Пмл реверсивный пускатель: Купить Пускатель магнитный ПМЛ-2501 220В/50Гц 2р 25А реверсивный без реле IP00 Электротехник ET515400 оптом, цена

alexxlab | 03.03.2023 | 0 | Разное

Пускатель реверсивный в металлическом корпусе ПМЛ-4610 30кВт, 63А[AC3], в.к.1NO, катушка управл. 380В(AC), кнопка Reset, РТЛ-2059 [47А…64A], IP54 О*2 ПМЛ-4610/РТЛ-2059 О*2Б AC380 ЭТАЛ

Тарифная цена:

“>(История цены) 7397,68  RUB /шт

ДатаЦена
01.06.2017 7397,68 RUB
08.04.2017 77,15 USD
18. 12.2016
73,48 USD
28.09.2016 69,98 USD
20.09.2016 69,98 USD
22. 05.2016 1819,38 UAH
10.02.2016 1819,38 UAH
20.12.2015 4590,34 RUB

Пускатели реверсивные ПМЛ в категории “Электрооборудование”

Пускатель реверсивный ПМЛ 1631.

Доставка по Украине

1 050 грн

Купить

Пускатель ПМЛ 1561М

На складе

Доставка по Украине

1 001 грн

Купить

Пускатель ПМЛ 2501

На складе

Доставка по Украине

2 908 грн

Купить

Пускатель ПМЛ 2621

На складе

Доставка по Украине

4 615.71 грн

Купить

Пускатель ПМЛ 2631

На складе

Доставка по Украине

4 710.50 грн

Купить

Пускатель ПМЛ 4560М

На складе

Доставка по Украине

6 302.72 грн

Купить

Магнитный пускатель реверсивный ПМЛ 4620

Доставка по Украине

3 500 грн

Купить

Магнитный пускатель реверсивный ПМЛ 1501 на 10 ампер

Доставка из г. Днепр

800 грн

Купить

Реверсивный магнитный пускатель ПМЛ 2501

Доставка по Украине

1 450 грн

Купить

Контактор ПМЛ-1561дм 16А 0*4Б 36В AC ЭТАЛ силовой реверсивный (пускатель)

Доставка из г. Луцк

2 351 грн

Купить

Контактор ПМЛ-1561м 10А 0*4Б 220В AC ЭТАЛ силовой реверсивный (пускатель)

Доставка из г. Луцк

1 037 грн

Купить

Контактор ПМЛ-1561дм 16А 0*4Б 220В AC ЭТАЛ силовой реверсивный (пускатель)

Доставка из г. Луцк

2 351 грн

Купить

Контактор ПМЛ-1561дм 16А 0*4Б 24В AC ЭТАЛ силовой реверсивный (пускатель)

Доставка из г. Луцк

2 351 грн

Купить

Контактор ПМЛ-1561дм 16А 0*4Б 380В AC ЭТАЛ силовой реверсивный (пускатель)

Доставка из г. Луцк

2 351 грн

Купить

Контактор (магнитный пускатель) ПМЛ-1501 О*4Б 10А ЭТАЛ

Заканчивается

Доставка по Украине

от 800 грн

Купить

Смотрите также

Пускатель ПМЛ-3500 О*4Б 40А

Доставка по Украине

от 4 250 грн

Купить

Контактор (магнитный пускатель) ПМЛ-2501 О*4Б 25А

Заканчивается

Доставка по Украине

от 1 800 грн

Купить

Пускатель электромагнитный ПМЛ-4500 О*4Б 63А

Доставка по Украине

от 4 500 грн

Купить

Пускатель ПМЛ-1621

На складе в г. Днепр

Доставка по Украине

2 398 грн

Купить

Пускатель ПМЛ-4610

На складе в г. Днепр

Доставка по Украине

7 724 грн

Купить

Пускатель ПМЛ-1631

На складе в г. Днепр

Доставка по Украине

2 508 грн

Купить

Пускатель ПМЛ-4620

На складе в г. Днепр

Доставка по Украине

7 857 грн

Купить

Пускатель ПМЛ-4630

На складе в г. Днепр

Доставка по Украине

7 938 грн

Купить

Реверсивный пускатель ПМ-3410 на 40 А до 18,5 кВт с пусковыми кнопками, ПМА-3102, ПМА-3400, ПМЛ-3100

На складе в г. Кривой Рог

Доставка по Украине

2 268 грн

Купить

Пускатель реверсивный ПМЛ-1501 0*4В-10А 220В, ПМЛ-1100, ПМЕ-111, ПМЕ-113

Доставка из г. Кривой Рог

909 грн

Купить

Пускатель реверсивный ПМЛ-1501 0*4Б на10 А 220 В и ПКЛ-22, ПМЛ-1100, ПМЛ-2100, ПМЕ-113, ПМЕ-111

Доставка из г. Кривой Рог

1 008 грн

Купить

Пускатель реверсивный ПМЛ-1501 0*4В-10А катушка 220В

Доставка из г. Кривой Рог

900 грн

Купить

Пускатель реверсивный в корпусе ПМЛ-1510М на 10А катушка 380 В, ПМЛ-1100, ПМЛ-1101; ПМЛ-2100; ПМЕ-211

Доставка из г. Кривой Рог

909 грн

Купить

Контактор ПМЛ-1561дм 16А 0*4Б 42В AC ЭТАЛ силовой реверсивный (пускатель)

Доставка из г. Луцк

2 351 грн

Купить

Модернизация привода клапана или реверс конденсаторного двигателя. Будни группы КИПиА

Наверное, все видели обычный механический вентиль. Достаточно в любом дворе многоквартирного дома посмотреть на тепломагистраль, чтобы увидеть сразу как минимум две задвижки.

Даже не сильно вникая в их конструкцию, и не имея высшего технического образования, несложно понять, что если повернуть маховик, то внутри трубы движется заслонка, которая перекрывает поток воды. Именно от этого «движется» такой механизм трубно-вентильной арматуры и называется «вентиль». Устройство малогабаритного механического клапана показано на рис. 1.9.0003

Применение таких «ручных» клапанов оправдано только в тех случаях, когда клапан используется очень редко, от случая к случаю, и их количество невелико. Например, перекрыть участок трубопровода в случае аварии. Ну где-то в подвале дома потекла распределительная труба или стояк!

Когда вентиль является элементом технологического процесса, его приходится использовать часто (несколько раз в час, а то и чаще), а количество вентилей исчисляется десятками, а то и сотнями, применяются электроклапаны.

На водопроводных станциях в маленьком городке столько клапанов. Почти все они механизированы, управляются простым нажатием кнопки или от контроллера системы автоматизации водоснабжения.

Рисунок 1. Механическое затворное устройство

Как правило, в электроприводе клапана используется электрический трехфазный двигатель, мощность и тип которого определяется диаметром трубы (100…800 мм, а может и больше), на который устанавливается вентиль: чем больше диаметр трубы, тем выше ее шансы на получение почетного звания водовода.

Но вот однажды мне пришлось установить электрифицированный вентиль в водопровод диаметром 400 мм взамен старого, пришедшего в негодность. И тут случилась путаница, но обо всем по порядку.

Рис. 2. Коробка передач с двигателем.

Сам клапан, естественно, в колодце, на рисунке показан только двигатель в сборе с коробкой передач. Черная пластиковая коробка сверху двигателя скрывает под собой клеммную колодку для подключения проводов. Предполагалось, что кроме винтов туда подключать нечего: как обычно, три провода прикручены, и дело сделано. Но вскрытие показало, что это не совсем так.

Не будет упоминать те “лестные” слова, которые были сказаны в адрес отдела снабжения. Ничего не скажешь и о работе электриков, не сумевших подключить это чудо техники. В итоге задача была возложена на Instrumentation Group, которая достаточно успешно завершила дело.

Фотографии сделаны в рабочем состоянии, поэтому на некоторых из них видны руки и даже обувь участников описываемого трудового подвига. После этого лирического отступления можно продолжить рассказ о том, что довелось увидеть и сделать.

Рис. 3. Клеммная коробка двигателя.

В коробке удобно лежал конденсатор, располагалась клеммная колодка с перемычками, а алюминиевый шильдик сбоку двигателя гласил, что это асинхронный двигатель типа АИРЭ 80С4 мощностью полтора киловатта, с конденсатор 45 мкФ и прочая не менее важная информация.

Рисунок 4

На внутренней стороне крышки клеммной коробки, несколько криво приклеенной, была бумажка со схемой подключения двигателя. По этой схеме направление вращения двигателя меняется переустановкой перемычек.

Рисунок 5

Такое соединение хорошо только в том случае, если направление вращения никогда не изменится: один раз нужное направление вращения выбрано перемычками, и осталось. В качестве наглядного примера можно вспомнить хотя бы циркулярную пилу: крутится все время в одну сторону, на том спасибо.

А кто будет переставлять эти перемычки при управлении клапаном? Поэтому необходимо было разработать схему реверса на базе унифицированного реверсивного магнитного пускателя ПМЛ 2621-БММ, который уже имелся и применялся с предыдущим клапаном.

В одной общей коробке объединены два магнитных пускателя, тепловое реле и три кнопки управления. Вдобавок ко всему этому имеется механическая блокировка от работы сразу двух стартеров. В целом достаточно удобная конструкция.

Рисунок 6

На этом рисунке разобранный пускатель, который будет переделываться для управления конденсаторным двигателем, показан в разобранном виде. Соседние пускатели предназначены для управления другими клапанами.

Обратный конденсатор двигателя. Силовая часть

Принципиальная схема реверсивного пускателя разработана начальником группы КИПиА т. Суховым С.Ю. На рис. 7 показана силовая часть схемы.

Рисунок 7

Питание в цепь подается путем продажи L и N, что означает фазный и нулевой провода соответственно. Фаза подается на двигатель только при срабатывании одного из пускателей, а нулевой провод подается непосредственно на конденсатор С1, что полностью соответствует мерам электробезопасности.

Для подключения двигателя требовалось четыре провода.

Сетевое напряжение подается, естественно, через автоматический выключатель. Кроме того, унифицированный магнитный пускатель содержит тепловое реле. Для упрощения чертежа эти элементы на схеме не показаны.

Клеммная колодка на двигателе показана в прямоугольнике в верхней части схемы. Все обозначения клемм и их расположение полностью соответствуют тому, что можно увидеть внутри клеммной коробки. Показан даже терминал V2, который не используется. Магнитные пускатели обозначены на схеме как «ЗАКРЫТО» и «ОТКРЫТО», что позволяет в дальнейшем использовать схему без специального напряжения памяти.

Работу схемы проще всего рассмотреть, если предположить, что двигатель питается постоянным током. Конечно, конденсаторный двигатель постоянного тока не подойдет, но если предположить, что это мгновенное значение переменного тока, то предложенное описание можно считать вполне правильным. Если быть еще более точным, на схеме показан момент времени, когда положительный полупериод сетевого напряжения действует на провод L.

На рис. 8 показана работа двигателя в режиме «ОТКРЫТО».

Рисунок 8

Открытие клапана

Проводники L и N заменены на + и -, поэтому следить за направлением протекания тока, которое показано на схеме стрелками, несложно: ток идет от «плюс» на «минус». РАЗОМКНУТЫЕ контакты пускателя обведены красным точечным овалом, что указывает на то, что пускатель включен и контакты замкнуты.

Напряжение питания с плюсовой клеммы через замкнутый контакт А пускателя К1 поступает на клемму W2, проходит через катушку L2, клемму W1, конденсатор С1 и через клемму V1 возвращается на минус источника питания. Все, цепь замкнута, ток идет.

Следует обратить внимание на направление тока через катушку L2 и конденсатор С1: при включении пускателя «ЗАКРЫТО» это направление не должно меняться.

Через клемму В “ОТКРЫТОГО” пускателя положительное напряжение поступает на клемму U1, проходит через катушку L1 и через клемму U2 и замкнутый контакт С пускателя возвращается на минусовую клемму источника питания. При этом следует обратить внимание на направление токов в катушках L1 и L2. Можно сказать, что стрелки смотрят друг за другом, словно одна догоняет другую.

Запорный вентиль

Работа схемы в режиме «ЗАКРЫТО» происходит при включении пускателя К2. Это положение показано на рисунке 9.

Рисунок 9

Как и на рисунке 8, контакты включенный стартер обведен красной пунктирной линией. Поэтому будем считать, что все контакты замкнуты.

Через замкнутый контакт А пускателя «ЗАКРЫТО» напряжение питания поступает на клемму W2, проходит через катушку L2, конденсатор С1 и через клемму V1 возвращается к отрицательному полюсу источника питания. Точнее, ток вытекает из напряжения. Направление тока и показано на схеме стрелками. Следует отметить, что направление тока в катушке L2 точно такое же, как было на рис. 8.9.0003

Теперь посмотрим, что происходит с катушкой L1. Напряжение питания, разумеется, означает «плюс», через замкнутый контакт С «ЗАКРЫТОГО» пускателя поступает на клемму U2, через катушку L1 проходит ток, а через клемму U1 и замкнутый контакт В «ЗАКРЫТОГО» пускателя возвращается на «минус» исходного питания. При этом направление тока в катушке L1 противоположно тому, что было показано на рисунке 8. Отсюда можно сделать вывод, что для реверсирования конденсаторного двигателя достаточно изменить фазировку одной из катушек, в данном случае это будет катушка L1.

Все предыдущее описание, а также две последние схемы выполнены в предположении, что на фазный провод L действует положительный полупериод сетевого напряжения. Рано или поздно на линии L будет отрицательный полупериод цикл. Все будет работать точно так же, только на картинках надо поменять местами плюс и минус, а направление всех стрелок поменять на противоположное.


Как добиться «правильного» направления вращения

Направление вращения двигателя должно соответствовать нажатым кнопкам управления: при нажатии кнопки «ЗАКРЫТЬ» клапан должен идти на закрытие. В случае «неправильного» направления вращения клапан открывается наоборот.

Чтобы исправить это недоразумение, необходимо изменить направление вращения, что достигается переключением проводов на клеммах U1 и U2. Для сравнения: при использовании трехфазного двигателя направление вращения можно изменить переключением любых двух проводов, здесь это указано выше.

Цепь управления

С силовым агрегатом вроде бы все понятно. Осталось только придумать, как все это будет управляться. Собственно говоря, алгоритм управления задвижкой достаточно прост: нажали кнопку «ЗАКРЫТЬ» и началось закрытие, которое продолжается до срабатывания концевого выключателя «ЗАКРЫТО» или нажатия кнопки «СТОП». То же самое происходит, когда клапан открыт, – дошел до концевого выключателя и остановился.

Ниже приводится описание схемы управления стартером. По сути, это обычный реверсивный магнитный пускатель, который юных электриков приглашают собрать на конкурсах профессионального мастерства: правильно собрал – получи приз!

Но на этой схеме есть несколько специфических элементов, в частности концевые выключатели, которые на профессиональном сленге именуются просто концевыми выключателями.

Следуя этой традиции, ниже будет использоваться именно такой термин. Сама схема показана на рисунке 10. В основном она, схема, остается такой же, как и при использовании трехфазного двигателя.

Рисунок 10. Схема управления клапаном

Катушки магнитных пускателей К1 и К2 рассчитаны на напряжение 220В, поэтому питание схемы осуществляется от фазного и нулевого проводов, обозначенных L и N соответственно. Нетрудно заметить, что фазный провод подключается к цепи через кнопку СТОП. Такое подключение хорошо уже тем, что при установке концевых выключателей хода удержание кнопки обесточивает всю цепь.

При нажатии кнопки «ОТКРЫТЬ» включается пускатель К1 и контакты К1.1 устанавливаются на самопитание. Размыкается нормально замкнутый контакт К1.2, который блокирует включение пускателя К2 при нажатии кнопки «ЗАКРЫТЬ».

Клапан начинает открываться. Открытие продолжается до тех пор, пока не сработает концевой выключатель SQ1 (ОТКРЫТИЕ), расположенный в клапанном механизме, или не будет нажата кнопка СТОП. Концевые выключатели, расположенные в клапанном механизме, показаны на схеме штриховым прямоугольником.

Работа схемы при нажатии кнопки «ЗАКРЫТЬ» аналогична: включается пускатель К2 и клапан продолжает движение до срабатывания выключателя SQ2 (ЗАКРЫТО) или нажатия кнопки «СТОП». Контакт К2.2 блокирует включение пускателя К1. Поэтому изменение направления вращения электродвигателя клапана возможно только после остановки механизма.

Конец разблокировки

Непосредственно в клапане, за исключением концевого выключателя ОТКРЫТО. и ЗАКРЫТЬ. также имеются защитные концевые выключатели SQ3, SQ4, также называемые расцепителями. Они срабатывают, когда усилие механизма превышает допустимое: внутри механизма сжимается пружина, что приводит к срабатыванию SQ3 или SQ4. Отсюда и название трейлера «Выпуск».

Подобная ситуация чаще всего возникает при неисправности концевых выключателей SQ1 или SQ2: неисправность механизма микровыключателя, а то и просто приварились контакты. Это случается довольно часто.

Работа выключателей сцепления напоминает тепловое реле: после срабатывания необходимо нажать на кнопку, чтобы возобновить работу всей цепи. Только в этом случае требуется вывести клапан из этого положения вручную, для чего у каждого клапана есть специальная ручка.

В цепи также присутствует тепловое реле. Его нормально замкнутый контакт обозначен на схеме как РТ – тепловое реле.

Подключение к контроллеру системы автоматики

Аналогичную схему управления легко подключить к контроллеру системы автоматизации водоснабжения с помощью промежуточных реле типа РП-21 или подобных. Достаточно соединить нормально разомкнутые контакты соответствующих реле параллельно кнопкам «ОТКРЫТЬ», «ЗАКРЫТЬ». Для остановки клапана последовательно с кнопкой СТОП следует включить нормально замкнутый контакт промежуточного реле ЗАКРЫТЬ.

Для того, чтобы контроллер «знал» о положении клапана, к концам SQ1, SQ2 должны быть подключены переходы оптопары.

Борис Аладышкин

MashUp-RT, очистите свою собственную обратную транскриптазу (этап бета-тестирования) – Pipette Jockey

Опубликовано: 6 сентября 2018   Последнее изменение: 21 апреля 2020 Потрясающе популярная статья, уступающая только смеси для обеззараживания, сделанной своими руками (очевидно, людям действительно нравятся смеси для обеззараживания). Выяснилось, что существует глобальный спрос со стороны ученых, желающих очистить свои собственные ферменты для использования в качестве инструментов в своих лабораториях. Я рад, что я не единственный, кто принял дух DIY.

Еще одна деталь, которая всплыла на поверхность, заключается в том, что помимо фермента, пригодного для ПЦР, не менее высоким спросом пользовалась обратная транскриптаза (ОТ). Это неудивительно, если учесть, что RT являются одними из самых дорогих ферментов для РНК-биологов, и если вы находитесь между циклами финансирования, потеряли финансирование или находитесь не в центральной стране, это может стать препятствием для входа/продолжения в этой области. . Итак, вы просили, и я предоставил: MashUp (MU)-RT, пользовательский RT на основе FeLV, доступный для академических пользователей!

Прежде чем мы перейдем к MashUp-RT, давайте остановимся немного на истории RT, а затем на конкретных разработках искусства.

Первыми коммерчески доступными RT в 80-х годах были RT вируса птичьего миелобластоза ( AMV ) и RT вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV). В целом было обнаружено, что MMLV лучше, поскольку он в несколько раз более точен.

Компания Invitrogen (тогда Life…теперь Thermofisher?) стала монополистом на рынке высококачественных RT с появлением Superscript II, который был запатентован во всем мире в конце 80-х годов. Основываясь исключительно на патенте, оказалось, что SSII был MMLV с укорочением С-конца для удаления активности РНКазы-Н. Однако патент SSIII подразумевает, что вместо усечения SSII представляет собой полноразмерный MMLV-RT со следующими мутациями: D524G, D583N и E562Q (возможно, потому, что неактивный домен РНКазы-H полезен, возможно, он улучшает связывание РНК). Отменяя активность РНКазы-Н, вы не только увеличиваете выход кДНК, но и повышаете термостабильность фермента до хороших 42°C. Важно отметить, что срок действия патентов на SSII истек (или очень близок к истечению), поэтому рынок был наводнен вариантами/клонами SSII по более низкой цене.

(последовательность MMLV-RT дикого типа для тех, кто играет дома) 

Верхний индекс III был следующей разработкой с мутациями, повышающими точность, термостабильность и снижающими терминальную трансферазную активность: h304R, T306K, F309N, V223H, D524G, D583N, и E562Q. В целом, это очень хороший фермент, который мы использовали до недавнего времени (я думаю, что SSIV по той же цене, можете его купить), вы можете комфортно проводить реакции RT при 50 ° C, что позволяет вам использовать более длинные и более специфичные праймеры. Кроме того, более высокая температура сглаживает вторичную структуру, что может препятствовать синтезу кДНК.

Компания Stratagene (теперь Agilent) вступила в игру в 2005 году со своим патентом, содержащим следующие мутации: E69K, E302R, W313F, L435G, N454K, D524N. Мутация в D524 отключает активность РНКазы H, E302 мутирован, как в надстрочном индексе IV (ниже).

Applied Biosystems (теперь принадлежит Thermo с…?) также добавили:

F155Y, R301L, F309A, D524E или N, E562D, Y586A, H638G, D653N ) запатентовал множество мутаций в MMLV в 2008 году:

Е5К; М39В или Л; И49В или Т; М66Л; Q91R или L; П130С; Л139П; И179Т или В; Д200Н, А или Г; Q221R; Q237R; Т287А; А307В; Т330П; L333Q; Y344H; А502В; Д524А; Л528И; H594R, К или Q; L603W или М; E607K, G или А; H634Y; А644В или Т; N649S; D653G, А, Н или В; К658Р или Q; и L671P.

Как они могут запатентовать столько мутаций? Интересный юридический вопрос: в какой момент патент на молекулярную биологию считается слишком широким?

Вероятно, приобретение Fermentas компанией Thermo заложило основу для патента Superscript IV в 2014 году: 

P51L, S67R, E69K, T197A, h304R, E302K, F309N, W313F, T330P, L435G, N454K, D524G, D583N, H594Q, D653N и L671P.

(последовательность Mut D9 для тех, кто играет дома)

Это одна из прелестей фермента, он может работать при температуре 60°C и устойчив к ряду ингибиторов, вероятно, лучший коммерческий RT на данный момент.

Есть еще несколько патентообладателей в данной области:

NEB недавно подал заявку на патент на мутант MMLV, они не раскрывают точные мутации, а вместо этого заявляют о конкретной последовательности. При согласовании с MMLV он имеет:

H8Y, S56A, T246E, N249D, Q291I, M320L, T330E

После аминокислоты 330ish нет мутаций, даже D524, не знаю почему. NEB могла бы составить серьезную конкуренцию Thermo, если бы они могли предоставить RT с такими же характеристиками, что и SSIV, по более приемлемой цене.

Японская группа опубликовала и запатентовала MM4-RT, который имеет:

E286R, E302K, L435R, D524A

Мы уже видели E302K и D524A.

Наконец, у нас есть химеры доменов MMLV/FeLV, запатентованные Bio-rad, точно не знаю, где они планируют их использовать и почему они лучше однодоменных RT, но мы здесь. Они включали только D524.

Я составил таблицу Excel со всеми мутациями, которые мне удалось найти, и сравнил их друг с другом для вашего удовольствия.

Итак, что мы из всего этого получаем?

  • В MMLV есть несколько горячих точек, которые значительно повышают термостабильность, точность и производительность.
  • Патенты, принадлежащие нескольким разным компаниям/частным лицам, содержат либо идентичные аминокислотные мутации, либо мутации в одном и том же положении с аминокислотными заменами, дающими одинаковый эффект.
  • ThermoFisher является доминирующим игроком в этой области, они делают это дольше всех и приобрели все пикантные мутации в MMLV
  • .

Из того, что я могу узнать из литературы, следующим движением в этой области будут химеры доменов различных RT (Bio-rad), слияние доменов, подобных sso7d, с RT или использование RT из более разнообразных вирусов, чем AMV или MMLV.

Все эти исследования послужили источником вдохновения для разработки MashUp-RT. Этот фермент основан на FeLV-RT, который по своей природе более точен, чем MMLV. Кроме того, у него есть мутации, которые повышают такие характеристики, как термостабильность, точность и т. д. Как и pfu-sso7d, он должен быть основным ферментом для молекулярных биологов.

Теперь, вероятно, потребуется 2-4 недели, чтобы полностью охарактеризовать активность MashUp и предоставить всесторонний протокол очистки, но те, кто желает участвовать в бета-тестировании, могут связаться со мной для получения клона.

ПРИМЕЧАНИЕ. Пришли отзывы о Mashup, новые пользователи могут захотеть прочитать протоколы людей, а не следовать тому, что у меня есть ниже. Я сохранил его, чтобы видеть, как далеко мы продвинулись. По словам Райана, похоже, вам нужна плазмида-шаперон, чтобы заставить Mashup работать с автоиндукционными средами.

ПРИМЕЧАНИЕ 2. Вот наш взгляд на очистку Mashup и оптимизацию буфера!

ПРИМЕЧАНИЕ 3: Сокращенный, самый последний протокол: PDF, DOCX

 

Обновление №1 (27.09.18)


приходящий! Чтобы все не начинали с нуля, вот как проходит очищение до сих пор. Я уже очищал MMLV RT и использовал следующую статью в качестве руководства: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S01681656100189.5X

В отличие от стандартной очистки белка, не индуцируйте экспрессию Mashup при 37°C. Индукция при 22-30С. Я не любитель очистки белков, но для многих белков экспрессия значительно улучшается, если их проводить при более низкой температуре. Вы можете попробовать как низкую, так и высокую температуру, однако мои первые результаты показывают, что 37C не работает хорошо, если вообще работает. Если вы чувствуете себя модно, вы, вероятно, можете вызвать температуру 16 ° C. Почему происходит это явление? Конечно, при более высоких температурах синтез белка увеличивается, но внезапная высокая концентрация белка может вызвать агрегацию в тельца включения или неправильное свертывание. В качестве примечания: для очистки я использую клетки Rosetta 2 DE3 pLysS. Не должно быть необходимости в редких кодонах, которые штамм производит из-за оптимизации кодонов мэшапа, но это то, что у меня было в морозилке, а второй антибиотик приятно иметь.

Моя первая попытка очистки Mashup заключалась в культивировании в автоиндукционной среде (AIM). По сути, вместо того, чтобы отбирать образцы через регулярные промежутки времени, ждать, пока OD культуры достигнет 0,5-1,0, добавлять IPTG и т. д., вы просто добавляете исходную культуру/колонию/глицерин прямо в AIM и оставляете ее расти в течение ночи ( 16 часов, в стационарную фазу). Вы собираете свои клетки утром и продолжаете обычную очистку его тегов, давайте посмотрим на рецепт и посмотрим, как он работает:

на литр:

6G NA2HPO4
3G KH3PO4
20 г триптона
5G Дрожжевой экстракт
5G NACL
0,5G MGSO4
6 мл глицерина или 10 мл 60% глицероля (Фильтр). Лактоза ***
0,5 г глюкозы ИЛИ 5 мл 10% глюкозы ***
(Предположительно, вы можете заменить лактозу галактозой, не пробовали подтвердить)

*** Простерилизовать фильтром и добавить в автоклавированные соли/триптон, или смешать большую партию всего и отфильтровать все это ***

Итак, ваш стандартный мультимедийный контент с некоторой буферной емкостью и небольшим количеством Mg для аромата. Сахара делают его особенным. Ваша кишечная палочка сначала поглощает глицерин и глюкозу и достигает высокой плотности клеток. После того, как все это израсходовано, остается только лактоза, которая при метаболизме вызывает экспрессию вашей плазмиды вместо IPTG. Вообще говоря, AIM хорошо зарекомендовал себя в наших руках, и, безусловно, хорошо работает для очистки RTs


Обновление #2 10.02.18

Ребят, реально работает, то что удалось почистить работает как РТ! Я помещаю мэшап против верхнего индекса 4, текущего лидера мира RT, полные сравнения будут как можно скорее, просто я так счастлив, что не разработал кучу мусора! Вау!


Обновление #3 10.05.18

Хорошо, ребята, важные обновления по очистке, автоиндукционная среда проста в использовании, но, возможно, это не лучший вариант для мэшапа, объем 200 мл дал хороший выход фермента, однако, не то количество, которое я ожидал. Я аутоиндуцировал при 28°C в течение 18 часов, повторно суспендировал в буфере для лизиса (50 мМ фосфата натрия, pH 8, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидизол, 5% глицерин), лизировал ультразвуком (5 импульсов по 10 с, пауза 30 с) и подвергал 8 мл смолы Ni-NTA. Элюировали ручным градиентом имидизола от 10 мМ до 1000 мМ. Не стесняйтесь давать советы по очистке белка!

Итак, я определенно очищаю Mashup, но, как ни странно, это не одна группа, как вы ожидаете. Не баф для очистки белка, но может ли это быть деградация? Что-то смешное из-за автоиндукции? Колонка не насыщается из-за низкой индукции? Не уверен, в любом случае я взял самые красивые фракции и сконцентрировал их в колонке для концентрации миллипор 50 кДа и использовал это для сравнения с верхним индексом 4. Я не проводил Бредфорда для измерения содержания белка, в этот момент я просто молился. что фермент активен. Я провел RT-PCR, сравнивая 20 единиц (разведение 1:10) SSIV с разведением 1/8 концентрированного мэшапа для фрагмента мРНК размером 400 п.н., начиная с 1 мкг общей РНК (RT проводили при 50°C). ПЦР проводили с использованием самодельного pfu-sso7d.

У-у-у! Это действительно работает! Теперь меня не обескуражило уменьшение интенсивности полосы с повышением температуры отжига. Почему это могло быть? Это предполагает, что Mashup продуцирует меньше кДНК, что, в свою очередь, может быть связано с более низкой концентрацией Mashup по сравнению с SSIV. Кроме того, SSIV использует проприетарный буфер (5 мл за 250 долларов, серьезно Термо?). Вполне возможно, что стандартный буфер 5X First Strand, который использовался в течение последних трех десятилетий, ингибирует ПЦР, подробнее о буферах RT позже. Я взял Mashup, который у меня был, и еще больше сконцентрировался, чтобы сделать правильный градиент по сравнению с SSIV. Те же условия, что и в прошлый раз, за ​​исключением того, что я использовал меньше циклов ПЦР (30 против 35), чтобы попытаться разделить начальное количество кДНК.

Все еще работает! Вау! Я произвольно установил концентрацию Mashup на 200 AU (чтобы мне не пришлось больше заниматься математикой). Я приближаюсь к концентрации SSIV, и в полной силе, при размере выборки один, Mashup, кажется, производит больше кДНК. Извините за поспешность этих гелей, я бы пока не назвал их количественными или окончательными. Я бы сказал, что Mashup все же не такой концентрированный, как хотелось бы, в идеале градиент должен выглядеть примерно одинаково между SSIV и Mashup. Что интересно, SSIV продюсировал неспецифическую группу, а Mashup — нет! Очень обнадеживает!

Различная производительность также может быть связана с разницей в составе буферов. Я очень подозреваю, что буфер RT для SSIV содержит такие добавки, как трегелоза или бетаин. Попробую ОТ-ПЦР с мэшапом и буфером SSIV и посмотрю, что получится. Покупка буфера SSIV для использования с Mashup на самом деле нецелесообразна из-за смехотворной стоимости (в отличие от доморощенного pfu-sso7d и буферного пакета NEB, 5 мл за 25 долларов).

Не буду продолжать эту конкретную подготовку Mashup, она послужила доказательством того, что фермент работает, однако начальное качество белка в лучшем случае среднее, вероятно, из-за среды автоиндукции. Буду пробовать классическую индукцию IPTG, и я на самом деле сделаю Брэдфорд, что бы ни было дальше!


Обновление № 4 11. 02.18

Ждем, дольше, чем ожидалось, но я уже должен знать, что не стоит быть слишком оптимистичным! С учетом сказанного, некоторые улучшения с очисткой. Во-первых, я автоиндуцировал при 22C против 30C. Кроме того, я использовал реагент Sigma для лизиса клеток B по сравнению с обработкой ультразвуком, не уверен, что он сделал, но взгляните:

Итак, я все еще не насыщаю никелевую колонку, но опять же, учитывая, что у меня было 5 мл последней фракции I думаю, что выход был осуществимым. Я провел индукцию IPTG с помощью 400 мкМ IPTG, и результаты оказались хуже, чем у автоиндукционных сред.

К сожалению, я думаю, что колонки Millipore 50 кДа, которые я использую для концентрирования, на самом деле значительно снижают мои выходы, потому что после концентрирования этой последней фракции у меня остается 5-10% того, с чего я начал. Грустный. Буду переходить на колонки PES (Millipore — это регенерированная целлюлоза)

Итак, если предположить, что я смогу улучшить индукцию, я думаю, что мы почти у цели.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *