое новое антитело BiKE, CD16 × 33 BiKE, передает сигнал через CD16 и нацелено на антиген миелоидной дифференцировки CD33. Он может специфически запускать литическую активность NK-клеток и высвобождение цитотоксических гранул для борьбы с AML-клетками in vitro .Кроме того, в том же исследовании было обнаружено, что добавление ингибитора ADAM17, который предотвращает шеддинг CD16, может усиливать эффекторные роли NK-клеток (60). NKG2D, рецептор лектинового типа и один из основных активирующих рецепторов NK-клеток, является еще одним мощным кандидатом на роль посредника в иммунном надзоре за NK-клетками. Биспецифическое антитело CS1-NKG2D, содержащее scFv против CS1scFv и против NKG2D, демонстрирует дозозависимое увеличение специфической цитотоксичности NK-клеток, а также продукцию цитокинов in vitro и значительно увеличивает выживаемость человека. модель множественной миеломы (ММ) (61).

В последние годы модифицированные антитела, привлекающие клетки-киллеры, были разработаны с точки зрения дизайна и структуры. Например, AFM13, четырехвалентное биспецифическое тандемное антитело против CD16A и CD30, работает Fc-независимым образом с высокой аффинностью без связывания Fc-доменов с CD16A. Благодаря молекулярной массе 104 кДа (BiKE / TriKE: 50-75 кДа) AFM13 имеет более длительный период полужизни, чем другие би / три-специфические антитела. Его переносимость и безопасность были протестированы у пациентов с рецидивирующей / рефрактерной лимфомой Ходжкина, при этом у 77% пациентов болезнь была стабильной (62, 63).В настоящее время он проходит оценку в рамках фазы II исследования монотерапии у пациентов с рецидивирующей / рефрактерной лимфомой Ходжкина (64). TriKE разработаны в формате BiKE. Улучшения в TriKE нового поколения включают повышение специфичности к мишеням, модификацию scFv с высоким сродством к NK-клеткам, а также усиление самоподдерживающейся активности NK-клеток (65). Например, модифицированный сшивающий агент IL-15 был интегрирован в TriKE для увеличения выживаемости и размножения NK-клеток in vivo (66, 67).161533 TriKE, состоящий из scFv против CD16, модифицированного линкера IL-15 и scFv против CD33, может направлять антиген-специфический ADCC, увеличивая при этом выживаемость и пролиферацию NK-клеток против AML in vivo (66). 1615EpCAM TriKE (CD16 × IL-15 × Epcam) значительно усиливал пролиферацию NK-клеток, литическую дегрануляцию и секрецию цитокинов in vitro (67).

Хотя методы лечения BiKE / TriKE обладают способностью перенаправлять цитотоксичность NK, улучшать функцию NK, а также могут использоваться в сочетании с существующими иммунотерапевтическими методами лечения рака, все еще существует множество препятствий, препятствующих их клиническому применению.Проблемы успешной трансляции BiKE / TriKE могут включать дизайн структуры, например идентификацию TAA и выбор подходящего линкера для суставов (68, 69). Подходящие TAA могут помочь снизить нецелевые эффекты этих сконструированных молекул, что также важно для клинической трансляции CAR-T-терапии. С другой стороны, совместные линкеры, выбранные в BiKE / TriKE, обладают потенциалом доминировать в биораспределении целых молекул, что может либо увеличивать, либо уменьшать их способность нацеливания на опухоль.Сообщается, что часть цитокина может влиять на всю молекулу иммуноцитокина, чтобы распознавать нерелевантный антиген, что указывает на то, что тщательная оценка биораспределения имеет решающее значение для дизайна формата (70). Еще одна проблема – технология производства. Несмотря на то, что выход белка был улучшен с развитием системы экспрессии, рентабельное и высокопроизводительное производство остается проблемой (71).

Нацеливание на иммунные контрольные точки для снятия ингибирования NK-клеток

Цель антител, нацеленных на ингибирующие рецепторы NK-клеток, особенно иммунные контрольные точки-мишени, состоит в том, чтобы разблокировать заблокированный иммунный ответ для повышения противоопухолевой активности.Это отличается от «энхансеров» NK-клеток, которые активируют иммунную систему для улучшения противоопухолевых ответов.

Одним из основных типов ингибирующих рецепторов являются ингибирующие иммуноглобулин-подобные рецепторы (KIR) клеток-киллеров, на которые могут нацеливаться антитела IPh3101 и IPh3102 (лирилумаб). IPh3101 и IPh3102 представляют собой mAb иммуноглобулина G4 (IgG4) клинической степени, которые взаимодействуют с фрагментами KIR2D. In vitro они увеличивают опосредованное NK киллинг против опухолевых клеток, экспрессирующих KIR-лиганд и покрытых антителами (72, 73).Переносимость и безопасность IPh3101 были подтверждены клиническими испытаниями фазы I у пациентов с ОМЛ или рецидивирующим / рефрактерным ММ (74, 75). Однако IPh3101 вызывал недостаточный клинический ответ только в клинических испытаниях фазы II у пациентов с тлеющим ММ (76). Карлстен и др. продемонстрировали, что инфузия IPh3101 приводит к значительному снижению как экспрессии KIR2D на NK-клетках, так и чувствительности NK-клеток, что может быть основным механизмом низкой терапевтической эффективности IPh3101 (77).Потеря KIR2D на NK-клетках, индуцированная IPh3101, опосредована трогоцитозом, механизмом, посредством которого активированные нейтрофилы и моноциты, экспрессирующие FcγRI, извлекают KIR2D из NK-клеток и экспрессируют эту молекулу-мишень для антител на своей собственной поверхности. Эти данные предполагают, что применение IPh3101-опосредованной блокады KIR2D in vivo может быть ограничено потерей KIR2D на NK-клетках и последующей гипореактивностью к антителу против KIR. Поскольку человеческое mAb IgG4, полученное из рекомбинантных клеток яичника китайского хомячка, IPh3102 (лирилумаб) имеет общую первичную аминокислотную последовательность с IPh3101, за исключением мутации, включенной в константную область тяжелой цепи, путем замены пролина на серин.В первом исследовании фазы I с участием людей с использованием высоких доз лирилумаба у пациентов с высокой чувствительностью к модуляции NK-клеток не было зарегистрировано токсичности, ограничивающей дозу (78). Таким образом, дальнейшие исследования должны изучить эффективность IPh3101 и IPh3102 при различных заболеваниях, а также их терапевтическую ценность в сочетании с другими методами лечения, например, цитокинами или mAb, нацеленными на опухоль.

IPh3201 (humZ270), mAb, связанное с NKG2A, продемонстрировало повышенную цитотоксичность NK в отношении клеточных линий вируса Эпштейна-Барра (EBV) или привитого первичного лейкоза человека in vivo (79).В настоящее время проводятся клинические испытания, направленные на проверку его безопасности, переносимости и эффективности при использовании по отдельности или при совместном применении с другими методами лечения (www.clinicaltrials.gov).

PD-1 представляет собой ингибирующий рецептор, экспрессируемый некоторыми активированными лимфоцитами, включая В-клетки, Т-клетки и NK-клетки. PD-1 может индуцироваться на NK-клетках больных раком и вызывает функциональную недостаточность активированных NK-клеток. Это привело к созданию многих антител к PD-1, включая ниволумаб, пидилизумаб и пембролизумаб (80).Текущие исследования сосредоточены на антителах к PD-1, которые могут подавлять рост опухоли путем устранения иммуносупрессии Т-лимфоцитов, поэтому стоит изучить усиление цитотоксичности эндогенных NK-клеток за счет антител к PD-1.

Другой ингибирующий рецептор, обнаруженный на клеточной поверхности NK-клеток и Т-клеток, – это TIGIT. Сообщалось, что блокирование TIGIT является альтернативной стратегией, дополняющей доступные в настоящее время иммунотерапии. В недавнем исследовании на мышах с опухолями Zhang et al. обнаружили, что ингибирование TIGIT усиливает опухолевый иммунитет, опосредованный NK-клетками, и блокирует истощение NK-клеток, дополнительно улучшая ответы памяти на повторное заражение опухолью зависимым от NK-клеток способом (81).Несколько других белков контрольной точки, включая LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3 и CD96, также присутствуют в NK-клетках (82).

Адоптивная иммунотерапия NK-клетками

Адоптивная передача NK-клеток с высоким выходом и высоким качеством является прямым и фундаментальным подходом к замене, восстановлению и улучшению функции иммунной системы посредством инфузии аллогенных NK-клеток, активированных ex vivo или химерного антигена рецептор (CAR) модифицировал NK-клетки, и было продемонстрировано, что это многообещающая клеточная иммунотерапия против опухолевых клеток.

Приспособительный перенос немодифицированных NK-клеток

Приспособительный перенос аутологичных NK-клеток увеличился ex vivo для лечения пациентов с лимфомой, раком толстой кишки, раком груди и раком легких был протестирован в ряде клинических испытаний. Наблюдался лишь очень ограниченный противоопухолевый эффект (83–85). Основная причина заключалась в том, что ингибирующие рецепторы на аутологичных NK-клетках соответствовали собственному MHC класса I, представленному на опухолевых клетках, и эти «собственные» сигналы распознавания впоследствии подавляли активацию NK-клеток (86).Кроме того, аутологичные NK-клетки, полученные от больных раком, фактически находились в состоянии подавления иммунитета с нарушенными функциями, что затрудняло проявление противоопухолевых свойств этих клеток. Первое доказательство того, что NK-клетки обладают клиническим преимуществом, было сообщено в 2002 г. (87). Он подтвердил, что аллореактивность NK-клеток донора против реципиента, которая в основном была результатом несовместимости лиганда KIR, может избежать рецидива и отторжения трансплантата без GVHD у пациентов с AML, получавших трансплантацию донорского гемопоэтического донора с несоответствием HLA (человеческие лейкоцитарные антигены) (87).Позже эта стратегия была использована в адоптивной клеточной иммунотерапии ex vivo активированных аллогенных NK-клеток, несоответствующих лиганду KIR / KIR, полученных из PBMC, у пациентов с AML (88). Впоследствии аллореактивные NK-клетки, полученные из PBMC, широко исследовались в качестве иммунотерапевтического средства в клинических испытаниях гематологических злокачественных новообразований, а также в испытаниях солидных опухолей, включая меланому, рак груди, рак яичников, нейробластому, почечно-клеточную карциному, колоректальный рак и гепатоцеллюлярный рак. (89, 90).Правила инфузии аллогенных NK-клеток для лечения рака были рассмотрены Leung Wing (91). Для производства большого количества аллореактивных NK-клеток перед реинфузией цитокины, такие как IL-2 и IL-15, первоначально использовались для культивирования ex vivo и размножения первичных NK-клеток из периферической крови (PB) (92). Однако было трудно получить большое количество функциональных NK-клеток, воздействуя только на цитокины. Впоследствии были разработаны искусственные антигенпрезентирующие клетки (аАРС) в качестве питающих клеток для размножения NK-клеток ex vivo .Наша группа разработала aAPC на основе K562 с CD137L-IL-21 и обнаружила, что они способствуют логарифмической фазе роста амплификации NK без указания на старение in vitro культуры (патент на изобретение № ZL201110075736.1). Используя aAPC с CD137L-IL21 в качестве питающих клеток, закрытый, крупномасштабный и автоматизированный биореактор в условиях GMP можно успешно использовать для производства большого количества активированных NK-клеток, что значительно продвинуло клинические испытания по применению NK-клеток. иммунотерапия.

Второй способ получения большого количества цитотоксических NK-клеток для иммунотерапии – использование клональных линий NK-клеток, таких как NK-92, KHYG-1, HANK-1, NKG, NK-YS, YTS, YT, NK3.3. , и NKL, все из которых могут легко размножаться в культуральной среде (93). Среди них NK-92 является единственной линией клеток, одобренной FDA США для использования в клинических испытаниях, хотя эти клетки, трансфицированные EBV, должны быть облучены перед адоптивным переносом, чтобы предотвратить размножение у пациентов (94). Клетки NK-92 могут легко размножаться в колбах, газопроницаемых мешках или биореакторах в соответствии с GMP, с временем удвоения от 24 до 36 часов для получения эффективных эффекторов NK-92 клинического уровня (93).Хотя безопасность и переносимость клеток NK-92 были проверены в нескольких клинических испытаниях фазы I, существуют ограниченные данные об их клинической пользе (94–96). В недавнем исследовании повышения дозы ({“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT009″, “term_id”: “NCT009″}} NCT009), осуществимость адаптивного переноса NK -92 клетки было оценено у 7 пациентов с рефрактерным / рецидивирующим ОМЛ. Ни у одного из пациентов не было ДЛТ, ни у кого не было полной ремиссии. Кроме того, не наблюдалось никаких значительных изменений ни в количестве, ни в активности NK-клеток, CD8 + T-клеток, CD4 + T-клеток, T-регуляторных клеток и миелоидных супрессорных клеток (MDSC) (97).Было указано, что ограниченная клиническая эффективность клеток NK-92 в основном связана с отсутствием экспрессии CD16 и их короткой продолжительностью жизни in vivo (32). Чтобы преодолеть эти барьеры, были успешно разработаны клетки-естественные киллеры с высоким сродством (haNK), вариант линии клеток NK-92, сконструированный с рецептором CD16A (158VV) и эндогенным IL-2. Этот вариант может опосредовать ADCC, а также обходить потребность в экзогенном IL-2 в культуре (98). Возможность использования клеток haNK в настоящее время исследуется у пациентов с солидными опухолями ({“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT03027128”, “term_id”: “NCT03027128”}} NCT03027128) .Более того, активированные мишенью клетки NK-92 (taNK), другой сконструированный вариант клеток NK-92, модифицированных CAR, были разработаны для нацеливания на опухолевые клетки, экспрессирующие TAA (99, 100). Стабильная экспрессия CAR и активность этих клеток были продемонстрированы HER2.taNK (HER2-specificc target-Activated NK), клеточной линией, которая в настоящее время тестируется на пациентах с рецидивирующей HER2-положительной глиобластомой ({“тип”: “клинический -trial “,” attrs “: {” text “:” NCT03383978 “,” term_id “:” NCT03383978 “}} NCT03383978).

Третьим источником NK-клеток для лизиса опухоли являются NK-клетки, дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), включая гемопоэтические стволовые / предшественники (HSPC) из пуповинной крови (UCB), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) и эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) (101–103).NK-клетки, полученные из hPSC, можно использовать в качестве аллогенного продукта. Протоколы для получения NK-клеток из hPSC часто включают разделение или генерацию гематопоэтических предшественников CD34 + и культивирование в присутствии цитокинов, поддерживающих NK-клетки (IL-3, IL-7, IL-15, SCF, FLT3L) для дальнейшего стимулирования дифференцировки и роста NK-клетки (104). Эти NK-клетки могут быть увеличены путем совместного культивирования с aAPC, что привело к увеличению log в 2–3 раза, которое длилось более 2 месяцев (105). NK-клетки, дифференцированные из стволовых, имеют фенотип, близкий к первичным NK-клеткам, более сильную пролиферативную способность и гомогенную, генетически определенную популяцию, которая отвечает требованиям их клинического применения (103, 104, 106).Недавно было продемонстрировано, что длительная криоконсервация (1–10 лет) не влияет на потенциал роста и эффекторную функцию NK-клеток, происходящих из UCB, что сделало UCB новым источником NK-клеток. В частности, во всем мире хранится более 600 000 единиц UCB (107). Безопасность и переносимость некоторых NK-клеток, происходящих из UCB, были проверены в ходе фазы I клинических испытаний против AML и миелодиспластических синдромов (108).

Чтобы получить более сильную активность переносимых NK-клеток по уничтожению опухолей, в клинических исследованиях часто используются иммуностимулирующие молекулы, такие как антитела и цитокины (89, 109).Более того, учитывая, что NK-клетки могут модулировать иммунную систему хозяина против рака и, следовательно, функционировать как иммунные адъюванты, они способны повышать эффективность противоопухолевой терапии в сочетании с традиционными методами лечения, такими как химиотерапия. В нескольких клинических испытаниях иммунотерапии на основе NK-клеток пациенты получали химиотерапию до инфузии NK-клеток (www.clinicaltrials.gov). В частности, некоторые препараты, используемые в химиотерапии рака, могут стимулировать экспрессию активирующих лигандов на опухолевых клетках, что делает опухолевые клетки более чувствительными к цитотоксичности, опосредованной NK-клетками.Некоторые из этих препаратов могут также способствовать привлечению NK-клеток к участкам опухоли за счет увеличения секреции выбранных хемокинов (110). Среди них леналидомид, по-видимому, является наиболее активным лекарством, которое преодолевает подавление противоопухолевых функций человеческих NK-клеток с помощью TME-ассоциированных IL-6 и TGF-β и снижает порог MICA для NKG2D-опосредованной активации NK-клеток и увеличивает наноразмерные перестройки. в корковом актине иммунного синапса ADCC NK-клеток (111, 112). В клинических условиях клинические испытания адоптивного переноса расширенных и активированных NK-клеток всегда сочетаются с лечением леналидомидом ({“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT02573896”, “term_id” : “NCT02573896”}} NCT02573896, {“тип”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“текст”: “NCT02280525”, “term_id”: “NCT02280525”}} NCT02280525, {“тип”: “клинический -trial “,” attrs “: {” text “:” NCT02481934 “,” term_id “:” NCT02481934 “}} NCT02481934, {” type “:” клиническое испытание “,” attrs “: {” text “:” NCT02525250 “,” term_id “:” NCT02525250 “}} NCT02525250).

Адоптивный перенос CAR-NK-клеток

В отличие от иммуностимулирующих стратегий, которые включают доставку молекул для помощи NK-клеткам, стратегии генетической модификации непосредственно вызывают изменения в генетике NK-клеток, что приводит к далеко идущим и устойчивым изменениям в клетках ( 113). Среди них все большее внимание привлекает генетическая модификация NK-клеток с помощью конструкций CAR. CAR-NK-клетки могут быть получены из различных источников NK-клеток, включая первичные NK-клетки, линии NK-клеток и HPSC.CAR-NK принял базовую структурную основу CAR-T, то есть химерные антигенные рецепторы, в основном состоящие из внеклеточных, шарнирных, трансмембранных и внутриклеточных доменов, а также методы трансфекции (100, 114, 115). Внеклеточный домен может прочно связываться с ассоциированными с опухолью антигенами, экспрессируемыми на поверхности опухолевых клеток, что определяет специфичность структур CAR. Одноцепочечные вариабельные фрагменты (ScFv) являются наиболее часто используемыми эктодоменами для CAR. Шарнирный домен представляет собой соединительную последовательность между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом, который придает CAR достаточную ориентацию и гибкость для связывания с опухолевыми антигенами и, как ожидается, влияет на активность CAR-NK.Трансмембранный домен находится между шарниром и внутриклеточным сигнальным доменом, включая молекулы CD3ζ, HLA-A2 или CD28. Структура внутриклеточного сигнального домена определяет интенсивность сигнала активации CAR-NK, который содержит иммунорецепторные тирозин-активируемые мотивы (ITAM). Большинство современных эндодоменов CAR содержат область активации, происходящую от CD3ζ, который является наиболее классическим внутриклеточным доменом, включающим три ITAM. Для увеличения пролиферации и цитотоксичности эффекторных клеток, модифицированных CAR, к цитоплазматическому хвосту добавляют рецепторы костимулирующих белков, такие как CD28, 4-1BB, CD134, ICOS.

Первым CAR, используемым в NK-клетках, является слитый рецептор CD4-CD3ζ (CD4ζ), о котором сообщили Tran et al. (116). В этом исследовании химерный рецептор CD4ζ является биохимически и функционально активным и может эффективно направлять человеческие NK-клетки для уничтожения либо ВИЧ-инфицированных CD4 + Т-клеток, либо NK-устойчивых опухолевых клеток, экспрессирующих gp120 in vitro , что указывает на то, что структура CAR может быть успешно экспрессируется на NK-клетках, что приводит к эффективному перенацеливанию (116). Впоследствии было предпринято больше попыток повысить противоопухолевую способность NK-клеток.Uherek et al. модифицировали клетки NK-92 с помощью ErbB2-специфичного CAR и обнаружили, что эти клетки проявляют специфическую цитотоксичность на животных моделях (117). В то время как Imai et al. оценили эффективность первичных NK-клеток, экспрессирующих CD19 CAR, против аутологичных лейкозных клеток in vitro и продемонстрировали, что эти клетки могут обходить ингибирующие сигналы (118). На сегодняшний день клетки CAR-NK были оценены для лечения гематологического рака и солидных опухолей в доклинических исследованиях с многочисленными хорошими результатами [обзор в (32, 36, 100)].На основании этих результатов клиническая трансляция клеток CAR-NK вызвала значительный интерес (см. Подробности текущих клинических испытаний). Хотя терапия CAR-NK все еще проходит клиническую оценку, NK-клетки обладают рядом преимуществ по сравнению с Т-клетками, поскольку они сконструированы для экспрессии CAR и используются для лечения рака. Во-первых, NK-клетки легко изолировать и имеют относительно короткий срок жизни. Следовательно, риск чрезмерного расширения перенесенных CAR-NK-клеток у пациентов относительно невелик.Во-вторых, цитокины, секретируемые NK-клетками, в основном включают IFN-γ и GM-CSF, которые относительно безопаснее, чем те, которые выделяются активированными CAR-T-клетками, например TNF-α и IL-6. В частности, провоспалительные цитокины, продуцируемые CAR-T-клетками, могут вызывать опасный для жизни синдром высвобождения цитокинов (CRS), наиболее частый и тяжелый побочный эффект CAR-T-терапии (119). В-третьих, клетки CAR-NK могут запускать лизис клеток-мишеней как CAR-зависимым, так и CAR-независимым образом, что дополнительно усиливает их убивающую активность.Кроме того, ожидается, что терапия CAR-NK будет менее затратной, учитывая, что NK-клетки могут происходить из PBMC, линий NK-клеток и hPSC. Однако Т-клетки, используемые для терапии CAR-T, должны быть аутологичными (119, 120).

Таблица 1

Текущие клинические испытания клеток CAR-NK.

{ 904 type “:” клиническое испытание “,” attrs “: {” text “:” NCT02839954 “,” term_id “:” NCT02839954 “}} NCT02839954 9009 “:” клиническое испытание “,” attrs “: {” text “:” NCT03415100 “,” term_id “:” NCT03415100 “}} NCT03415100
ClinicalTrials.gov Идентификатор Пробная Статус Фаза Источник NK Сигнал Целевая область CAR18
{“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT02742727”, “term_id”: “NCT02742727”}} NCT02742727 CAR-pNK-клеточный иммунотерапевтический анализ при положительном CD7 лейкемия и лимфома Набор I / II NK-92 CD7 CD28-4-1BB-CD3ζ PersonGen BioTherapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Сучжоу, Цзянсу, Китай
{“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT02892695”, “term_id”: “NCT02892695”}} NCT02892695 PCAR- 119 мостиковой иммунотерапии перед трансплантацией стволовых клеток при лечении пациентов с CD19-положительным лейкозом и лимфомой Рекрутинг I / II NK-92 CD19 CD28-4-1BB-CD3ζ
Исследование, оценивающее эффективность и безопасность pNK-клеток, модифицированных химерными антигенными рецепторами, в MUC1 положительная распространенная рефрактерная или рецидивирующая солидная опухоль Набор I / II NK-92 MUC1
{“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“текст “:” NCT03383978 “,” term_id “:” NCT03383978 “}} NCT03383978 Исследование внутричерепной инъекции NK-92/5.28.z (HER2.taNK) клетки у пациентов с рецидивирующей HER2-положительной глиобластомой Рекрутинг I NK-92 HER2 CD28-CD3ζ Больница Университета Йохана В. Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия
{“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT03056339”, “term_id”: “NCT03056339”}} NCT03056339 Фаза I / II исследования повышения дозы пуповинной крови- производные CAR-сконструированные NK-клетки в сочетании с лимфодеплетирующей химиотерапией у пациентов с рецидивирующими / рефрактерными B-лимфоидными злокачественными новообразованиями Рекрутинг I / II HSPC CD19 CD28- CD3ζ Центр рака Андерса, Техас , Техас, США
{“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT03579927”, “term_id”: “NCT03579927”}} NCT03579927 Комбинированная терапия CAR.CD19- CD28-CD3ζ-2A-iCasp9-IL15-трансдуцированные NK-клетки пуповинной крови, высокодозная химиотерапия и трансплантация стволовых клеток при лечении участников с B-клеточной лимфомой Пока не набираются I / II HSPC CD19 CD28- CD3ζ
{“type”: “клиническое испытание”, “attrs”: {“text”: “NCT01974479”, “term_id”: “NCT01974479”}} NCT01974479 Пилотное исследование перенаправленных инфузий гаплоидентичных естественных клеток-киллеров при остром лимфобластном лейкозе b-линии Суспендированные I Первичные NK-клетки CD19 4-1BB-CD3ζ { Национальный университет системы здравоохранения Сингапура, Сингапур Пилотное исследование CAR-NK-клеток, нацеленных на NKG2D-лиганд, у пациентов с метастатическими солидными опухолями Рекрутинг I Первичные клетки NK NKG2D Третья дочерняя больница Медицинского университета Гуанчжоу Гуанчжоу, Гуандун, Китай

Несмотря на значительные преимущества и большой потенциал, все еще существуют проблемы, которые следует тщательно решать, чтобы не препятствовать клиническому применению CAR- НК терапия.Во-первых, дизайн оптимальной структуры CAR на NK-клетках до сих пор систематически не изучался. Ожидается, что положение CAR-связывающего эпитопа и его расстояние до поверхности CAR-NK-клетки будут влиять на связывание с антигенами, оптимальное формирование иммунных синапсов и активацию CAR-NK-клеток (100). Эмпирические наблюдения на CAR-T-клетках показывают, что структура шарнирных и трансмембранных доменов может влиять на специфичность и активность CAR. Кроме того, существует различная потребность в костимулирующих сигналах между установленной линией клеток NK-92, первичными NK-клетками и NK-клетками, производными hPSC.Исследование с использованием трех видов CD19-специфических клеток NK-92, CARs которых содержат тот же scFv анти-CD19 и шарнирную область, но связаны с человеческими CD3ζ, составными внеклеточными доменами CD28-CD3ζ или 4-1BB-CD3ζ, соответственно, показало, что 4 Основанные на -1BB-CD3ζ CD19-специфические клетки NK-92 были менее эффективны, чем CD3ζ или CD28-CD3ζ в отношении цитотоксичности и продукции цитокинов (121, 122). В то время как для CD19-специфических первичных NK-клеток увеличивалось ex vivo , было показано, что включение костимулирующих доменов 4-1BB или 2B4 вместе с CD3ζ способствует как продукции цитокинов, так и специфическому цитолизу (116, 123).Также следует отметить, что недавно Li et al. экспрессированные конструкции CAR, которые были специально адаптированы для стимуляции активации NK-клеток в NK-клетках, полученных из iPSC. Они показали, что такие конструкции, содержащие трансмембранные домены NKG2D и внутриклеточный 2B4, демонстрируют лучшие характеристики по сравнению с конструкциями CAR, разработанными для Т-клеток (124). Учитывая уникальный репертуар активирующих рецепторов и сигнально-активирующие белки NK-клеток, настройка структур CAR на основе NK будет иметь большой потенциал для улучшения функции CAR-NK.

Во-вторых, хотя оптимизация методов трансдукции за последние несколько десятилетий привела к более высокой эффективности, ретровирусная трансдукция зависит от наличия активного деления клеток, что снижает эффективность этой стратегии с неактивированными NK-клетками. Генотоксичность инсерционного мутагенеза по-прежнему является потенциальной проблемой для безопасности лентивирусных векторов. Кроме того, смерть NK-клеток, связанная с этими процедурами, ограничивает использование NK-клеток, созданных с помощью генной инженерии. Лишь немногие исследования документально подтвердили результаты, касающиеся способности NK-клеток успешно функционировать после вирусной трансдукции.Врожденные свойства, которые характеризуют NK-клетки, могут привести к их снижению эффективности после вирусной трансдукции и апоптоза. Как часть врожденных защитных механизмов иммунной системы, рецепторы распознавания образов (PRR) используются для идентификации молекулярных паттернов, связанных с патогенами (PAMP). Эти процедуры, вероятно, участвуют в запуске каскада клеточных событий, которые приводят к апоптозу NK-клеток после вирусной трансдукции (125). Тем не менее, инженерия РНК дала NK-клеткам более высокую выживаемость и эффективность трансфекции по сравнению с переносом вирусного гена.Одно исследование показало, что NK-клетки, дифференцированные из модифицированных генами гемопоэтических стволовых клеток человека, обладают высокой эффективностью переноса генов и жизнеспособностью CAR-NK-клеток (126).

В-третьих, хотя первичными мишенями CAR являются антигены, экспрессируемые на аномальных клетках, большинство доступных в настоящее время CAR направлены против немутантных аутоантигенов, которые дифференциально экспрессируются на раковых клетках. Это может привести к неспецифическому связыванию CAR с антигенами, экспрессируемыми в нормальных тканях. Следовательно, антиген-положительные здоровые ткани подвержены риску случайного повреждения, вызванного нецелевой активностью.Терапия анти-CD19 Т-клетками при злокачественных новообразованиях В-клеток показала сильную нецелевую токсичность в отношении нормальных CD19-положительных В-клеток (127). Клинических данных для оценки степени нецелевой токсичности CAR-NK нет, но идентификация конкретных опухолевых мишеней является основой для безопасной и эффективной конструкции CAR. Для повышения специфичности и безопасности молекул CAR может быть полезен опыт исследований CAR-T. Эффективное снижение цитотоксичности происходит, если две отдельные структуры или два внеклеточных домена объединяются в тандемную форму с образованием биспецифической молекулы CAR (128–130).Импорт суицидного гена, такого как индуцибельная каспаза-9 (iCasp9) (131), облегчает контроль дозировки активности CAR и обеспечивает другую стратегию снижения токсичности. Похожая концепция была описана с расщепленной конструкцией CAR, которая требует димеризации небольшой молекулы для образования функциональной единицы, что дополнительно увеличивает безопасность (132).

Другая проблема безопасности заключается в том, что инфузированные продукты, полученные из расширенных аллогенных NK-клеток, могут быть загрязнены Т- или В-клетками, что теоретически приводит к РТПХ или посттрансплантационным лимфопролиферативным нарушениям, соответственно.В одном исследовании сообщалось, что донорские активированные IL-15 / 4–1BBL NK-клетки, введенные на ранней стадии после трансплантации стволовых клеток периферической крови, истощенных по гистосовместимости, у пациентов, могут вызвать острую GVHD (133). Они также продемонстрировали, что GVHD очень часто встречается в трансплантатах неродственных доноров и связана с более высоким химеризмом CD3. Этот более поздний аспект относится к созданию оптимального протокола клинической степени очистки активированных CD56 + CD3 NK.Этот протокол может быть более безопасным для пациентов даже в присутствии переливаемых сторонних NK-клеток, модифицированных CAR. В любом случае отрадно отметить, что клинические исследования инфузий гаплоидентичных и полученных из UCB NK-клеток у сотен пациентов как с гематологическими, так и с солидными злокачественными новообразованиями не показали более высокого риска РТПХ (32).

Бесклеточные производные NK-клеток для иммунотерапии рака

В настоящее время в стратегиях иммунотерапии рака доминируют иммунные клетки.Однако существуют ограничения при использовании иммунных клеток непосредственно для лечения рака. Например, иммунные клетки с трудом проникают в солидную опухоль, что приводит к неудовлетворительному терапевтическому эффекту. Более того, стоимость производства, сохранения и транспортировки живых иммунных клеток клинического уровня высока, что затрудняет их широкое применение в клиниках. В последние годы постепенно были предложены и изучены EVs, везикулы наноразмеров, которые естественным образом секретируются многими различными типами клеток, включая NK-клетки, что обеспечивает новое направление бесклеточной иммунотерапии ().

Биология NK EV

EV используются для изображения трех типов везикул с липидной двухслойной мембраной. Экзосомы – это мельчайшие мембранные везикулы (40–100 нм), которые секретируются большинством типов клеток мультивезикулярными тельцами (MVB), сливающимися с клеточной мембраной. Микровезикулы (MV, 50 нм – 1 мкм) представляют собой везикулы, которые немного больше экзосом и отходят наружу от плазматической мембраны. Апоптотические тельца (50 нм – 5 мкм) представляют собой третий вид ЭВ, которые образуются из клеток, подвергающихся апоптозу, путем образования пузырьков наружу.В этом обзоре мы определили «EV» как небольшие внеклеточные везикулы нанометрового размера. На изображениях, полученных с помощью просвечивающей электронной микроскопии, электромобили обычно выглядят как объекты в форме чаши (). EV экспрессируют как общие биомаркеры, такие как белок гена 101 восприимчивости к опухоли (TSG101) и тетраспанины (CD9, CD63, CD81 и CD81), так и специфические белки в зависимости от их клеточного происхождения (134). Например, EV, полученные из человеческих NK-клеток (NK EV), содержат не только типичные NK-маркеры (например, CD56), но также литические белки (например.г., ФасЛ, перфорин).

Характеристики и противоопухолевые механизмы НК ЭВ. (A) Типичная микрофотография просвечивающего электрона, показывающая внеклеточные везикулы, полученные из NK-клеток; масштабная линейка 200 нм. (B) Механизмы, с помощью которых NK EV могут взаимодействовать с клетками-мишенями.

EV участвуют в ряде ключевых клеточных процессов благодаря своей способности переносить биоактивные грузы (т.е. нуклеиновые кислоты, липиды и белки) в клетки-реципиенты или путем активации сигнальных путей в клетках-мишенях (135–138).Следовательно, они рассматриваются как потенциальные альтернативы клеточной терапии, с характеристиками, возможно, превосходящими клетки в некоторых аспектах. Во-первых, поскольку EV имеют наноразмерные размеры, они могут пассивно диффундировать через ткани, отчасти из-за протекающей сосудистой сети опухоли и последующего усиленного удерживающего эффекта (139). Во-вторых, хотя кислая среда солидных опухолей, вызванная гипоксией-ишемией, увеличивает иммуносупрессию (140, 141), полезно способствовать слиянию между EV и опухолевыми клетками (142).В-третьих, эти «нано-пули» обладают преимуществом в их способности преодолевать биологические барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер (BBB) ​​и гематоэнцефалический барьер (BTB), что обеспечивает совершенно иную методологию по сравнению с методологией на основе клеток. подход (143–145). Более того, электромобили стабильны при -80 ° C и сохраняются до 12 месяцев (146). Это упрощает хранение электромобилей и делает их доступными в качестве «готовых» материалов.

Противоопухолевая активность NK EV

Первое исследование NK EV было проведено Lugini et al.(147). В этом исследовании было продемонстрировано, что изолированные NK-EV из очищенной культуры NK-клеток оказывают цитотоксическое действие на злокачественные гематологические клеточные линии, но не на клетки солидных опухолей, такие как карцинома молочной железы SKBR3 (147). Позже активированные NK EV, полученные в результате крупномасштабного выделения in vitro, увеличившего NK-клеток, показали значительные цитотоксические эффекты на ряде линий раковых клеток, включая ALL, нейробластомы и карциномы молочной железы (146). Эти данные предполагают, что активированные NK-клетки могут продуцировать EV с более высокой иммунной активностью по сравнению с наивными NK-клетками.Противоопухолевый эффект NK EV подтверждается двумя недавними исследованиями in vivo . В одном исследовании NK EV выделяли ультрацентрифугированием в градиенте плотности из клеток NK-92, а затем вводили в меланому локально на мышиной модели. В результате прогрессирование опухолей, обработанных ЭВ NK-92, было значительно замедлено (148). В другом исследовании, проведенном той же группой, НК-ЭВ, приготовленные таким же образом, были использованы для лечения опухолей ксенотрансплантата глиобластомы. Внутривенное введение NK EV не только значительно подавляло рост опухоли, но также проявляло опухолеспецифическое накопление и способность пересекать ГЭБ.Обнадеживает то, что это опухолево-специфическое накопление сохранялось более 5 дней (149).

Fais et al. сообщили, что NK EV могут запускать гибель клеток-мишеней с помощью двух различных механизмов (137, 150), включая взаимодействия лиганд-рецептор (151, 152) и слияние плазматической мембраны (142) (). Более того, каспазы, инициатор и исполнитель, участвовали в убийстве клеток, опосредованном NK EV. Wen et al. экстраполировано, что механизмы киллинга NK EV можно разделить на три группы, включая перфорин-гранзим-опосредованное проникновение, опосредованное рецептором-лигандом взаимодействие и опосредованное гранулизином действие (153).Однако лежащие в основе механизмы специфического уничтожения опухолевых клеток, опосредованного NK EV, остаются неясными. NK-клетки распознают клетки-мишени для уничтожения по механизму «самопропуска», но нет никаких доказательств того, что EV могут активировать сигнальные пути, как это делают живые иммунные клетки. Одна из возможных причин, по которой NK EV могут иметь направленный эффект, заключается в том, что кислое микроокружение солидных опухолей может способствовать слиянию экзосом. В исследовании Lugini et al. Упомянутое выше, секреция NK EV была стабильной и оказывала убивающий эффект на активированные клетки PBMC in vitro , предполагая, что NK EV ведут себя как большой «резервуар» для регулирования баланса иммунных клеток (147).Этот механизм до сих пор не получил четкого определения. Однако его потенциал для применения при аутоиммунных заболеваниях, возникающих в результате чрезмерной активации иммунной системы, очевиден, а также его потенциальное использование для устранения побочных эффектов иммунотерапии, таких как цитокиновые бури, также заслуживает изучения.

Примечательно, что даже несмотря на то, что их противоопухолевая активность была продемонстрирована in vitro и in vivo , NK EV не влияют на нормальные клетки (147). Кроме того, из-за защитного барьера, обеспечиваемого естественной структурой везикул, NK EV могут быть использованы в качестве многообещающей системы доставки, которая может быть загружена различными терапевтическими веществами, например.г., гены и белки. В частности, поверхность EV-мембраны может быть дополнительно модифицирована другими функциональными группами.

Оптимальное увеличение Ex-vivo (EvE) пуповинной крови (CB) естественных киллеров (NK), цитотоксичность NK и экспрессия рецептора NK (NKR): потенциал для адоптивной клеточной иммунотерапии CB (ACI). | Кровь

Подмножества NK

CD56 + демонстрируют дифференциальные профили рецепторов, включая киллер-Ig-подобные рецепторы (KIR), C-лектин (NKG2) и рецепторы естественной цитотоксичности (NCR), участвующие в распознавании опухолевых мишеней, которые могут играть роль в ACI для злокачественных новообразований ( Farag et al., , Blood , 2002).Активация NK-клеток и NK-опосредованный цитолиз индуцируются несколькими запускающими рецепторами, такими как NCR (например, NKp44, NKp46) и поверхностными рецепторами NKG2, такими как NKG2D (Moretta, et al, Curr Opinion in Immunol , 2004; Marcenaro et al, Eur J Иммунол , 2003). UCB ограничен отсутствием доступных донорских эффекторных клеток (NK, CTL, LAK и NKT-клетки) для инфузии после трансплантации для лечения гематологического рецидива с минимальной остаточной резистентностью и / или PTLD (Barker et al, Blood, 2001; Locatelli , et al Blood, 1999).Мы продемонстрировали способность EvE CB в краткосрочной культуре (48 часов) с IL-2, IL-7, IL-12 и анти-CD3 (ABCY), криоконсервированными, размороженными, повторно криоконсервированными, повторно размороженными и размороженными ex vivo (CTCTE) со значительными увеличение CD3 /16 + /56 + светлые / тусклые подмножества , экспрессирующие KIR3DL1, KIR2DL1 / S1, KIR2DL2 и CD94 / NKG2A (Ayello / Cairo et al, BBMT , 25a, 2004). В этом исследовании мы сравнивали краткосрочные культуры (48 часов) с пролонгированными культурами (от 4 до 10 дней) на рост, созревание и экспрессию NCR, NKG2, KIR и цитолитические механизмы в ранее криоконсервированных CB, которые были TCTE.CB был заморожен и разморожен методом NHLBI / COBLT. (Курцберг / Каир, Transfuison , 2005). Повторно размороженные неприлипающие клетки CB культивировали (2-10 дней) в бессывороточной среде отдельно или с анти-CD3 (50 нг / мл, IL-2 (5 нг / мл), IL-7 (10 нг / мл) и IL). -12 (10 нг / мл) (ABCY). Экспрессию рецептора NK (CD94, NKG2C, NKG2D, NKp44, NKp46, KIR2DS4) и внутриклеточную активность перфорина и гранзима B определяли методом проточной цитометрии. Цитотоксичность NK и LAK определяли по высвобождению европия. Значительное увеличение было замечено в NK, активирующем KIR2DS4 на 10 день по сравнению со 2 в ABCY, как в CD3 /16 + /56 + тусклые и светлые поднаборы (16.9 ± 0,4 против 2,1 ± 0,2% и 22,3 ± 0,3 против 0,9 ± 0,2%, p <0,001 соответственно). С-лектин-активирующий рецептор CD94 / NKG2D был увеличен на 7-й день по сравнению со 2-м днем ​​после ABCY EvE (41,4 ± 0,43 против 23,7 ± 2,0%, p <0,001). Значительное увеличение было замечено в подгруппе NK (CD3 /16 + /56 + dim ) KIR3DL1 на 10 день по сравнению со 2 (38,3 ± 2,8 против 18,9 ± 6,3 7%, p <0,05). Напротив, экспрессия NCR в подмножестве CD3 /16 + /56 + dim NKp44 была значительно снижена на 10-й день по сравнению со 2-м днем ​​у EvE с ABCY (15.2 ± 0,7 против 27,2 ± 0,7%, p <0,001). Значительное снижение было замечено в экспрессии CD3 /16 + /56 + dim NKp46 на следующий день 10 по сравнению со 2 (8,5 ± 0,2 против 23,5 ± 1,2%, p <0,001). Экспрессия перфорина продемонстрировала значительное снижение ABCY на 10 день по сравнению со 2 (55,7 ± 1,8 против 84,3 ± 1,3%, p <0,001), но повышение уровня гранзима B со 2 по 10 день (25,8 ± 1,8 против 45,1 ± 1,7%, p < 0,0001). Значительное увеличение цитотоксичности CB NK и LAK наблюдалось в ABCY на 10-й день по сравнению со 2-м (NK: 71.5 ± 1,6 против 53,8 ± 10,3%, p <0,001; LAK: 63,2 ± 0,24 против 31,8 ± 1,8%, p <0,001). Таким образом, CB MNC можно разморозить во время трансплантации CB, повторно консервировать, повторно разморозить и позднее EvE и активировать в течение 7-10 дней для получения жизнеспособных подмножеств NK. EvE в ABCY через 10 дней давал повышенную экспрессию NK KAR (CD56 + тусклый и светлый ) и экспрессию гранзима B, но снижал экспрессию NK C-лектина CD94 / NKG2D, NCR NKp46 и NKp48 и перфорина.

Свиньи CD8αdim / -NKp46high NK-клетки находятся в высокоактивированном состоянии | Ветеринарные исследования

  • 1.

    Герберман Р.Б., Нанн М.Э., Холден Х.Т., Лаврин Д.Х.: Естественная цитотоксическая реактивность лимфоидных клеток мыши против сингенных и аллогенных опухолей. II. Характеристика эффекторных клеток. Int J Cancer. 1975, 16: 230-239. 10.1002 / ijc.2

    0205.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 2.

    Kiessling R, Klein E, Pross H, Wigzell H: «Естественные» клетки-киллеры у мышей. II. Цитотоксические клетки со специфичностью к клеткам лейкемии Молони мышей.Характеристики клетки-киллера. Eur J Immunol. 1975, 5: 117-121. 10.1002 / eji.1830050209.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 3.

    Fauriat C, Long EO, Ljunggren HG, Bryceson YT: Регулирование продукции цитокинов и хемокинов человеческими NK-клетками путем распознавания клеток-мишеней. Кровь. 2010, 115: 2167-2176. 10.1182 / кровь-2009-08-238469.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 4.

    Lodoen MB, Lanier LL: Естественные клетки-киллеры как начальная защита от патогенов. Curr Opin Immunol. 2006, 18: 391-398. 10.1016 / j.coi.2006.05.002.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 5.

    Inngjerdingen M, Kveberg L, Naper C, Vaage JT: Подмножества естественных клеток-киллеров у человека и грызунов. Тканевые антигены. 2011, 78: 81-88. 10.1111 / j.1399-0039.2011.01714.x.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 6.

    Купер М.А., Фенигер Т.А., Тернер С.К., Чен К.С., Гахери Б.А., Гаюр Т., Карсон В.Е., Калиджури М.А.: Естественные клетки-киллеры человека: уникальная врожденная иммунорегуляторная роль для субпопуляции CD56 (светлый). Кровь. 2001, 97: 3146-3151. 10.1182 / blood.V97.10.3146.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 7.

    Jacobs R, Hintzen G, Kemper A, Beul K, Kempf S, Behrens G, Sykora KW, Schmidt RE: клетки CD56bright отличаются по репертуару KIR и цитотоксическим характеристикам от NK-клеток CD56dim.Eur J Immunol. 2001, 31: 3121-3127. 10.1002 / 1521-4141 (2001010) 31:10 <3121 :: AID-IMMU3121> 3.0.CO; 2-4.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 8.

    Fu B, Wang F, Sun R, Ling B, Tian Z, Wei H: CD11b и CD27 отражают различную популяционную и функциональную специализацию естественных киллерных клеток человека. Иммунология. 2011, 133: 350-359. 10.1111 / j.1365-2567.2011.03446.x.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 9.

    Hayakawa Y, Smyth MJ: CD27 расщепляет зрелые NK-клетки на две подгруппы с разной реактивностью и миграционной способностью. J Immunol. 2006, 176: 1517-1524.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 10.

    Marquardt N, Wilk E, Pokoyski C., Schmidt RE, Jacobs R: NK-клетки CXCR3 + CD27bright мыши напоминают популяцию NK-клеток CD56bright человека. Eur J Immunol. 2010, 40: 1428-1439. 10.1002 / eji.200940056.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 11.

    Pescovitz MD, Lowman MA, Sachs DH: Экспрессия антигенов, ассоциированных с Т-клетками, естественными клетками-киллерами свиней. Иммунология. 1988, 65: 267-271.

    PubMed Central CAS PubMed Google Scholar

  • 12.

    Заалмюллер А., Хирт В., Маурер С., Вейланд Е.: Дискриминация между двумя подмножествами цитолитических Т-лимфоцитов свиней по экспрессии антигена CD5. Иммунология. 1994, 81: 578-583.

    PubMed Central PubMed Google Scholar

  • 13.

    Denyer MS, Wileman TE, Stirling CM, Zuber B, Takamatsu HH: Экспрессия перфорина может определять субпопуляции CD8-положительных лимфоцитов у свиней, позволяя фенотипический и функциональный анализ естественных киллеров, цитотоксических T, естественных киллеров T и цитотоксических T-клеток без ограничения MHC . Вет Иммунол Иммунопатол. 2006, 110: 279-292. 10.1016 / j.vetimm.2005.10.005.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 14.

    Ричерсон Дж. Т., Мисфельдт М. Л.: Среда хозяина как фактор модуляции активности естественных клеток-киллеров свиней.Вет Иммунол Иммунопатол. 1989, 23: 309-319. 10.1016 / 0165-2427 (89)-8.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 15.

    Worliczek HL, Buggelsheim M, Alexandrowicz R, Witter K, Schmidt P, Gerner W., Saalmüller A, Joachim A: Изменения в популяции лимфоцитов у поросят-сосунов во время первичных инфекций Isospora suis. Parasite Immunol. 2010, 32: 232-244. 10.1111 / j.1365-3024.2009.01184.x.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 16.

    Поли Т., Кениг М., Тиль Х. Дж., Заальмюллер А: Заражение вирусом классической чумы свиней: влияние на фенотип и иммунную реакцию Т-лимфоцитов свиней. J Gen Virol. 1998, 79: 31-40.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 17.

    Toka FN, Nfon C, Dawson H, Golde WT: Дисфункция естественных клеток-киллеров во время острой инфекции вирусом ящура. Clin Vaccine Immunol. 2009, 16: 1738-1749. 10.1128 / CVI.00280-09.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 18.

    Ренукарадхья Г.Дж., Алексеев К., Юнг К., Фанг Й., Саиф Л.Дж .: Иммуносупрессия, вызванная вирусом репродуктивного и респираторного синдрома свиней, усугубляет воспалительный ответ на респираторный коронавирус свиней у свиней. Viral Immunol. 2010, 23: 457-466. 10.1089 / vim.2010.0051.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 19.

    Manickam C, Dwivedi V, Patterson R, Papenfuss T, Renukaradhya GJ: Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней вызывает выраженные иммуномодулирующие реакции в тканях слизистой оболочки у свиней, инфицированных родительским вакцинным штаммом VR2332. Vet Microbiol. 2013, 162: 68-77. 10.1016 / j.vetmic.2012.08.021.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 20.

    Маир К.Х., Эсслер С.Е., Патцл М., Сторсет А.К., Заальмюллер А., Гернер В. Экспрессия NKp46 позволяет различать NK-клетки свиней с различными функциональными свойствами.Eur J Immunol. 2012, 42: 1261-1271. 10.1002 / eji.201141989.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 21.

    Halfteck GG, Elboim M, Gur C, Achdout H, Ghadially H, Mandelboim O: усиление роста опухолей лимфомы in vivo в отсутствие NK-активирующего рецептора NKp46 / NCR1. J Immunol. 2009, 182: 2221-2230. 10.4049 / jimmunol.0801878.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 22.

    Гласнер А., Гадиалли Х., Гур С., Станецкий Н., Цукерман П., Энк Дж., Мандельбойм О: Распознавание и предотвращение метастазов опухоли с помощью рецептора NK NKp46 / NCR1. J Immunol. 2012, 188: 2509-2515. 10.4049 / jimmunol.1102461.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 23.

    Krämer B, Körner C, Kebschull M, Glässner A, Eisenhardt M, Nischalke HD, Alexander M, Sauerbruch T, Spengler U, Nattermann J: Выражение естественного киллера p46 (High) определяет подмножество естественных киллеров, которые потенциально участвует в контроле репликации вируса гепатита С и модуляции фиброза печени.Гепатология. 2012, 56: 1201-1213.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 24.

    Газит Р., Груда Р., Эльбойм М., Арнон Т.И., Кац Г., Ахдаут Х., Ханна Дж., Кимрон Ю., Ландау Г., Гринбаум Е., Закай-Ронес З., Поргадор А., Мандельбойм О: смертельная инфекция гриппа. в отсутствие гена рецептора естественных клеток-киллеров Ncr1. Nat Immunol. 2006, 7: 517-523.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 25.

    Ахдаут Х, Менингер Т, Хирш С., Гласнер А, Бар-Он Y, Гур С, Поргадор А, Мендельсон М, Мандельбойм М, Мандельбойм О: Убийство вирусов птичьего и свиного гриппа естественными клетками-киллерами. J Virol. 2010, 84: 3993-4001. 10.1128 / JVI.02289-09.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 26.

    Jost S, Reardon J, Peterson E, Poole D, Bosch R, Alter G, Altfeld M: увеличение количества 2B4 + естественных киллеров (NK) и уменьшение NKp46 + NK-клеток в ответ на грипп.Иммунология. 2011, 132: 516-526. 10.1111 / j.1365-2567.2010.03394.x.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 27.

    Сивори С., Витале М., Морелли Л., Сансеверино Л., Аугульяро Р., Боттино С., Моретта Л., Моретта А: P46, новая природная специфическая для клеток-киллеров поверхностная молекула, которая опосредует активацию клеток. J Exp Med. 1997, 186: 1129-1136. 10.1084 / jem.186.7.1129.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 28.

    Пессино А., Сивори С., Боттино С., Маласпина А., Морелли Л., Моретта Л., Биассони Р., Моретта А. Молекулярное клонирование NKp46: нового члена суперсемейства иммуноглобулинов, участвующего в запуске естественной цитотоксичности. J Exp Med. 1998, 188: 953-960. 10.1084 / jem.188.5.953.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 29.

    De Maria A, Biassoni R, Fogli M, Rizzi M, Cantoni C, Costa P, Conte R, Mavilio D, Ensoli B, Cafaro A, Moretta A, Moretta L: идентификация, молекулярное клонирование и функциональная характеристика рецепторов естественной цитотоксичности NKp46 и NKp30 в NK-клетках Macaca fascicularis.Eur J Immunol. 2001, 31: 3546-3556. 10.1002 / 1521-4141 (200112) 31:12 <3546 :: AID-IMMU3546> 3.0.CO; 2-W.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 30.

    Walzer T, Bléry M, Chaix J, Fuseri N, Chasson L, Robbins SH, Jaeger S, André P, Gauthier L, Daniel L, Chemin K, Morel Y, Dalod M, Imbert J, Pierres M. , Moretta A, Romagné F, Vivier E: Идентификация, активация и селективная абляция in vivo NK-клеток мыши через NKp46.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007, 104: 3384-3389. 10.1073 / pnas.0609692104.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 31.

    Биассони Р., Пессино А., Боттино С., Пенде Д., Моретта Л., Моретта А.: мышиный гомолог человеческого NKp46, запускающего рецептора, участвующего в индукции естественной цитотоксичности. Eur J Immunol. 1999, 29: 1014-1020. 10.1002 / (SICI) 1521-4141 (199903) 29:03 <1014 :: AID-IMMU1014> 3.0.CO; 2-O.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 32.

    Westgaard IH, Berg SF, Vaage JT, Wang LL, Yokoyama WM, Dissen E, Fossum S. Крысиный NKp46 активирует цитотоксичность естественных клеток-киллеров и связан с FcεRIγ и CD3ζ. J Leukoc Biol. 2004, 76: 1200-1206. 10.1189 / jlb.0

    8.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 33.

    Сторсет А.К., Кульберг С., Берг И., Бойсен П., Хоуп Дж. К., Диссен Е.: NKp46 определяет подмножество лейкоцитов крупного рогатого скота с характеристиками естественных клеток-киллеров.Eur J Immunol. 2004, 34: 669-676. 10.1002 / eji.200324504.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 34.

    Коннелли Т., Сторсет А.К., Пембертон А., Мачью Н., Браун Дж., Лунд Х., Моррисон И.В.: NKp46 определяет клетки овцы, которые имеют характеристики, соответствующие NK-клеткам. Vet Res. 2011, 42: 37-10.1186 / 1297-9716-42-37.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 35.

    Noronha LE, Harman RM, Wagner B, Antczak DF: Создание и характеристика моноклональных антител к лошадиному NKp46. Вет Иммунол Иммунопатол. 2012, 147: 60-68. 10.1016 / j.vetimm.2012.04.003.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 36.

    Saalmüller A, Jonjic S, Bühring HJ, Reddehase MJ, Koszinowski UH: Моноклональные антитела, реагирующие с лимфоцитами свиней. II. Обнаружение антигена на покоящихся Т-клетках, сниженных после активации.J Immunol. 1987, 138: 1852-1857.

    PubMed Google Scholar

  • 37.

    Reutner K, Leitner J, Essler SE, Witter K, Patzl M, Steinberger P, Saalmüller A, Gerner W: CD27 свиньи: идентификация, экспрессия и функциональные аспекты в субпопуляциях лимфоцитов у свиней. Dev Comp Immunol. 2012, 38: 321-331. 10.1016 / j.dci.2012.06.011.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 38.

    Saalmüller A: Характеристика антигенов дифференцировки лейкоцитов свиней. Иммунол сегодня. 1996, 17: 352-354. 10.1016 / S0167-5699 (96) -Х.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 39.

    Холмс К., Ланц Л.М., Фаулкс Б.Дж., Шмид И., Джорджи Дж. В. Подготовка клеток и реагентов для проточной цитометрии. Curr Protoc Immunol. Отредактировано: Coligan JE, Bierer BE, Margulies DH, Shevach EM, Stober W. 2001, Somerset, NJ: Wiley, Chapter 5, pp Unit 3

    Google Scholar

  • 40.

    Гернер В., Кезер Т., Пинтарик М., Гройсс С., Заальмюллер А.: Обнаружение внутриклеточных антигенов в свиней РВМС с помощью проточной цитометрии: сравнение реагентов фиксации и проницаемости. Вет Иммунол Иммунопатол. 2008, 121: 251-259. 10.1016 / j.vetimm.2007.09.019.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 41.

    Al-Hubeshy ZB, Coleman A, Nelson M, Goodier MR: экспресс-метод оценки функции естественных клеток-киллеров после множественного перекрестного связывания рецепторов.J Immunol Methods. 2011, 366: 52-59. 10.1016 / j.jim.2011.01.007.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 42.

    Käser T, Müllebner A, Hartl RT, Essler SE, Saalmüller A, Catharina Duvigneau J: Свиньи Т-хелперные и регуляторные Т-клетки демонстрируют универсальные возможности экспрессии мРНК для цитокинов и костимулирующих молекул. Цитокин. 2012, 60: 400-409. 10.1016 / j.cyto.2012.07.007.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 43.

    Розен С, Скалецкий Х: Primer3 в WWW для обычных пользователей и программистов-биологов. Методы Мол биол. 2000, 132: 365-386.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 44.

    Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I., Cutcutache I, Rozen S, Madden TL: Primer-BLAST: инструмент для создания специфичных для мишени праймеров для полимеразной цепной реакции. BMC Bioinformatics. 2012, 13: 134-10.1186 / 1471-2105-13-134.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 45.

    Duvigneau JC, Hartl RT, Groiss S, Gemeiner M: количественная одновременная мультиплексная ПЦР в реальном времени для обнаружения цитокинов свиней. J Immunol Methods. 2005, 306: 16-27. 10.1016 / j.jim.2005.06.021.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 46.

    Vossen MT, Matmati M, Hertoghs KM, Baars PA, Gent MR, Leclercq G, Hamann J, Kuijpers TW, van Lier RA: CD27 определяет фенотипически и функционально различные подмножества NK-клеток человека.J Immunol. 2008, 180: 3739-3745.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 47.

    Силва А., Эндрюс Д.М., Брукс А.Г., Смит М.Дж., Хаякава Ю.Применение CD27 в качестве маркера для различения подмножеств человеческих NK-клеток. Int Immunol. 2008, 20: 625-630. 10.1093 / intimm / dxn022.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 48.

    Sivori S, Pende D, Bottino C, Marcenaro E, Pessino A, Biassoni R, Moretta L, Moretta A: NKp46 является основным запускающим рецептором, участвующим в естественной цитотоксичности свежих или культивируемых NK-клеток человека.Корреляция между поверхностной плотностью NKp46 и естественной цитотоксичностью в отношении аутологичных, аллогенных или ксеногенных клеток-мишеней. Eur J Immunol. 1999, 29: 1656-1666. 10.1002 / (SICI) 1521-4141 (199905) 29:05 <1656 :: AID-IMMU1656> 3.0.CO; 2-1.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 49.

    Yu J, Mao HC, Wei M, Hughes T, Zhang J, Park IK, Liu S, McClory S, Marcucci G, Trotta R, Caligiuri MA: поверхностная плотность CD94 определяет функциональный посредник между CD56bright и Подмножества человеческих NK-клеток CD56dim.Кровь. 2010, 115: 274-281. 10.1182 / кровь-2009-04-215491.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 50.

    Витале М., Циммер Дж., Кастрикони Р., Ханау Д., Донато Л., Боттино С., Моретта Л., де ла Саль Х., Моретта А. Анализ естественных клеток-киллеров у пациентов с дефицитом ТАП2: выражение функционального запуска рецепторы и доказательства существования ингибирующих рецепторов, которые предотвращают лизис нормальных аутологичных клеток.Кровь. 2002, 99: 1723-1729. 10.1182 / blood.V99.5.1723.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 51.

    Chiossone L, Chaix J, Fuseri N, Roth C, Vivier E, Walzer T: Созревание NK-клеток мыши представляет собой 4-этапную программу развития. Кровь. 2009, 113: 5488-5496. 10.1182 / кровь-2008-10-187179.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 52.

    Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO: синергия между рецепторами на покоящихся NK-клетках для активации естественной цитотоксичности и секреции цитокинов.Кровь. 2006, 107: 159-166. 10.1182 / кровь-2005-04-1351.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 53.

    Raulet DH: роль иммунорецептора NKG2D и его лигандов. Nat Rev Immunol. 2003, 3: 781-790. 10.1038 / nri1199.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 54.

    Martín-Fontecha A, Thomsen LL, Brett S, Gerard C, Lipp M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Индуцированное привлечение NK-клеток в лимфатические узлы обеспечивает IFN-γ для прайминга T (H) 1.Nat Immunol. 2004, 5: 1260-1265. 10.1038 / ni1138.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 55.

    Wendel M, Galani IE, Suri-Payer E, Cerwenka A: Накопление естественных клеток-киллеров в опухолях зависит от лигандов IFN-γ и CXCR3. Cancer Res. 2008, 68: 8437-8445. 10.1158 / 0008-5472.CAN-08-1440.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 56.

    Gregoiré C, Cognet C, Chasson L, Coupet CA, Dalod M, Reboldi A, Marvel J, Sallusto F, Vivier E, Walzer T: Внутри селезеночный трафик естественных клеток-киллеров перенаправляется хемокинами при воспалении.Eur J Immunol. 2008, 38: 2076-2084. 10.1002 / eji.200838550.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 57.

    Wald O, Weiss ID, Wald H, Shoham H, Bar-Shavit Y, Beider K, Galun E, Weiss L, Flaishon L, Shachar I, Nagler A, Lu B, Gerard C, Gao JL, Мишани Э., Фарбер Дж., Пелед А: IFN-γ действует на Т-клетки, вызывая мобилизацию и накопление NK-клеток в органах-мишенях. J Immunol. 2006, 176: 4716-4729.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • LEFROY BROOKS M2-2303-NK FLEETWOOD 34 5/8 ДЮЙМОВ НАПОЛЬНЫЙ НАПОЛНИТЕЛЬ ДЛЯ НАПОЛЬНОГО ОТВЕРСТИЯ С МЕТАЛЛИЧЕСКИМ РУЧНЫМ УПРАВЛЕНИЕМ И КРЕСТОВИНОЙ…

    Большая раковина

    Моя семья и я только что завершили полный ремонт кухни, и у меня появилось несколько отличных новинок, но я должен сказать, что эта раковина может быть моей любимой (как и у моего мужа и сына). Он глубокий, но не слишком глубокий. Очень вместительно и стильно. Я очень рекомендую его всем, кто хочет большую раковину из нержавеющей стали. Я могу поместить в него большие кастрюли, несколько тарелок, стаканов и т. Д. Я могу даже полировать в нем большие серебряные предметы.

    – Эми М.

    Быстрая доставка и вежливое обслуживание

    Только что получил свой Toto Neorest 550h. Удивительный туалет. Цены от Kitchen & Bath Authority были непревзойденными и значительно ниже, чем я цитировался в другом месте.

    – ФранкК-64131

    Обслуживание клиентов потрясающее!

    Уже несколько лет я получаю от kbauthority отличный сервис и качество, всегда дружелюбный персонал по продажам и быстрая доставка

    – Miked998

    Лучшая цена на быструю доставку товаров delta!

    Я и мой муж заказали продукты Delta для двух ремонтов ванных комнат, которые мы проводим, продукты прибыли примерно через неделю в очень хорошей упаковке, и я получила лучшую цену в Интернете, так что очень-очень довольна !!! определенно рекомендую эту компанию другим для любого проекта реконструкции дома

    – Энн

    Отличное обслуживание, быстрые сроки доставки и как описано.

    Мы заказали две душевые двери, обе пришли примерно через неделю, водитель разрешил нам осмотреть продукцию, которая была в хорошем состоянии. В целом хорошие впечатления от покупок рекомендую эту компанию.

    – RRWI

    Отличное место

    Получил именно то, что мне нужно, и очень быстро полюбил это место. Никогда не было проблем ни с одним заказом.

    – Bubba1231

    Как раз то, что мне нужно

    Я искал 12-дюймовые полотенцесушители, а во всех магазинах города были только 18-дюймовые штанги.Я зашел в Интернет и нашел именно то, что мне нужно, на KBAuthority.com, полотенцесушитель прибыл по почте менее чем за 1 неделю, и это именно то, что я искал.

    – Линдаквид

    Зеркала Robern AIO

    Мы искали зеркала Роберна. У КБ Власти они были за полцены. Заказ был легким, и доставка была вовремя, в течение 2 недель. Мы несколько раз разговаривали со службой поддержки клиентов, чтобы убедиться, что заказ продвигается, поскольку возможность отслеживать продвижение в режиме онлайн была несколько ограничена.Они всегда были очень полезны.

    – замки

    2-я довольная покупка у KBA

    Некоторое время назад я заказал дверь для душа и попросил помощи у службы поддержки клиентов, которая сработала хорошо. Я заказал дверь для ванны / душа на прошлой неделе, и она прибыла очень быстро и хорошо упакована. У меня определенно есть KBA в моем списке для будущих покупок.

    – быть под рукой

    Мгновенное горячее, Мгновенное обслуживание

    Наш быстрорастворимый горячий напиток Franke уступил нам через 16 лет, и нам пришлось покупать новый.Всюду искали тот, который мы искали, и нашли его на сайте KBA по лучшей цене. Мало того, что цена была подходящей, но и обслуживание и быстрая доставка имели значение. Я сохраню их в «Избранном» на всякий случай.

    – Джуди

    Отличная цена и сервис

    Отличное обслуживание клиентов, быстрый заказ и получение, как и было обещано.

    – ArisM

    отличная цена и сервис

    Изначально у меня были проблемы с размещением заказа, однако с помощью чата мои проблемы были быстро решены.Я всегда тщательно изучаю цену и доставку перед покупкой. KBAuthority был лучшим. Упаковка меня очень впечатлила. Моя раковина не могла быть повреждена из-за неправильного обращения.

    – rpmartinsen

    Отличный сервис при покупке мойки.

    Отличный выбор по отличным ценам. Заказал мойку Franke со вставками. Доставка менее чем за 2 недели. Покупкой доволен. Нет претензий.

    – сбтелеки

    Самые низкие цены на Hansgrohe

    Я заказал в КБ сантехнику на 1000 долларов.Мне понравился интерактивный чат, чтобы подтвердить, что я заказал все нужные детали. Послепродажное общение было так себе – мне пришлось позвонить, чтобы подтвердить дату отгрузки – но, вероятно, немного лучше, чем ожидалось, учитывая цены на 5% или более ниже, чем у конкурентов.

    – покупатель ванны

    Лучшая цена на душевые кабины Delta

    Поиск и обнаружил, что это лучшая цена на венецианский бронзовый душевой набор Delta для ремонта ванной комнаты, даже со скромной платой за обработку (которая, вероятно, была меньше, чем фактическая стоимость доставки).Нет проблем с упаковкой или сроками доставки.

    – pas_duh_2

    Отличные цены и обслуживание клиентов

    Заказал кучу вещей Hansgrohe для нашего нового дома. Их цены были очень конкурентоспособными. Мы внесли несколько изменений на протяжении всего процесса, и обслуживание клиентов было очень любезным.

    – стежки

    Отличное общение – Лучшие цены – Быстрая доставка

    Заказал умывальник, раковину, смеситель и другие аксессуары.У них были лучшие цены среди онлайн-продавцов и отсутствие налога с продаж на заказ из-за доставки за пределы штата. По моим оценкам, я сэкономлю не менее 300 долларов с помощью KBAuthority. Моя единственная проблема была с ИБП – вес содержимого был слишком велик для содержимого, и при доставке коробка была открыта – никаких повреждений содержимого, но проблема.

    – катбла

    Быстрая доставка

    Доставка прошла быстро. Я также отправил электронное письмо с вопросом и получил ответ в тот же день.Я забыл указать код купона и спросил, можно ли его еще использовать. Представитель применил мой купон и скорректировал цену. В целом очень хорошие впечатления от покупок Спасибо!

    – Геленж

    Второй заказ, такой же отличный сервис

    Это был мой второй заказ в этой компании, все пришло вовремя и хорошо упаковано! У меня есть еще одна переделка ванной комнаты, и я буду пользоваться сайтом kauthority.com в третий раз.

    – HQ

    Верующий

    Я не решался сделать такую ​​крупную покупку (двери для душа) в Интернете, но, учитывая, что тот же продукт был доступен в нескольких розничных магазинах, которым я доверяю НАМНОГО БОЛЬШЕ, я перевел дух и был уверен, что это сработает. Защита со стороны Google помогла мне совершить прыжок. Я рад, что сделал. Прибыл быстро, все детали не повреждены, а готовый продукт идеально смотрится в моей ванной. Я верю в KBAuthority и теперь постоянный клиент.

    – ChezD

    Этот товар не найден | Росс Видео | nk-md34 /

    Связаться с Continuant

    Закрыть


    Continuant
    5050 20th St. E.
    Fife, WA 98424
    USA
    (800) 394-0308
    https://www.continuant.com/

    Требуется установка United StatesAfghanistanAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntarcticaAntigua и BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia и HerzegovinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBrunei DarussalamBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCanadaCape VerdeCayman IslandsCentral африканских RepublicChadChileChinaChristmas IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongoCook IslandsCosta RicaCote д’Ивуар (Берег Слоновой Кости) Хорватия (Hrvatska) CubaCyprusCzech RepublicCzechoslovakia (бывший) DenmarkDjiboutiDominicaDominican RepublicEast TimorEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial GuineaEritreaEstoniaEthiopiaFalkland (Мальвинские) острова Фарерские ОстроваФиджиФинляндияФранцияФранция, МетрополитенФранцузская ГвианаФранцузская ПолинезияФранцузские Южные ТерриторииГабонГамбияГрузияГерманияГанаГибралтарВеликобритания (Великобритания) ГрецияГренландияГренадаГваделупаГуамГватемалаГвинеяГвина-БисауГайанаГайти МакДонаХерд и Херд л.д. IslandsHondurasHong KongHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsraelItalyJamaicaJapanJerseyJordanKazakhstanKenyaKiribatiKorea (Северная) Корея (Южная) KuwaitKyrgyzstanLaosLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacauMacedoniaMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesiaMoldovaMonacoMongoliaMontserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNepalNetherlandsNetherlands AntillesNeutral ZoneNew CaledoniaNew Zealand (Aotearoa) NicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPanamaPapua Новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairnPolandPortugalPuerto RicoQatarReunionRomaniaRussian FederationRwandaS.Джорджия и Южные Сэндвичевы острова. Сент-Китс и НевисСент-ЛюсияСент-Винсент и ГренадиныСамоаСан-МариноСао-Томе и ПринсипиСаудовская АравияСенегалСейшельские островаСьерра-ЛеонеСингапурСловацкая РеспубликаСловенияСоломоновы островаСомалиЮжная АфрикаИспанияШри-ЛанкаСт. Елена Пьер и MiquelonSudanSurinameSvalbard и Ян Майен IslandsSwazilandSwedenSwitzerlandSyriaTaiwanTajikistanTanzaniaThailandTogoTokelauTongaTrinidad и TobagoTunisiaTurkeyTurkmenistanTurks и Кайкос IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited арабских EmiratesUnited KingdomUnited StatesUruguayUS Экваторияльная IslandsUSSR (бывший) UzbekistanVanuatuVatican City State (Святой Престол) VenezuelaViet NamVirgin острова (Британские) Виргинские острова (U.С.) Уоллис и Футуна IslandsWestern SaharaYemenYugoslaviaZaireZambiaZimbabweSelect StateAlabamaAlaskaArizonaArkansasCaliforniaColoradoConnecticutDelawareDistrict из ColumbiaFloridaGeorgiaHawaiiIdahoIllinoisIndianaIowaKansasKentuckyLouisianaMaineMarylandMassachusettsMichiganMinnesotaMississippiMissouriMontanaNebraskaNevadaNew HampshireNew JerseyNew MexicoNew YorkNorth CarolinaNorth DakotaOhioOklahomaOregonPennsylvaniaPuerto RicoRhode IslandSouth CarolinaSouth DakotaTennesseeTexasUtahVermontVirginiaWashingtonWest VirginiaWisconsinWyomingSubmit

    НК, Олимпийский: 34-14 Прорыв | Kitsap Daily News

    Автор: МАРК БРИАНТ
    mbriant @ soundpublishing.com

    ПОУЛСБО – Это была битва между титанами Олимпийской лиги, но в конце этой битвы на поле был только один титан.

    За доминирующей игрой во втором тайме младшего бегущего защитника Дакса Солиса Норт Китсап проиграл ничью в третьей четверти и 23 сентября одержал домашнюю победу со счетом 38–14 над «Олимпиком».

    Благодаря этой победе «Викинги» уверенно заняли первое место в турнирной таблице Olympic 2A с общим результатом 4: 0 и 2: 0 в лиге.Норт Китсап вошел в игру, заняв восьмое место в масштабе штата, но, вероятно, получит более высокий рейтинг. «Олимпик», 2: 2, упал до 1: 1 в Олимпийской лиге 2А.

    Определенно было немного мести холодным завтраком, так как последние две встречи между этими двумя командами были близкими отношениями (бросок с игры или меньше), в том числе олимпийская победа 17-14 на голе с игры на последней секунде год назад. Этот оставался напряженным до начала тайма четвертой четверти, когда Солис внезапно ожил, выбив пробежки TD на 66 и 48 ярдов, чтобы завершить свое стремительное приземление на 5 ярдов в третьем периоде.Он финишировал тремя TD, 141 ярдом и всего восемью керри – все после перерыва, и то, что начиналось как обычная напряженная схватка, превратилось в прорыв.

    «Я очень гордился тем, как играют дети», – сказал тренер North Kitsap Джефф Вейбл.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *