Сталь 3 сп5 расшифровка: Ст3сп5 расшифровка что означает 5

alexxlab | 15.10.1997 | 0 | Разное

Содержание

С245 (заменитель Ст3пс5, Ст3сп5)

Характеристика материала С245.

Марка :

С245

Заменитель:

Ст3пс5, Ст3сп5

Классификация :

Сталь для строительных конструкций

Применение:

изготовления проката, предназначенного для строительных стальных конструкций со сварными и другими соединениями


Химический состав в % материала С245

C

Si

Mn

Ni

S

P

Cr

N

Cu

до   0. 22

0.05 – 0.15

до   0.65

до   0.3

до   0.05

до   0.04

до   0.3

до   0.012

до   0.3

Механические свойства при Т=20oС материала С245 .

Сортамент

Размер

Напр.

sв

sT

d5

y

KCU

Термообр.

мм

МПа

МПа

%

%

кДж / м2

Лист

2 – 3.9

 

370

245

20

  

  

 

Лист

4 – 10

 

370

245

25

  

  

 

Технологические свойства материала С245 .

  Свариваемость:

без ограничений.

Обозначения:

Механические свойства :

sв

– Предел кратковременной прочности , [МПа]

sT

– Предел пропорциональности (предел текучести для остаточной деформации), [МПа]

d5

– Относительное удлинение при разрыве , [ % ]

y

– Относительное сужение , [ % ]

KCU

– Ударная вязкость , [ кДж / м2]

HB

– Твердость по Бринеллю , [МПа]

 


Свариваемость :

без ограничений

– сварка производится без подогрева и без последующей термообработки

ограниченно свариваемая

– сварка возможна при подогреве до 100-120 град. и последующей термообработке

трудносвариваемая

– для получения качественных сварных соединений требуются дополнительные операции: подогрев до 200-300 град. при сварке, термообработка после сварки – отжиг

По данным www.splav.kharkov.com

Сталь | ТРАСТ МЕТАЛЛ – Part 2

Швеллеры 12 сталь марки ст3пс цена

Учитывая специфику некоторых видов швеллеров, а также их большое разнообразие, желательно располагать точными данными о предполагаемых нагрузках на них. Не предназначены для использования в ответственных конструкциях и в качестве опор, поскольку не выдерживают высокую осевую нагрузку. Широко используются в автомобилестроении. Швеллер. Вес швеллера в одном погонном метре составляет 7,05 килограмм, а в одной тонне насчитывается 141,8 метров. Металлический швеллер, или по другому металлическая балка. Толщина металлической конструкции 5,1 мм.

Швеллер, цена на него складывается от размера, типа, материала, стоит достаточно не дорого. Его изготавливают, из различных марок стали, методом горячей прокатки либо гнутья (на специальных профилегибочных станках). Один метр швеллера весит 16,3 килограмма, в одной тонне содержится 61,3 метра швеллера. Самый популярный вид, широко применяемый в строительстве. ВИДЫ ШВЕЛЛЕРОВ, КАК КУПИТЬ, ГДЕ ПРИМЕНЯЮТСЯ: Горячекатаные по ГОСТ 535-88. Марка У. Швеллер, размеры которого колеблется от 2 до 22 метров, может использоваться при проведении архитектурных работ, в качестве межкомнатных перекрытий, для укрепления кровли, для создания каркасов небольших строений, ангаров и боксов.
Швеллеры 12 сталь марки ст3пс цена

Изготавливаются на профилегибочных станках. Описание изделия № 18, швеллер 18 размеры, цена швеллера, вес 1 метра по ГОСТу. Но обычно, для изготовления швеллеров используется сталь 3пс (сп). Для использования в местах с большими перепадами температур, а также для применения в конструкциях с повышенными нагрузками могут быть сделаны из низколегированной стали 09Г2С. Благодаря своей форме швеллер может выдерживать большие нагрузки. Существуют типы, предназначенные как для ответственных конструкций, к которым предъявляются требования повышенной прочности, так и для не ответственных, например облегченные и экономные серии. Имеет толщину полок меньшую, чем установлено стандартами и применяется для снижения веса металлоконструкций.

Это позволяет точно подбирать наиболее подходящий тип швеллера для различных задач. В интернет- магазине всегда в продаже имеется швеллер сортамент разного размера. Марки этих изделий различаются между собой по технологии и материалам изготовления, а так же по внешнему виду и области применения. Имеет небольшой уклон граней вовнутрь. При изготовлении швеллеров, используются различные марки стали, влияющие на прочность и устойчивость к температурным перепадам. Одна металлическая балка весит 12,3 килограмма, а в одной тоне насчитывается 81,3 метра балок из металла. Марка Э. Обычно изготавливается на заказ.

Швеллер – это изделие из металла П – образной формы, которая широко используется в строительных работах в основном для перекрытий. Металлическая конструкция такого типа может использоваться для сборки каркасных сооружений, она способна выдерживать сильные нагрузки, не боится воздействия атмосферных осадков. Изготавливаются из марки стали ст 3пс (сп), на профилегибочных станках. Материалом для производства может быть рулонная горячекатаная сталь, конструкционная сталь, низколегированная сталь. Описание швеллера №12, размеры, швеллер 12 метров, цена, ГОСТ. Характеристика товара швеллер № 22, вес швеллера 20, цена за метр погонный, характеристики. Мы постараемся дать краткое описание металлических балок разного размера: Швеллер 8, его характеристики, размеры, цена, вес 1 метра.

Швеллер купить можно в интернет- магазине металла, что находится в Москве. Изделия изготовлены из прочного металла, имеют П-образную конструкцию, они устойчивые и надёжные, нашли широкое применение в использовании. Одна металлическая балка № 12 весит 10,4 килограмма, в одной тонне содержится 96, 2 метра швеллера. Швеллер гост 8240, под номером 22, имеет толщину 5,4 миллиметра. Кроме швеллера, здесь можно приобрести и трубу ВГП. Марка С. Экономичная серия. Металлическая балка под номером 18 имеет высоту 180 миллиметров, ширину 70 миллиметров и длину 11,7 метра.

Металлоконструкции такого типа лёгкие, прочные и надёжные. Разделяются на несколько типов. Принадлежность швеллера к определенному типу определяется буквой в его маркировке: Марка П. Поскольку швеллера используются в качестве несущих элементов конструкций и строений, они проходят обязательную сертификацию и изготавливаются в строгом соответствии с ГОСТами. Марка Л. Изделие такого типа имеет высоту 22 сантиметра, ширину 82 миллиметра, длина металлической балки 11,7 метра. Цены размещены под каждым изделием, оптовикам положены большие скидки.

Также популярна в строительстве и при сборке металлоконструкций. Гнутые не равнополочные швеллера ГОСТ 8281-80. Основное применение – декоративные элементы, мебельное производство и не ответственные конструкции. Все изделия соответствуют нормам ГОСТа и прошли тестовое испытание на прочность. Специальные швеллеры. Эта информация поможет сделать правильный выбор, а также сэкономить средства, особенно при возведении не ответственных сооружений. Швеллер – это конструкция из металла П – образной формы, которая широко используется в строительных работах, в машиностроении, как опорный элемент при возведении мостов.

Изделие числится под номером 8, имеет высоту 80 мм, ширину 40 миллиметров и длину 11,7 метра, толщина металлической балки такого типа 4,5 мм. Балка достаточно толстая, её толщина не менее 4,8 миллиметра. Чаще всего изготавливаются на заказ и соответствуют специфическим требованиям. Это металлическое изделие П- образного типа, имеет высоту 120 миллиметров, ширину 52 миллиметра и длину 11,7 метра. Изделие такого типа имеет стандартную длину: 11,7 метра, его высота 140 миллиметров, ширина металлоконструкции 58 мм, а толщина швеллера 4,9 миллиметра. Где четко регламентируются типоразмеры изделий и допустимые нагрузки. Облегченная версия марки П, применяется для строительства не ответственных конструкций.
Швеллеры 12 сталь марки ст3пс

Металлические балки такого размера компактны, их легко перевозить. Легкая серия швеллеров. Размеры металлической балки №14, швеллер 14 размеры, вес погонного метра. Зайдя на сайт компании, можно подробно узнать описание товара, его характеристики, способ оплаты и доставки. Гнутые равнополочные швеллера ГОСТ 8278-83. Могут применяться в строительстве, при возведении ответственных сооружений.

Швеллер представляет собой металлическую балку, которая способна выдерживать большие осевые нагрузки, поэтому широко используется в качестве несущих опор. Одна металлическая балка такого типа весит 21 килограмм, а в тонне содержится 47,6 метра швеллера. Грани полок швеллера параллельны. За счет параллельных граней, у таких швеллеров между полок хорошо ложатся кирпичи, благодаря чему он используется при устройстве дверных, оконных и других проемов. Металлические балки хорошо использовать для монтажа, при реконструкции мансард, для укрепления внутренних и наружных стен в здании.

По классу точности делится на: А – высокая точность Б – повышенная точность В – обычная точность.

Смотрите также
  • Швеллеры 16 24 сталь марки 18сп

    ЗПС/СП5 используют для производства деталей и конструкций, эксплуатация которых будет вестись при высоких нагрузках. Цена на швеллеры из легированной…

  • Швеллеры 12 сталь марки ст3пс

    “ТрастМеталл” имеет возможность поставки различного металлопроката и сопутствующих материалов. Выполнение услуг по цинкованию, производству…

  • Швеллеры 40 из стали марки ст0 цена

    Ценовая политика. Цена материала находится на вполне доступном и приемлемом уровне, что положительно влияет на популярность изделия и его…

  • Швеллер сталь 09г2с

    Неавторизованные пользователи в основной своей массе небольшие металлотрейдеры, занимающиеся поставкой мелкооптовых партий, что не гарантирует 100%…

  • Швеллер 10п марка стали

    Потребители: строительные компании, машиностроительные, вагоностроительные предприятия, производители металлоконструкций, домохозяйства ( только…


by SEO

Лист горячекатаный стальной ГОСТ 19903 74, лист горячекатаный 09г2с

Лист стальной горячекатаный является наиболее простым по геометрической конфигурации металлическим изделием и одним из самых востребованных расходных элементов в современном производстве.

Применение

Лист горячекатаный применяется в самых различных областях промышленности. Изделие широко востребовано в военной и гражданской авиации, в гражданском и промышленном строительстве, станкостроении, архитектуре, в производстве автомобилей, дизайне, отделочных работах, строительстве мостов и др.

Как правило, изделие предназначается для дальнейшей обработки. В частности, иногда лист подвергают прорезке и вытяжке, чтобы получить ПВЛ (просечно-вытяжной лист), который в дальнейшем применяется для производства уличных ограждений, арматуры, различной упаковки, ступеней лестниц и др. Лист, произведенный с соблюдением технологии, хорошо выдерживает гибку, штамповку, вальцовку и вытяжку.

Изготовление

Изготовление стальных горячекатаных листов производится с применением метода горячей прокатки. В качестве материала используется простая углеродистая сталь или низколегированная. Продукцию изготавливают на гладких  (или калиброванных) валках с применением обработки нагретого металла под давлением.

Поскольку процесс изготовления данной продукции относительно прост, цена на лист горячекатаный вполне демократична.

Поставка изделий данного типа производится в листах или рулонах.

Некоторые характеристики

Параметр точности прокатки подразделяет данную продукцию на два класса: класс повышенной точности (обозначение А) и класс Б нормальной точности (обозначение Б).

К обязательным критериям горячекатаного листа относится также значение временного сопротивления. Например, в маркировке изделия ОК300В буквы ОК означают прокат обыкновенного качества,  а цифра 300 – нижнюю границу временного сопротивления.

Продукция толстолистового проката подразделяется на 6 групп. Первые пять характеризуют изготовление стальных горячекатаных листов. Для шестой группы производят листы упрочненной модификации. Данная толстолистовая продукция бывает высокой плоскостности (принятая аббревиатура ПВ), особо высокой (ПО) и нормальной (ПН).

Многообразие критериев и показателей в номенклатуре позволяет подобрать наиболее подходящее для поставленной задачи изделие.

Если Вы все же испытываете затруднения в выборе продукции, следует обратиться к сотрудникам компании «МетТрансТерминал». Они с готовностью проинформируют вас о видах товара, сроках поставок и предусмотренных скидках.

ТД АртСталь – Металлопрокат от надежного поставщика

Торговый дом АртСталь имеет в наличии на складе огромный ассортимент металлопроката. Занимаемся продажей черного, оцинкованного, нержавеющего проката, в состав которого входит широчайший сортамент трубного, сортового, листового, фасонного проката, а также деталей трубопроводов.

На складах нашей компании складируются такие виды проката, как:

  • труба электросварная (10704/10705), бесшовная (8732-78), ВГП (3262), котельная (ТУ 14-3р-55-2001), газлифтная (ТУ 14-3-11-28). Трубы толстостенные с толщиной стенки более 10 мм.
  • Листы стальные – холоднокатаные (ГОСТ 19904) и горячекатаные (ГОСТ 19903) конструкционной, инструментальной, быстрорежущей марки стали. Продаем листы кусками любого размера!
  • Балка, швеллер, арматура, уголок, проволока, катанка.
  • Из оцинкованного проката: полоса, круг, уголок, швеллер, проволока, лента. Производим услугу горячего цинкования!
  • Калиброванный прокат: круг, шестигранник, квадрат.

Наш металлопрокат используют во многих отраслях строительства и промышленности, а также в жилых домах и коммунальной сфере, при замене труб методом после опрессовки.

У нас Вы можете купить металлоизделие, а так же любой другой металлопрокат (трубы стальные, листы гк и хк, оцинковку в рулоне и т.д.) для любых целей и для любой отрасли.

В нашем интернет-магазине только качественная продукция, новая или лежалая (трубы, листы). После отгрузки на весь металл предоставляется сертификат качества!

Наши преимущества

  • Любое металлоизделие по низкой цене;
  • Оптовые и розничные поставки. Продажа от 1 штуки или куска;
  • Оперативная доставка продукции по стране через транспортную компанию;
  • Сеть складов по всей России;
  • Редкие позиции, такие как, труба с толстой стенкой, оцинкованные металлоизделия;
  • Все цены обновляются каждый день;
  • Порезка и отмотка металлопроката;
  • Высокая квалификация сотрудников. Текучки кадров у нас практически нет!;
  • Подскажем, посоветуем;
  • Работаем в системе электронного документооборота:
  • Вечерняя доставка по городу

Как купить металлопрокат и заказать услуги

Выбирайте металлопрокат в нашем каталоге и заказывайте через отправку заявки на почтовый адрес, указанный в шапке сайта. Прайс-лист, а также информация о наличии продукции на складе ежедневно обновляются. ТД АртСталь более десяти лет работает на рынке металлопродукции. У нас большой опыт, опытный персонал, высокое качество продукции и предоставляемых услуг.

Для заказа продукции и услуг в ТД АртСталь познакомьтесь с нашим каталогам. На каждой странице каталога имеется специальный фильтр, благодаря которому Вы можете выбрать диаметр или толщину, а так же марку стали продукции. Услуги выделены в отдельный раздел для заказа отправляйте заявку, или обращайтесь к нашим менеджерам по телефонам.

Марка стали ст3сп5 расшифровка

Марка стали — Ст3сп

Стандарт — ГОСТ 380

Буквами Ст обозначают углеродистые стали обыкновенного качества, цифра 3 — указывает условный номер марки стали, сп — степень раскисления стали (спокойная).

Углеродистая сталь обыкновенного качества Ст3сп применяется для несущих элементов сварных и несварных конструкций и деталей.

Массовая доля основных химических элементов, %
C — углеродаMn — марганцаSi — кремния
0,14-0,220,40-0,650,15-0,30
Температура критических точек, °С
Ac1Ac3Ar1Ar3
735850680835
Технологические свойства
КовкаТемпература ковки, °С: начала 1300, конца 750. Охлаждение на воздухе.
СвариваемостьСваривается без ограничений.
Способы сварки: ручная дуговая сварка, автоматическая дуговая сварка, электрошлаковая сварка, контактная сварка. Для толщины более 36 мм рекомендуется подогрев и последующая термообработка.
Обрабатываемость резаниемВ горячекатаном состоянии при HB 124 и σв = 400 МПа:
Kv твердый сплав = 1,8
Kv быстрорежущая сталь = 1,6
Флокеночувств.Не чувствительна
Склонность к отпускной хрупкостиНе склонна

Отверстия под резьбу

Таблица сверл для отверстий под нарезание трубной цилиндрической резьбы.

Размеры гаек под ключ

Основные размеры под ключ для шестигранных головок болтов и шестигранных гаек.

G и M коды

Примеры, описание и расшифровка Ж и М кодов для создания управляющих программ на фрезерных и токарных станках с ЧПУ.

Типы резьб

Типы и характеристики метрической, трубной, упорной, трапецеидальной и круглой резьбы.

Масштабы чертежей

Стандартные масштабы изображений деталей на машиностроительных и строительных чертежах.

Режимы резания

Онлайн калькулятор для расчета режимов резания при точении.

Отверстия под резьбу

Таблица сверл и отверстий для нарезания метрической резьбы c крупным (основным) шагом.

Станки с ЧПУ

Классификация станков с ЧПУ, станки с ЧПУ по металлу для точения, фрезерования, сверления, расточки, нарезания резьбы, развёртывания, зенкерования.

Режимы резания

Онлайн калькулятор для расчета режимов резания при фрезеровании.

Форматы чертежей

Таблица размеров сторон основных и дополнительных форматов листов чертежей.

CAD/CAM/CAE системы

Системы автоматизированного проектирования САПР, 3D программы для проектирования, моделирования и создания 3d моделей.

Чтение чертежей

Техническое черчение, правила выполнения чертежей деталей и сборочных чертежей.

Углеродистая спокойная сталь обыкновенного качества марки Ст3сп (Ст3сп5) выпускается по ГОСТ 380 «СТАЛЬ углеродистая обыкновенного качества. Марки».

Сталь Ст3сп (Ст3сп5) используется при изготовлении горячекатаного сортового, фасонного (уголки, двутавры, швеллеры), листового, широкополосного универсального проката, холоднокатаного тонколистового проката и гнутых профилей, предназначенных для строительных стальных конструкций со сварными и другими соединениями, а также слитков, блюмов, слябов, сутунки, заготовки катаной и непрерывнолитой, труб, поковок и штамповок, лент, проволоки, метизов и др.

Химический состав

Химический состав стали Ст3сп по плавочному анализу ковшовой пробы должен соответствовать нормам, приведенным в табл. 1 (табл. 1-2 ГОСТ 380-2005).

Химический состав стали Ст3сп по плавочному анализу ковшовой пробы
углеродамарганцакремниясерыфосфорахроманикелямедимышьякаазота
Массовая доля, %Массовая доля элемента, %, не более
0,14-0,220,40-0,650,15-0,300,0500,0400,300,080,010
Предельные отклонения по массовой доле элементов, %
+0,03
−0,02
+0,05
−0,03
+0,03
−0,02
+0,005+0,002
    Примечания:
  1. Допускается снижение нижнего предела массовой доли марганца на 0,10 % для тонколистового проката и толстолистового проката толщиной до 10 мм при условии обеспечения требуемого уровня механических свойств (п. 4.2 ГОСТ 380-2005).
  2. Допускается снижение нижнего предела массовой доли марганца до 0,25 %, а нижний предел массовой доли углерода не нормируется, если плавка предназначена для изготовления сортового и фасонного проката (кроме поставляемого для судостроения и вагоностроения), при условии обеспечения требуемого уровня механических свойств (п. 4.2 ГОСТ 380-2005).
  3. Допускается увеличение массовой доли меди до 0,40 %, хрома и никеля — до 0,35 % каждого, в стали, изготовленной скрап-процессом, при этом массовая доля углерода должна быть не более 0,20 % (п. 4.4 ГОСТ 380-2005).
  4. Допускается увеличение массовой доли азота до 0,012 % при выплавке стали в электропечах и до 0,013 %, при условии снижения нормы массовой доли фосфора не менее чем на 0,005 % при каждом повышении массовой доли азота на 0,001 % (п. 4.6 ГОСТ 380-2005).

Методы отбора проб для определения химического состава стали — по ГОСТ 7565, химический анализ стали — по ГОСТ 12359, ГОСТ 17745, ГОСТ 18895, ГОСТ 22536.0- ГОСТ 22536.11, ГОСТ 27809, ГОСТ 28033 или другими методами, утвержденными в установленном порядке и обеспечивающими необходимую точность.

Определение массовой доли хрома, никеля, меди, мышьяка, азота и кремния допускается не проводить при условии гарантии обеспечения норм изготовителем (п. 5.3 ГОСТ 380-2005).

Механические свойства

Механические свойства сортового и фасонного проката из стали Ст3сп (Ст3сп5) при растяжении, ударная вязкость, а также условия испытаний на изгиб должны соответствовать требованиям табл.2 (табл. 2-3 ГОСТ 535).

Механические свойства проката из стали Ст3сп (Ст3сп5)
Толщина,ммМеханические характеристикиИзгиб до параллель-ности сторон ( а — толщина образца, d — диаметр оправки)Ударная вязкость KCU , Дж/см² (кгс·м/см²)Ударная вязкость KCV , Дж/см² (кгс·м/см²)
Предел текучести σ т, МПа (кгс/мм²)Временное сопротив-ление σв, МПа (кгс/мм²)Относи-тельное удли-нение δ5, %при температуре, °Спосле механи-ческого старенияпри температуре, °С
+20−20+20
не менеене менее
Механические свойства сортового и фасонного проката
До 5 включ.255 (26)380-490 (39-50)26d = a
Св. 5 до 10 включ.108 (11)49 (5)49 (5)34 (3,5)
Св. 10 до 20 включ.245 (25)370-480 (38-49)
Св. 20 до 40 включ.235 (24)25d = 2 a
Св. 40 до 100 включ.225 (23)23
Св. 100205 (21)
    Примечания:
  1. По согласованию изготовителя с потребителем допускается снижение предела текучести на 10 Н/мм² (1 кгс/мм²) для фасонного проката толщиной свыше 20 мм.
  2. По согласованию изготовителя с потребителем допускается снижение относительного удлинения на 1 % (абс.) для фасонного проката всех толщин.
  3. Допускается превышение верхнего предела временного сопротивления на 49,0 Н/мм² (5 кгс/мм²), а по согласованию с потребителем — без ограничения верхнего предела временного сопротивления при условии выполнения остальных норм. По требованию потребителя превышение верхнего предела временного сопротивления не допускается.
  4. Допускается снижение величины ударной вязкости на одном образце на 30 %, при этом среднее значение должно быть не ниже норм, указанных в настоящей таблице

Приемка, маркировка, упаковка, транспортирование и хранение

Приемку, маркировку, упаковку, транспортирование и хранение металлопродукции из стали Ст3 ведут в соответствии с требованиями ГОСТ 7566.

Маркировку проката из стали Ст3сп проводят несмываемой краской красного цвета (п. 6.1 ГОСТ 380-2005).

Аналоги стали марки Ст3сп

Углеродистой спокойной стали обычного качества марки Ст3сп по ГОСТ 380-2005 соответствуют стали следующих марок:

  • С255 по ГОСТ 27772 (прил. 1 ГОСТ 27772-88)
  • ВСт3сп5-1 по ТУ 14-1-3023–80 и 18сп по ГОСТ 23570–79 (табл. 51б прил. 1 СНиП II -23-81)
  • Е 235-C (Fe 360-C) по ISO 630:1995 (прил. А ГОСТ 380-2005)

Мы изготавливаем следующие типовые металлоизделия:

Лестницы маршевые, площадки, лестницы стремянки и их ограждения по серии 1.450.3-7.94.2:

Лестницы маршевые, площадки, лестницы стремянки и их ограждения по серии 1.450.3-3.2:

Стальные лестницы-стремянки для колодцев по:

Если Вас заинтересовали наши металлоконструкции,
Вы можете отправить нам сообщение,
заполнив следующую форму:

3ПС5 или 3СП5 — Сталь углеродистая обыкновенного качества .
Сортовой и фасонный прокат – ГОСТ 535-88. Лист – ГОСТ 14637-89, ГОСТ 16523-97. Поковки – ГОСТ 8479-70.
Назначение: Прокат категорий 2 и 3 – несущие и ненесущие элементы сварных конструкций и деталей, работающие при положительных температурах; категории 4 – несущие элементы сварных конструкций, работающие при переменных нагрузках в области температур от -20С при условии заказа и поставки с гарантируемой свариваемостью. Прокат категории 5 толщиной до 10 мм – несущие элементы сварных конструкций, работающие при переменных нагрузках в температурном интервале от -40 до +425С; толщиной от 10 до 25 мм – несущие элементы, работающие при переменных нагрузках в области положительных температур, а также несущие элементы сварных конструкций, работающие при температуре от -40 до +425С, при условии поставки с гарантируемой свариваемостью.
Листы – для электросварных труб, работающих при температуре до 300С и давлении до 1,6 Н/м

Металлопрокат с маркой стали: 3ПС/СП5—>3ПС5/СП5

Справочная информация:

При выборе изделий металлопроката необходимо опираться не только на его размер и назначение, но и учитывать особенности марки стали, из которой оно изготовлено. Именно от этих параметром зависит качество металлоизделия и его эксплуатационные характеристики.

Расшифровка марок сталей осуществляется благодаря общепринятым значениям, где каждая буква присваивается тому или иному виду металла, содержащегося в стальном сплаве, и буквенным сочетаниям, сообщающих о состоянии стали. Химический состав любой марки стали должен соответствовать ГОСТ, чтобы избежать наличия дефектов и низкого качества изделия.

Так, например, сталь обычного качества может обозначаться как ст3сп (где сп – спокойная сталь), Ст4пс (где пс – полуспокойная сталь), а качественная углеродистая сталь любой марки — 08кп, 10пс, 18К и практически не содержит легирующих примесей.

Для изготовления сварных и горячекатаных изделий предпочтительно использование углеродистой и низколегированной марки стали. Для труб, которые производятся путем сваривания стальных листов, чаще всего используется 09г2с, где помимо количества содержащегося в сплаве углерода указывается наличие марганца и кремния (буквы г и с соответственно).

Комплементарное кодирование пространственной информации в астроцитах гиппокампа

19 июля 2021

Уважаемый доктор Феллин,

Большое спасибо за представление вашей рукописи «Глиальные клетки места: дополнительное кодирование пространственной информации в астроцитах гиппокампа» для рассмотрения в качестве исследовательской статьи в PLOS Biology. Ваша рукопись была оценена редакторами PLOS Biology, академическим редактором с соответствующим опытом и несколькими независимыми рецензентами.

Рецензии на вашу рукопись приложены ниже. Как вы увидите, хотя рецензенты находят исследование интересным, они также подняли ряд проблем, которые необходимо решить, прежде чем мы сможем рассмотреть вашу рукопись для публикации. В частности, рецензенты отметили, что некоторые из выводов, сделанных в исследовании, не подтверждаются должным образом данными, и в редакционном плане мы находим комментарии рецензента 3 наиболее тревожными. В свете рецензий мы не сможем принять текущую версию рукописи, но будем рады повторной подаче сильно переработанной версии, в которой учтены комментарии рецензентов и учтены их особые опасения.Мы не можем принять какое-либо решение о публикации, пока не увидим исправленную рукопись и ваш ответ на комментарии рецензентов. Ваша исправленная рукопись, вероятно, также будет отправлена ​​рецензентам для дальнейшей оценки.

Мы ожидаем получить вашу исправленную рукопись в течение 3 месяцев.

Пожалуйста, напишите нам ([email protected]), если у вас есть какие-либо вопросы или проблемы, или вы хотите запросить продление. На данном этапе ваша рукопись официально находится на рассмотрении в нашем журнале; пожалуйста, сообщите нам по электронной почте, если вы не собираетесь подавать исправление, чтобы мы могли прекратить рассмотрение рукописи в PLOS Biology.

**ВАЖНО – ОТПРАВКА ВАШЕЙ ПЕРЕСМОТРКИ**

Ваши исправления должны учитывать конкретные моменты, сделанные каждым рецензентом. Вместе с исправленной рукописью предоставьте следующие файлы:

1. Файл «Ответы рецензентам» — в нем должны быть подробно описаны ваши ответы на редакционные запросы, представлен пошаговый ответ на все комментарии рецензентов и указать изменения, внесенные в рукопись.

*ПРИМЕЧАНИЕ. В своем пошаговом ответе рецензентам предоставьте полный контекст каждого отзыва.Не цитируйте выборочно абзацы или предложения, чтобы ответить на них. Весь набор комментариев рецензента должен присутствовать в полном объеме, и по каждому конкретному пункту следует отвечать индивидуально, пункт за пунктом.

Вы также должны указать любую дополнительную релевантную литературу, которая была опубликована после первоначального представления, и упомянуть любые дополнительные цитаты в своем ответе.

2. В дополнение к чистой копии рукописи, пожалуйста, также загрузите версию рукописи с отслеживанием изменений, в которой указаны внесенные изменения.Это должно быть загружено как “Связанный” тип файла.

*Контрольный список для повторной отправки*

Когда вы будете готовы повторно отправить свою исправленную рукопись, обратитесь к этому контрольному списку повторной подачи: https://plos.io/Biology_Checklist

Чтобы отправить исправленную версию вашей рукописи, пожалуйста, перейдите на https://www.editorialmanager.com/pbiology/ и войдите в систему как автор. Щелкните ссылку с надписью «Отправки, требующие пересмотра», где вы найдете свою запись о представлении.

Пожалуйста, обязательно ознакомьтесь со следующими важными политиками и рекомендациями при подготовке вашей редакции:

*Опубликованное рецензирование*

Обратите внимание, что при формировании вашего ответа, если ваша статья будет принята, у вас может быть возможность сделать рецензирование история в открытом доступе.Запись будет включать письма с решениями редактора (с рецензиями) и ваши ответы на комментарии рецензентов. Если вы отвечаете требованиям, мы свяжемся с вами, чтобы принять или отказаться. Пожалуйста, смотрите здесь для более подробной информации:

https://blogs.plos.org/plos/2019/05/plos-journals-now-open-for-published-peer-review/

*Политика данных PLOS*

Обратите внимание, что в качестве условия публикации политика данных PLOS (http://journals.plos.org/plosbiology/s/data-availability) требует, чтобы вы сделали доступными все данные, использованные для рисования выводы, сделанные в вашей рукописи.Если вы еще этого не сделали, вы должны включить любые данные, использованные в вашей рукописи, либо в соответствующие репозитории, либо в текст рукописи, либо в качестве вспомогательной информации (примечание: сюда входят любые числовые значения, которые использовались для создания графиков, гистограмм и т. д. ). Пример см. здесь: http://www.plosbiology.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pbio.1001908#s5

*Политика данных блотов и гелей*

Нам требуются исходные, необрезанные и минимально скорректированные изображения, подтверждающие все результаты блотов и гелей, представленные в рисунках статьи или в файлах вспомогательной информации.Нам потребуются эти файлы, прежде чем рукопись будет принята, поэтому подготовьте их сейчас, если вы еще не загрузили их. Пожалуйста, внимательно прочитайте наши рекомендации по подготовке и загрузке этих данных: https://journals.plos.org/plosbiology/s/figures#loc-blot-and-gel-reporting-requirements.

*Депонирование протоколов*

Чтобы повысить воспроизводимость ваших результатов, мы рекомендуем, если это применимо, поместить ваши лабораторные протоколы в протоколы.io, где протоколу может быть присвоен собственный идентификатор (DOI), чтобы его можно было цитировать независимо в будущем.Кроме того, PLOS ONE предлагает возможность публикации рецензируемых статей Lab Protocol, в которых описываются протоколы, размещенные на protocols.io. Дополнительную информацию о протоколах обмена можно найти по адресу https://plos.org/protocols?utm_medium=editorial-email&utm_source=authorletters&utm_campaign=protocols

Еще раз спасибо за вашу заявку в наш журнал. Мы надеемся, что наш редакционный процесс до сих пор был конструктивным, и мы приветствуем ваши отзывы в любое время. Пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам, если у вас есть какие-либо вопросы или комментарии.

С уважением,

Лукас Смит

Заместитель главного редактора

PLOS Biology

[email protected]

******************************************************* *****

ОБЗОРЫ:

Рецензент №1: В этой рукописи авторы исследовали кальциевую активность астроцитов и нейронов гиппокампа, связанную с пространственной информацией мышей, перемещающихся в виртуальном пространстве. Чтобы исследовать это, авторы использовали генетически закодированные индикаторы кальция и одновременную двухфотонную визуализацию кальция астроцитов и нейронов гиппокампа у бодрствующих мышей.

Авторы разработали и использовали тщательный и комплексный анализ кальциевой активности сомы и отростков астроцитов, а также нейронов в зависимости от виртуального пространственного положения животного. Исследование дает исчерпывающую характеристику сигналов, которые можно обобщить в двух важных сообщениях: 1) активность астроцитов в сомах и отростках модулируется пространственным положением мышей, что указывает на то, что они кодируют пространственную информацию; 2) астроциты имеют более широкую ширину поля ответа и другое распределение положения поля, чем нейроны, что предполагает дополнительную и синергетическую пространственную информацию, обрабатываемую астроцитами и нейронами.

Это захватывающее и элегантное исследование, которое добавляет ценную информацию, касающуюся актуальной темы современной нейробиологии, физиологии астроцитов и их активного участия в функционировании мозга. В частности, настоящая демонстрация того, что астроциты кодируют пространственную информацию, то есть астроциты действуют как клетки места, является прорывным открытием, которое меняет наше представление об обработке информации в мозге.

Рукопись представляет собой очень исчерпывающее и глубокое исследование, в котором представлены новые и интересные результаты, которые очень убедительны.Кроме того, исследование является методологически и технически адекватным, с элегантным и подходящим экспериментальным дизайном для получения надежных результатов. Сделанные выводы хорошо подтверждаются экспериментальными данными.

Поэтому у меня мало замечаний по данной рукописи. Несмотря на множество достоинств, я также обнаружил некоторые недостатки, которые необходимо устранить, чтобы улучшить и без того высокое качество рукописи.

Таким образом, представленные результаты являются новыми и актуальными.Я верю, что настоящая рукопись окажет положительное и сильное влияние на область нейробиологии. Она имеет большое значение для публикации в PLOS Biology.

Особые комментарии

1. При анализе событий, связанных с кальцием, авторы описывают в Методах: «Для каждой трассы вычислялось стандартное отклонение (σ1) сигнала, и значения, превышающие порог, установленный на ± σ1, удалялись из трассы. Эта процедура исключены большие переходные процессы». Авторы должны предоставить обоснование того, почему эти крупные события были исключены.Если они не исключены, будут ли представленные результаты действительными?

2. Для одновременного мониторинга активности астроцитов и нейронов авторы вводили вирус, содержащий различные генетически кодируемые индикаторы кальция, под клеточно-специфическими промоторами, которые, как ожидается, будут обеспечивать клеточно-специфическую экспрессию. Хотя этот подход широко и уверенно используется, авторы должны предоставить количественную иммуногистохимическую оценку того, что это имеет место в их собственных руках. Это очень простой элемент управления, необходимый для поддержки достоверности данных.

3. Используемый анализ, безусловно, сложен и представляет собой демонстрацию силы, возможно, необходимую для раскрытия полученных результатов. Он идеально определен и обеспечивает надежные результаты. Тем не менее, можно задаться вопросом, не могут ли такие результаты быть «артефактом» анализа. Авторы могли бы использовать некоторые элементы управления, чтобы отказаться от этой возможности. Например, как происходит активность астроцитов и нейронов в статическом положении при отсутствии виртуальной навигации? Это, вероятно, ненужный элемент управления, но он может повысить надежность результатов за счет исключения некоторых потенциальных аналитических артефактов.

4. В нескольких случаях авторы предполагают, что астроцитарное кодирование пространственной информации участвует в обработке информации мозгом. Например, на странице 4, строка 78: «Таким образом, передача сигналов кальция астроцитами участвует в кодировании пространственной информации в гиппокампе». Хотя я убежден в результатах, что астроциты кодируют пространственную информацию, тот факт, что это преобразуется в обработку информации гиппокампом, на самом деле не проверялся. Это интересная гипотеза, но она потребует дополнительных исследований, безусловно, выходящих за рамки настоящей рукописи, таких как специфические манипуляции с активностью астроцитов и анализ результатов.Если авторы не проводят такие исследования, они должны ограничить интерпретацию результатов в разделе «Результаты», ограничивая такие гипотетические идеи обсуждением.

Мелкие комментарии

1. Формулировка названия может ввести в заблуждение. «Глиальные клетки места» не совсем корректны. Существует несколько типов глиальных клеток, но исследование сосредоточено на астроцитах.

Рецензент №2: В этой статье впервые показано, что астроциты в области СА1 гиппокампа имеют поля места, которые замостили виртуальную среду так же, как нейронные клетки места.Кроме того, они показывают, что астроцитарные отростки одних и тех же астроцитов могут иметь различия в расположении поля места относительно тела клетки. Наконец, они утверждают, что астроциты несут уникальную пространственную информацию от популяций нейронов, которая синергетически с нейронами усиливает общие свойства пространственного кодирования области СА1. Это новая информация, которая вносит значительный вклад в эту область и открывает новые возможности для изучения, поскольку астроциты были исключены из большинства теорий функции гиппокампа, поскольку мы не знали их кодирующих свойств.Однако некоторые из их выводов подтверждаются данными, которые, как мне кажется, нуждаются в дальнейшем анализе, чтобы быть убедительными.

Эти комментарии расположены в том порядке, в котором я читал рукопись, а не в порядке их значимости:

* Они показывают среднюю активность астроцитов в зависимости от положения (рис. 1E), но было бы информативно увидеть пробную версию. – пробные следы, чтобы получить представление об их изменчивости, учитывая, что это первый раз, когда поле наблюдает поля астроцитарного места (PF).

* В соответствии с этим они должны количественно определить параметры этих PF астроцитов, такие как сверхдисперсия1 и точность2, и сравнить их с PF нейронов.

* А что со стабильностью ПФ? Изменяются ли они, сдвигаются или переназначаются в течение сеанса? Было показано, что нейронные PF смещаются в CA1 и даже переназначаются в течение более длительных периодов времени. Таким образом было бы хорошо анализировать динамику астроцитарного ПФ. Они могут быть более или менее стабильными, чем нейронные ПФ, и это важно знать.

* В недавней статье о bioRxiv3 показано, что астроциты CA1 имеют линейно возрастающий сигнал вознаграждения в почти идентичной задаче, как показано здесь. Авторы тоже видят эти сигналы? Кроме того, есть ли чрезмерное представление зоны вознаграждения в астроцитарных PF, подобное тому, что наблюдается в нейронных PF?

* Какова их интерпретация того, что лежит в основе кальциевых сигналов астроцитов? Что является источником кальция? Какие мембранные потенциалы, вероятно, приводят к сигналам кальция, которые они видят? Что, как считается, вызывает деполяризацию в астроцитах и ​​чем они отличаются от входов, управляющих пирамидными клетками СА1? Необходима дискуссия о том, как авторы думают об этих сигналах.

* Я думаю, что трудно интерпретировать сравнение между динамикой кальция в астроцитах и ​​нейронах (рис. 4), поскольку одно связано с лежащими в основе потенциалами действия, а другое связано с постепенными изменениями Vm. Буферизация кальция также, вероятно, сильно отличается в астроцитах от нейронов (что они кратко упоминают в обсуждении). Кроме того, GCaMP (астроциты) и RGeCO (нейроны) имеют разную кинетику. Следовательно, сделать вывод о том, что ширина PF или любые другие свойства различны, сложно и требуются дополнительные экспериментальные доказательства (ephys).Я не прошу их проводить эти эксперименты, поскольку они чрезвычайно сложны, но я прошу их смягчить свои выводы, основанные на этих путаницах, или провести дополнительный анализ, чтобы лучше подтвердить свои утверждения здесь.

* Supp На рис. 9 показана средняя корреляция пар A-N ячеек с высокой пространственной информацией с выводом о том, что они значительно коррелированы выше 0 (строка 144). Однако размер эффекта очень мал. Было бы гораздо лучше количественно оценить величину этого эффекта с помощью другого анализа.Я рекомендую авторам использовать подходы к оценке этих наборов данных4. Это делает упор на сообщение размеров эффекта с выражением неопределенности (интервальные оценки), чтобы сделать более точные выводы: это противодействует чрезмерно уверенным утверждениям из неадекватных выборок, улучшает сравнение результатов в разных контекстах и ​​нормализует публикацию незначительных эффектов4.

* В строках 145-146 указано: «Корреляция между парами астроцитарных ROI обычно выше, чем корреляция между парами нейронных ROI».Но разве этого не следует ожидать, учитывая, что популяция ROI астроцитов включает процессы, являющиеся частью одного и того же астроцита? И хотя авторы обнаружили, что процессы одного и того же астроцита могут иметь разные PF, они все же, вероятно, будут более коррелированы, чем PF других астроцитов. Следовательно, сравнение этих популяций нейронов и астроцитов некорректно.

* Рис. 5А, опять же, размеры эффекта для сравнения в некоторых случаях очень малы. Делать выводы на их основе проблематично.Здесь снова следует использовать оценочные подходы. Это может повлиять на основной вывод статьи, изложенный в строке 160: «информация, переносимая парами, также была синергетической». При таких малых размерах эффекта авторам нужно быть очень осторожными, делая такой вывод. Проведение оценочного анализа поможет в этом отношении и покажет, насколько велики или малы эти различия, и выводы должны быть основаны на этом.

* Строки 178-180 «Комплементарное и синергетическое кодирование пространственной информации в смешанных парах предполагает, что астроцитарная сеть несет дополнительную информацию, уникальную от той, что закодирована в нейронных цепях также на уровне всей популяции.Но обязательно ли это так? Означает ли это, что астроцитарная информация действительно «уникальна» или это та же самая информация, она просто добавляется, чтобы помочь декодеру? Авторы должны немного подробнее объяснить свое мнение по этому вопросу. являются местом кодирования, поэтому в этом смысле они не уникальны. И производительность декодера всегда зависит от количества используемых ячеек. Например, если бы они записывали из большего количества ячеек места, их декодер работал бы лучше. В строках 187–188 говорится: «Это результат доказал, что популяция ROI астроцитов несет информацию, не обнаруженную в нейронах или их взаимодействиях.” Но авторы записывали не со всех нейронов. И опять же, если бы они добавили больше нейронов, их декодер работал бы лучше. Смогут ли они тогда заключить, что дополнительные нейроны, с которых они записали, уникальны?

* Строки 209-211 “поле ответа Положение было распределено в астроцитах по-разному по сравнению с нейронами, что позволяет предположить, что астроциты СА1 не просто отражают информацию о положении, закодированную в пирамидных нейронах СА1». сомы.Кроме того, популяция независимых астроцитов намного меньше, чем популяция нейронов (см. рис. 2B по сравнению с 4C, справа). Несмотря на то, что авторы показали, что отростки одного и того же астроцита могут иметь разные PF, они все же более коррелированы, чем независимые астроциты. Эти факторы будут влиять на карту населения коридора, что затрудняет вывод о дифференциальном распределении астроцитов. Опять же, они также не вели записи со всех нейронов или всех астроцитов, и количество независимых астроцитов и нейронов не совпадало.

* Я думаю, что авторам следует расширить свое обсуждение, включив в него то, для чего, по их мнению, предназначены последующие эффекты астроцитарного пространственного кода? Очевидно, нейронный пространственный код проецируется в другие области мозга и используется там для определенных вычислений. Но астроцитарный пространственный код остается в пределах гиппокампа. Какова его конечная функция? Использует ли мозг эту информацию для кодирования внешнего пространства, и если да, то как? Или, возможно, он выполняет модулирующую роль в самом CA1.Если бы мы инактивировали астроциты, каким был бы прогноз? Будет ли затронут нейронный пространственный код? Расширение этих идей было бы очень полезно для раздела обсуждения.

1 Fenton, A. A. et al. Внимание-подобная модуляция разряда клеток места гиппокампа. J Neurosci 30, 4613-4625, doi:10.1523/JNEUROSCI.5576-09.2010 (2010).

2 Шеффилд, М. Е. и Домбек, Д. А. Временное преобладание кальция в дендритном дереве предсказывает свойства поля места.Nature 517, 200–204, doi: 10.1038/nature13871 (2015).

3 Дорон А. и др. Астроциты гиппокампа кодируют местоположение вознаграждения. bioRxiv, 2021.2007.2007.451434, doi:10.1101/2021.07.07.451434 (2021).

4 Калин-Джагеман, Р. Дж. и Камминг, Г. Оценка для лучшего вывода в неврологии. eNeuro 6, doi:10.1523/ENEURO.0205-19.2019 (2019).

Рецензент №3: Curreli et al. исследовали, как кальциевые сигналы астроцитов гиппокампа участвуют в кодировании пространственной информации. Авторы выразили генетический индикатор кальция в астроцитах гиппокампа взрослых мышей и обнаружили, что кальциевая активность астроцитов из соматов и процессы реагируют на пространственные сигналы в среде виртуальной реальности с двухфотонной визуализацией in vivo.Далее авторы исследовали активность нейронов в тех же условиях виртуальной реальности и показали, что кальциевые сигналы астроцитов и нейронов кажутся коррелированными и передают синергетическую информацию.

Все больше данных свидетельствует о важности передачи сигналов кальция астроцитами в регуляции нейронных цепей и поведения животных. Тем не менее, все еще неясно, используют ли астроциты свои разнообразные кальциевые сигналы для кодирования пространственной информации. Таким образом, работа Curreli et al. является новым с этой точки зрения.Однако некоторые выводы, сделанные на основе данных, открыты для интерпретации, и есть несколько основных вопросов, которые авторам необходимо надлежащим образом решить. Авторы также не исключают возможности того, что астроциты исключительно имитируют или реагируют на изменения соседних нейронов и, следовательно, кажутся реагирующими на пространственные сигналы. Без дополнительных подтверждающих доказательств открытие «астроцитарных клеток места» неубедительно.

Основные пункты:

1. Авторы визуализировали сигналы кальция астроцитов в виртуальной реальности с однонаправленным или двунаправленным коридором, что значительно ограничивает размерность исследования и пространственную информацию, которые обычно содержатся в реальной среде.Следовательно, вместо того, чтобы реагировать на пространственную информацию, как предполагают авторы, обнаруженные кальциевые сигналы астроцитов могут индуцироваться просто визуальными стимулами, такими как изображения, освещение, формы и т. д., с экрана в условиях виртуальной реальности. Без дополнительных доказательств неубедительно заключить, что существуют «астроцитарные клетки места» и их кальциевые сигналы кодируют пространственную информацию.

2. Астроциты проявляют спонтанные кальциевые сигналы, возникающие в отсутствие внешних раздражителей.Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемые кальциевые реакции астроцитов в виртуальной реальности не связаны со случайными действиями, необходимы дополнительные средства контроля. Например, какова исходная кальциевая активность ранее идентифицированных «клеток места» без виртуальной реальности? Как «астроцитарные клетки места» реагируют на один и тот же паттерн виртуальной реальности, например. запись с отображением только вертикальных линий? Как они реагируют на чередующиеся модели виртуальной реальности, например. запись с сетчатым узором -> вертикальные линии -> сетчатый узор? Эти эксперименты помогут выяснить, являются ли кальциевые ответы астроцитов специфичными для определенных пространственных сигналов, что ожидается для клетки места.

3. На рис. 4 и нейроны, и астроциты были изображены «в пирамидальном слое СА1», и их кальциевые сигналы были проанализированы для выявления пространственной корреляции. Однако в пирамидном слое присутствует очень мало астроцитов, поэтому неясно, как оба типа клеток были визуализированы одновременно с помощью двухфотонной микроскопии. Если нейроны и астроциты действительно были захвачены из одной и той же фокальной плоскости, то авторам необходимо предоставить репрезентативные изображения. На рис. 4А показаны только астроциты, но не нейроны.Если, однако, нейроны и астроциты были отобраны из разных фокальных плоскостей, то авторы должны указать это и принять во внимание разницу в глубине для последующего пространственного анализа на рис. 4F. Текущая презентация и описание вводят в заблуждение.

Второстепенные точки:

1. Для облегчения визуализации in vivo аспирировали кору над гиппокампом. Тем не менее, астроциты могут стать реактивными и изменить сигналы кальция из-за инвазивной хирургической процедуры, эту возможность следует проверить с помощью окрашивания реактивных маркеров астроцитов или морфологического анализа.

2. Как уже указывали авторы, свойства кальциевых сигналов астроцитов из разных клеточных компартментов (например, соматы, ветви и отростки) принципиально различаются. Интересно, что распределение ROI от сомы по полю аналогично таковому от отростков. Однако неясно, сколько ROI было идентифицировано из процессов, принадлежащих одним и тем же астроцитам. Неудивительно, что ROI из одного и того же клеточного компартмента одних и тех же астроцитов сильно коррелируют, как показано на рис.2F и рис. 2G. Таким образом, авторам следует отделить внутриклеточную корреляцию от межклеточной корреляции. Объединение всех областей интереса вместе может упустить из виду разнообразие сигналов кальция астроцитов. Помимо количества ROI и мышей, авторы также должны уточнить количество клеток в анализе.

3. На рис. 3B, поскольку «уровень вероятности» чрезвычайно низок, он не отображается на гистограмме. Ось Y должна быть скорректирована, чтобы показать все данные, например. начиная с -0,1.

AMD рассказывает об архитектурах процессоров Zen 4, Zen 5 и графических процессоров RDNA 3 для следующего поколения продуктов Ryzen, EPYC и Radeon

В интервью с Dr.Ян Катресс из Anandtech, генеральный директор AMD, доктор Лиза Су, сказал, что их команды процессоров полностью сосредоточены на своих ядрах Zen 4 и Zen 5 следующего поколения, в то время как команда GPU в настоящее время усердно работает над разработкой архитектуры RDNA 3.

AMD рассказывает об архитектурах процессоров Zen 4, Zen 5 и графических процессоров RDNA 3 для продуктов Ryzen, EPYC и Radeon следующего поколения

Лиза заявила, что их подразделение ЦП, работающее над ядрами Zen, проделало феноменальную работу, но лучшее еще впереди. Ядерные архитектуры нового поколения AMD Zen 4 и Zen 5 уже готовятся и будут чрезвычайно конкурентоспособны.

Пользовательские видеокарты AMD Radeon RX 6400, перечисленные розничными продавцами за несколько недель до запуска

«Марк, Майк и их команды проделали феноменальную работу. Мы так же хороши, как и сегодня, с продуктом, но с нашими амбициозными дорожными картами мы сосредоточены на Zen 4 и Zen 5, чтобы быть чрезвычайно конкурентоспособными.

через Anandtech

Рик Бергман из AMD о четырехъядерных процессорах Zen следующего поколения для процессоров Ryzen

В. Какая часть прироста производительности процессоров AMD Zen 4, которые, как ожидается, будут использовать 5-нм техпроцесс TSMC и могут появиться в начале 2022 года, будет зависеть от прироста количества инструкций за такт (IPC), а не от количества ядер и тактовой частоты скорость увеличивается.

Бергман: «[Учитывая] зрелость архитектуры x86 в настоящее время, ответ должен быть вроде всего вышеперечисленного. Если вы посмотрите на наш технический документ по Zen 3, это будет длинный список вещей, которые мы сделали, чтобы получить эти 19% [прироста IPC]. Zen 4  будет иметь аналогичный длинный список вещей, где вы просматриваете все, от кешей до предсказания ветвлений и [до] количества вентилей в конвейере выполнения. Все тщательно изучается, чтобы выжать больше производительности.

«Конечно, [производственный] процесс открывает нам дополнительные возможности для [получения] более высокой производительности на ватт и так далее, и мы также воспользуемся этим».

AMD EVP, Рик Бергман, via The Street

На данный момент мы мало знаем о Zen 4, не говоря уже о Zen 5, но эта архитектура обещает быть очень полезной для потребительского и серверного сегментов. Планируется, что архитектура Zen 4 будет запущена в 2021 году, и процессоры Ryzen, основанные на этой архитектуре, станут первыми, кто получит поддержку на совершенно новой платформе AM5, которая будет предлагать DDR5 и USB 4 следующего поколения.0 поддержка.

Помимо платформы, AMD также рассматривает возможность увеличения количества ядер в каждой соответствующей линейке ЦП. В настоящее время семейство процессоров AMD масштабируется до 64 ядер на серверах и высокопроизводительных настольных компьютерах, до 16 ядер на обычных настольных компьютерах и до 8 ядер на мобильных платформах. Так было с поколениями Zen 2 и Zen 3. В будущем мы увидим больше ядер, предположительно 96 ядер для серверов/HEDT, 32 ядра для основных настольных компьютеров и 12-16 ядер для мобильного сегмента.Это станет возможным благодаря меньшему технологическому узлу и изменениям в конструкции, которые позволят AMD использовать больше модулей CCD/CCX в своих предложениях Zen следующего поколения.

‘В будущем будет больше ядер – я бы не сказал, что это предел! Он появится, когда мы масштабируем остальную часть системы». 

через Anandtech

Дорожная карта ЦП AMD (2017-2022)

год 2017 2018 2019 2020 2021 2021-2022 2023 2024
Архитектура Zen (1) Zen (1) / Zen+ Zen (2) / Zen+ Zen (3) / Zen 2 Zen (3) / Zen 9 2 (+) Дзен (4) / Дзен 3 (+) Дзен (4) Дзен (4) / Дзен (5)
Процесс узел 14 нм 14 нм / 12 нм 7 нм 7 нм 7nm 5nm / 6nm 5nm 5nm / 3nm
Server EPYC ‘Naples’ Epyc ‘Rome’ EPYC ‘Rome’ EPYC ‘Rome’ EPYC ‘Milan’ EPYC ‘Genoa’ TBD TBD
Max Server Cores / Threams 32/64 32/64 64/128 64/128 64/128 64/128 TBD TBD TBD
Высококонечный рабочий стол Ryzen Threadripper 1000 серии (White Haven) ryzen Threadripper 2000 Series (Coflax) Ryzen Threadripper 3000 Series (Castle Peak) Ryzen Threadripper 3000 Series (Пик замка) Ryzen Threadripper серии 5000 (Шагал) Ryzen Threadripper серии 6000 Ryzen Threadripper серии 7000 Ryzen Threadripper серии 8000
Ryzen Smase Ryzen 1000 серии Ryzen 2000 серии Ryzen 3000 серии Ryzen 3000 серии Ryzen 4000/5000 серии Ryzen 5000 серии Ryzen 6000 серии Ryzen 7000 серии Ryzen 8000 серии
Max Hedt Cores / Threams 16/32 32/64 64/128 64/128 64/128 64/128 TBD TBD TBD
Mainstream Desktop 9027 серия Ryzen 1000 (Summit Ridge) Ryzen 2000 Series (Pinnacle Ridge) Ryzen 3000 Series (Matisse) серии Ryzen 5000 (Vermeer) ryzen 5000/6000 (Уорхол ) Ryzen серии 6000/7000 (Raphael) Подлежит уточнению Подлежит уточнению
Max Mainstream Cores / Threams 8/16 8/16 16/32 16/32 16/32 16/32 16/32 TBD TBD
Бюджетный APU N / A Ryzen 2000 Series (Raven Ridge) ryzen 3000 Series (Picasso Zen +) ryzen 4000 (Renoir Zen 2) ryzen 5000 (Cezanne Zen 3) Ryzen серии 6000 (Rembrandt Zen 3+) Ryzen серии 7000 (Phoenix Zen 4) Ryzen 8000 (Strix Point Zen 5)

AMD также рассказывает о графических процессорах и о том, как Дэвид Ван и его команда из RTG воплотили в жизнь RDNA 2.Они очень довольны результатами (производительность на ватт / общий прирост производительности), которые были достигнуты с ядрами RDNA 2-го поколения, и та же философия будет использоваться при разработке архитектуры RDNA третьего поколения или RDNA 3.

Что касается графических процессоров, Дэвид Ванг и его команда сосредотачиваются на наших долгосрочных планах, и мы выбираем правильное сочетание рисков, чтобы получить инновации, производительность и предсказуемость. Ставки сделаны, и мы отслеживаем прогресс. Мы довольны RDNA2 по производительности на ватт и общей производительности, и мы уделяем большое внимание RDNA3.

через Anandtech

Рик Бергман из AMD о графических процессорах следующего поколения RDNA 3 для видеокарт Radeon RX

В. Стремится ли AMD к своим графическим процессорам RDNA 3, которые будут использовать более продвинутый производственный процесс, для обеспечения повышения производительности на ватт, аналогичного улучшениям на 50% и более, обеспечиваемым ее графическими процессорами RDNA 2, и ее будущим планам по технология Infinity Cache, используемая графическими процессорами RDNA 2.

Бергман: «Давайте сделаем шаг назад и поговорим о преимуществах обоих.Так почему же мы довольно агрессивно нацелились на производительность на ватт [улучшения] наших RDNA 2 [графических процессоров]. И тогда да, у нас есть такое же обязательство по RDNA 3 ».

«Это так важно во многих отношениях, потому что, если ваша мощность слишком высока — как мы видели у наших конкурентов — внезапно нашим потенциальным пользователям приходится покупать более мощные блоки питания, очень продвинутые решения для охлаждения. И во многих отношениях, что очень важно, это существенно увеличивает [перечень материалов] платы. Это точка зрения рабочего стола.И неизменно это означает либо повышение розничной цены, либо снижение стоимости графического процессора».

«Итак, [есть] на самом деле много эффективности… если вы можете существенно улучшить производительность на ватт. Со стороны ноутбука это, конечно, еще более очевидно, потому что вы находитесь в очень ограниченном пространстве, вы можете просто снова повысить производительность этой платформы без каких-либо экзотических решений для охлаждения… Мы сосредоточились на этом в RDNA 2. Это большое внимание также уделяется RDNA 3 ».

«В Infinity Cache это тоже в какой-то степени связано с этим.Если вы давно занимаетесь графикой, то понимаете, что существует довольно хорошая корреляция между пропускной способностью памяти и производительностью. И поэтому обычно вы делаете это так: вы увеличиваете скорость своей памяти и расширяете шину [памяти], чтобы повысить производительность. К сожалению, обе эти вещи увеличивают энергопотребление [потребление]».

AMD EVP, Рик Бергман, via The Street

Архитектура AMD Zen 4 будет напрямую конкурировать с линейкой Intel Alder Lake, а RDNA 3 будет работать с обновленными графическими процессорами NVIDIA Ampere, которые, вероятно, будут представлены к концу 2021 или в начале 2022 года.

%PDF-1.6 % 4171 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 4171 389 0000000016 00000 н 0000014227 00000 н 0000014362 00000 н 0000014563 00000 н 0000014608 00000 н 0000014663 00000 н 0000014711 00000 н 0000014765 00000 н 0000014819 00000 н 0000014876 00000 н 0000014913 00000 н 0000015379 00000 н 0000015407 00000 н 0000015519 00000 н 0000015602 00000 н 0000015682 00000 н 0000015765 00000 н 0000015847 00000 н 0000015929 00000 н 0000016012 00000 н 0000016094 00000 н 0000016177 00000 н 0000016259 00000 н 0000016341 00000 н 0000016424 00000 н 0000016506 00000 н 0000016588 00000 н 0000016670 00000 н 0000016752 00000 н 0000016834 00000 н 0000016916 00000 н 0000016999 00000 н 0000017081 00000 н 0000017164 00000 н 0000017246 00000 н 0000017329 00000 н 0000017411 00000 н 0000017494 00000 н 0000017576 00000 н 0000017659 00000 н 0000017741 00000 н 0000017823 00000 н 0000017906 00000 н 0000017989 00000 н 0000018071 00000 н 0000018153 00000 н 0000018235 00000 н 0000018317 00000 н 0000018400 00000 н 0000018482 00000 н 0000018564 00000 н 0000018646 00000 н 0000018728 00000 н 0000018810 00000 н 0000018892 00000 н 0000018975 00000 н 0000019057 00000 н 0000019139 00000 н 0000019222 00000 н 0000019304 00000 н 0000019386 00000 н 0000019469 00000 н 0000019552 00000 н 0000019634 00000 н 0000019716 00000 н 0000019797 00000 н 0000019878 00000 н 0000019959 00000 н 0000020041 00000 н 0000020123 00000 н 0000020206 00000 н 0000020288 00000 н 0000020369 00000 н 0000020450 00000 н 0000020532 00000 н 0000020614 00000 н 0000020696 00000 н 0000020778 00000 н 0000020861 00000 н 0000020943 00000 н 0000021025 00000 н 0000021107 00000 н 0000021189 00000 н 0000021271 00000 н 0000021353 00000 н 0000021435 00000 н 0000021517 00000 н 0000021600 00000 н 0000021682 00000 н 0000021765 00000 н 0000021847 00000 н 0000021929 00000 н 0000022012 00000 н 0000022094 00000 н 0000022175 00000 н 0000022258 00000 н 0000022340 00000 н 0000022422 00000 н 0000022505 00000 н 0000022587 00000 н 0000022669 00000 н 0000022751 00000 н 0000022833 00000 н 0000022915 00000 н 0000022997 00000 н 0000023079 00000 н 0000023161 00000 н 0000023243 00000 н 0000023326 00000 н 0000023408 00000 н 0000023490 00000 н 0000023572 00000 н 0000023654 00000 н 0000023737 00000 н 0000023819 00000 н 0000023901 00000 н 0000023983 00000 н 0000024065 00000 н 0000024147 00000 н 0000024230 00000 н 0000024313 00000 н 0000024395 00000 н 0000024477 00000 н 0000024558 00000 н 0000024640 00000 н 0000024723 00000 н 0000024805 00000 н 0000024888 00000 н 0000024970 00000 н 0000025052 00000 н 0000025134 00000 н 0000025215 00000 н 0000025297 00000 н 0000025381 00000 н 0000025464 00000 н 0000025546 00000 н 0000025628 00000 н 0000025712 00000 н 0000025795 00000 н 0000025877 00000 н 0000025961 00000 н 0000026044 00000 н 0000026126 00000 н 0000026208 00000 н 0000026290 00000 н 0000026372 00000 н 0000026454 00000 н 0000026536 00000 н 0000026619 00000 н 0000026703 00000 н 0000026786 00000 н 0000026868 00000 н 0000026950 00000 н 0000027032 00000 н 0000027114 00000 н 0000027196 00000 н 0000027278 00000 н 0000027360 00000 н 0000027442 00000 н 0000027524 00000 н 0000027605 00000 н 0000027687 00000 н 0000027771 00000 н 0000027854 00000 н 0000027936 00000 н 0000028018 00000 н 0000028100 00000 н 0000028182 00000 н 0000028264 00000 н 0000028346 00000 н 0000028430 00000 н 0000028513 00000 н 0000028594 00000 н 0000028676 00000 н 0000028758 00000 н 0000028840 00000 н 0000028922 00000 н 0000029004 00000 н 0000029088 00000 н 0000029171 00000 н 0000029253 00000 н 0000029335 00000 н 0000029417 00000 н 0000029501 00000 н 0000029584 00000 н 0000029666 00000 н 0000029748 00000 н 0000029830 00000 н 0000029912 00000 н 0000029994 00000 н 0000030078 00000 н 0000030161 00000 н 0000030243 00000 н 0000030327 00000 н 0000030410 00000 н 0000030493 00000 н 0000030575 00000 н 0000030657 00000 н 0000030740 00000 н 0000030822 00000 н 0000030904 00000 н 0000030986 00000 н 0000031068 00000 н 0000031150 00000 н 0000031232 00000 н 0000031315 00000 н 0000031396 00000 н 0000031477 00000 н 0000031558 00000 н 0000031640 00000 н 0000031721 00000 н 0000031803 00000 н 0000031884 00000 н 0000031965 00000 н 0000032047 00000 н 0000032129 00000 н 0000032211 00000 н 0000032291 00000 н 0000033051 00000 н 0000033102 00000 н 0000033130 00000 н 0000033159 00000 н 0000033225 00000 н 0000033290 00000 н 0000039876 00000 н 0000040523 00000 н 0000041135 00000 н 0000048060 00000 н 0000048895 00000 н 0000049664 00000 н 0000055755 00000 н 0000060960 00000 н 0000066072 00000 н 0000071140 00000 н 0000076843 00000 н 0000082064 00000 н 0000089170 00000 н 0000095275 00000 н 0000095442 00000 н 0000096296 00000 н 0000353256 00000 н 0000354390 00000 н 0000354654 00000 н 0000354698 00000 н 0000354758 00000 н 0000354834 00000 н 0000354915 00000 н 0000355053 00000 н 0000355145 00000 н 0000355236 00000 н 0000355374 00000 н 0000355518 00000 н 0000355668 00000 н 0000355813 00000 н 0000355906 00000 н 0000356003 00000 н 0000356159 00000 н 0000356242 00000 н 0000356333 00000 н 0000356475 00000 н 0000356582 00000 н 0000356724 00000 н 0000356884 00000 н 0000356972 00000 н 0000357060 00000 н 0000357199 00000 н 0000357302 00000 н 0000357399 00000 н 0000357502 00000 н 0000357545 00000 н 0000357675 00000 н 0000357787 00000 н 0000357906 00000 н 0000357949 00000 н 0000358051 00000 н 0000358159 00000 н 0000358268 00000 н 0000358311 00000 н 0000358442 00000 н 0000358574 00000 н 0000358706 00000 н 0000358840 00000 н 0000358950 00000 н 0000359046 00000 н 0000359180 00000 н 0000359330 00000 н 0000359437 00000 н 0000359542 00000 н 0000359663 00000 н 0000359818 00000 н 0000359911 00000 н 0000360028 00000 н 0000360183 00000 н 0000360291 00000 н 0000360434 00000 н 0000360574 00000 н 0000360678 00000 н 0000360774 00000 н 0000360918 00000 н 0000361017 00000 н 0000361127 00000 н 0000361269 00000 н 0000361365 00000 н 0000361473 00000 н 0000361612 00000 н 0000361698 00000 н 0000361788 00000 н 0000361959 00000 н 0000362065 00000 н 0000362168 00000 н 0000362319 00000 н 0000362444 00000 н 0000362564 00000 н 0000362725 00000 н 0000362846 00000 н 0000362960 00000 н 0000363076 00000 н 0000363181 00000 н 0000363291 00000 н 0000363404 00000 н 0000363541 00000 н 0000363664 00000 н 0000363817 00000 н 0000363927 00000 н 0000364038 00000 н 0000364162 00000 н 0000364265 00000 н 0000364377 00000 н 0000364475 00000 н 0000364615 00000 н 0000364702 00000 н 0000364834 00000 н 0000364988 00000 н 0000365095 00000 н 0000365216 00000 н 0000365359 00000 н 0000365454 00000 н 0000365620 00000 н 0000365730 00000 н 0000365839 00000 н 0000365981 00000 н 0000366070 00000 н 0000366170 00000 н 0000366336 00000 н 0000366442 00000 н 0000366564 00000 н 0000366719 00000 н 0000366805 00000 н 0000366897 00000 н 0000367029 00000 н 0000367138 00000 н 0000367257 00000 н 0000367389 00000 н 0000367492 00000 н 0000367610 00000 н 0000367760 00000 н 0000367875 00000 н 0000367997 00000 н 0000368098 00000 н 0000368227 00000 н 0000368358 00000 н 0000368486 00000 н 0000368613 00000 н 0000368763 00000 н 0000368882 00000 н 0000368985 00000 н 0000369107 00000 н 0000369252 00000 н 0000369373 00000 н 0000369484 00000 н 0000369591 00000 н 0000369683 00000 н 0000369770 00000 н 0000369874 00000 н 0000369975 00000 н 0000370079 00000 н 0000370183 00000 н 0000370290 00000 н 0000370406 00000 н 0000370514 00000 н 0000370622 00000 н 0000370750 00000 н 0000370860 00000 н 0000370961 00000 н 0000371065 00000 н 0000371166 00000 н 0000371264 00000 н 0000371363 00000 н 0000008248 00000 н трейлер ]>> startxref 0 %%EOF 4559 0 объект>поток $=gVW58J:”))]sɹա9C.n

Кондиционирование обостряет пространственное представление поощряемых стимулов в первичной зрительной коре мыши

[…] Основные версии:

1) Наиболее существенным недостатком этой рукописи является ее сильная зависимость от измерения, связанного с изменениями в перекрытии нейронной активности, вызванными различными зрительными стимулами на поверхности коры.

Для внутренних данных визуализации авторы сосредоточили внимание на изменениях в перекрытии нейронной активности на поверхности коры.Однако благодаря данным, представленным на рис. 2 — дополнение к рис. 1, видно, что в действительности данные немного сложнее. […] Авторам следует обсудить этот вывод более прямо, вместо того, чтобы сосредотачиваться на изменении перекрытия.

Результаты экспериментов по внутренней визуализации и визуализации кальция также лишь внешне схожи. Уменьшение перекрытия для тестируемой ориентации в основном связано с изменением «полного» местоположения без вознаграждения (рис. 3C и 3D).Опять же, это нелогично и проблематично, поскольку можно было бы ожидать, что результаты для невознаграждаемого стимула обеспечат базовый уровень. Кроме того, тот факт, что значительное изменение теперь происходит в области коры, соответствующей невознаграждаемому участку, противоположен результатам внутренней оптической визуализации, где изменение было замечено в области коры, соответствующей участку, которому вознаграждается. Поэтому, вопреки утверждению автора, результаты этих двух методов визуализации не совсем согласуются.Об этом следует говорить более прямо.

IOS ΔOverlap является ключевой мерой, предложенной авторами в продвижении повествования о том, что кондиционирование приводит к большему разделению между реакциями, вызванными стимулами местоположения nR и R, по сравнению с ответами на необусловленные (ортогональные) стимулы. С помощью этой меры они подразумевают, что посткондиционирование, NR и R-стимулы уменьшаются при их перекрытии; но поскольку мера — это разница различий, я думаю, что может ввести в заблуждение обращение к наблюдаемому эффекту как таковому.[…] Из этих данных следует, что основной движущей силой эффекта было уменьшение вызванной реакции на стимуляцию nR по всей ее пространственной протяженности в условном случае (и из рисунка 2 — дополнение к рисунку 2C внизу слева, от повышения стимулом R в месте NR).

Из этого комментария мы понимаем, что рецензенты обеспокоены (1) интерпретацией внутренних данных визуализации (в частности, меры перекрытия), которую мы рассматриваем в первую очередь, и (2) связью между собственными данными визуализации и содержанием кальция. данные визуализации, представленные на рисунке 3, которые мы обсудим ниже.

Относительно внутренних данных изображения:

Рецензенты предположили, что концептуально изменение амплитуды ответа может быть самым основным параметром, описывающим связанные с обучением изменения внутренних ответных сигналов, в отличие от производного параметра перекрытия. Мы согласны с рецензентами в том, что снижение амплитуды ответа на тренированный стимул без вознаграждения является важным аспектом изменения после обусловливания, и поэтому скорректировали порядок, в котором мы представляем данные.Теперь мы ясно и прямо указываем в первом абзаце подраздела «Мезоскопические сдвиги в корковых представлениях условных раздражителей», что мы наблюдаем снижение амплитуды ответа на обучаемый непоощряемый раздражитель (по сравнению с ортогональным). Чтобы облегчить интерпретацию эффекта читателем, мы добавили визуализацию средних профилей отклика реальных данных (первоначально представленных на рисунке 2 — дополнение к рисунку 2C) на основном рисунке 2D и добавили панель рисунка (2G). показывающая среднюю амплитуду ответа в разные моменты времени визуализации (с контролем амплитуды по отношению к ортогональным контрольным стимулам).

В следующем абзаце рукописи (подраздел «Мезоскопические сдвиги в корковых представлениях условных раздражителей») мы описываем, как изменение амплитуды ответа может привести к уменьшению перекрытия корковых представлений, и снова способствуем этому, показывая теперь перекрытие -профили всех моментов времени (изначально представленные на рис. 2 — дополнение к рисунку 2D) на основном рисунке (2F). Кроме того, на рисунке 2H показана средняя разница в перекрытии между условными и контрольными стимулами в последовательных точках времени визуализации.Мы считаем, что, представляя данные более подробно и в этом конкретном порядке, читатель должен иметь возможность лучше судить о том, как изменяется отклик внутреннего сигнала в результате кондиционирования, и лучше понимать, как перекрытие вычисляется из «сырой» амплитуды отклика.

Кроме того, как отметили обозреватели, мера перекрытия действительно чувствительна к «сырой» амплитуде отклика. Мы по-прежнему показываем меру перекрытия, потому что считаем, что она лучше всего отражает то, как разделяются два кортико-топически смежных представления.Но теперь, отображая кривые рис. 2D и 2F непосредственно друг под другом на основном рисунке, читатель может лучше увидеть, как перекрытие зависит от амплитуды. Кроме того, мы (1) признали потенциальное искажение амплитуды ответа непосредственно в рукописи в подразделе и (2) представили результаты, полученные с использованием логометрического индекса пространственной селективности, теперь также визуально на основном рисунке 2I.

Чтобы более точно решить вопрос о том, разошлись ли репрезентации вознаграждаемого и невознаграждаемого стимула в корковом пространстве (т.е. трансляцией на корковую плоскость, а не амплитудной модуляцией) добавлен анализ расстояния между вершинами условных стимульных представлений (подраздел «Пространственная организация активности нейронной популяции на условные раздражители»). Хотя после кондиционирования они оказались немного дальше друг от друга по сравнению с контрольной ориентацией, это не сильно отличалось от случайности.

Кроме того, мы хотели бы отметить, что все три показателя (амплитуда ответа на непоощряемый условный раздражитель, перекрытие и индекс пространственной избирательности) сильно коррелируют друг с другом и поэтому, скорее всего, отражают тесно связанные механизмы, действующие как на вознаграждаемый, так и на стимулирующий стимул. и невознаграждаемая сторона представления условного стимула (подраздел «Пространственная организация активности нейронной популяции на условные раздражители»).

Таким образом, мы наблюдали тесно связанные изменения перекрытия, индекса пространственной избирательности и амплитуды ответа на обучаемый стимул без вознаграждения. То, что амплитуда ответа на невознаграждаемый стимул после обусловливания уменьшилась, по нашему мнению, не обязательно противоречит здравому смыслу. Уменьшение амплитуды ответа может произойти, если механизм типа LTD включается во время обусловливания в то время, когда за невознаграждаемым предъявлением стимула не следует вознаграждение, таким образом снижая общий возбудительный драйв на представление невознаграждаемого стимула (см.грамм. Наваби и др., 2014). В качестве альтернативы это может отражать усиление обратной связи, например, от более высокие зрительные области на локальные тормозные нейроны, усиливающие тормозящую способность репрезентации невознаграждаемого стимула (Макино и Комияма, 2015). Эти соображения были добавлены в раздел «Обсуждение».

Относительно связи между внутренней визуализацией и данными визуализации кальция:

Авторы обзора заявили, что результаты, полученные с помощью визуализации кальция, не согласуются с результатами, полученными с помощью внутренней визуализации.В частности, рецензенты отмечают, что изменение Ca-Overlap находится на стороне Full Non-Rewarded. Мы решаем эту проблему, предоставляя лучшее объяснение и обсуждение сходств, а также различий между двумя методами:

1) На рис. 3C показано уменьшение Ca-Overlap, которое является максимальным для регионов с пограничным вознаграждением и без вознаграждения, но также присутствует для региона с полным вознаграждением. Во внутренних данных визуализации сокращение действительно более сильно смещено в сторону вознаграждения.Чтобы предотвратить дальнейшую путаницу в этих результатах, мы добавили дополнительное предложение, указывающее на это сходство, а также на это различие в результатах (подраздел «Пространственная организация активности нейронной популяции для условных раздражителей») и добавили абзац о сравнении внутренних изображения в разделе «Обсуждение». Мы хотели бы отметить здесь, что как меры перекрытия, так и пространственная селективность положительно коррелировали между методами (кальциевая визуализация и внутренняя визуализация; см. подраздел «Пространственная организация активности нейронной популяции для условных стимулов»).

2) На рисунке 3D показана доля настроенных нейронов, которая является мерой того, сколько нейронов в значительной степени настроены на ориентацию стимулов решетки. Эта мера, по нашему мнению, не может быть напрямую сопоставима с данными внутренней визуализации, поскольку она не учитывает реальную амплитуду ответа нейронов. Следовательно, это не говорит ни за, ни против сходства с внутренними данными визуализации. Мы скорректировали текст по этому поводу в подразделе «Нейроны, настроенные на ориентацию, более скудно и сильно реагируют на поощряемые условные стимулы»).

3) Наконец, хотя амплитуда ответа визуализации кальция на обученный стимул без вознаграждения оказалась ниже по сравнению с амплитудой ответа контрольной ориентации в месте стимула без вознаграждения (аналогичный эффект, как и в данных внутренней визуализации, см. Рисунок 3E и вставка для сравнения), эта разница существенно не отличалась и, следовательно, не была полностью последовательной. Чтобы быть полностью прозрачными, мы специально указываем на это в разделе «Результаты». Мы считаем, что эта разница между визуализацией кальция и данными внутренней визуализации может быть частично связана с различной природой двух методов (при внутренней визуализации измеряется смешанный сигнал в разных слоях, отражающий метаболизм и потребление кислорода, в зависимости от активности соматов, дендритов, синапсов, глии и аксонов по сравнению с активностью кальция, точно отражающей соматическую пиковую активность слоя 2/3).Мы добавили этот пункт в раздел Обсуждения.

Мы хотели бы добавить, что амплитуды ответа, наблюдаемые с помощью визуализации кальция и внутренней визуализации, показывают различия в одном и том же направлении (сравнение основной панели со вставкой на рисунке 3E), и что снижение амплитуды ответа на стимул без вознаграждения (по сравнению с с контролем) положительно коррелирует у (нескольких) мышей, у которых у нас есть данные с использованием обоих методов (подраздел «Нейроны, настроенные на ориентацию, более редко и сильно реагируют на поощряемые условные стимулы»).

В заключение мы признаем, что данные, полученные с помощью внутренней визуализации и визуализации кальция, не являются точным зеркальным отображением друг друга, но также утверждаем, что результаты сопоставимы в разумной степени, особенно с учетом совершенно разной природы двух методов. Мы полагаем, что данные, полученные с использованием каждого метода, свидетельствуют о том, что (1) пространственная избирательность паттернов активности корковых нейронов улучшается по сравнению с контрольными стимулами и (2) что изменения, следующие за обусловливанием, выражены только в избранной группе нейронов, определенных предпочитаемой ориентацией и пространственным положением нейронов на кортикальной ретинотопической карте (это также указано в подразделе «Нейроны, настроенные на ориентацию, более скудно и сильно реагируют на вознаграждаемые условные стимулы»).

2) Анализ доли настроенных нейронов может быть ошибочным (рис. 4). В частности, на левой панели рисунка 4А показано, что доля ориентировочных нейронов была выше в области коры для вознагражденного местоположения, а результаты на правой панели рисунка 4В нормализованы, предположительно, в соответствии с общей долей для каждой области коры. (поскольку их средние значения выглядят сопоставимыми для обоих регионов). Это означает, что основное изменение может касаться непроверенных ориентаций в невознаграждаемой области.Опять же, это противоречит здравому смыслу и несовместимо с выводом автора о том, что репрезентация поощряемого стимула стала более редкой.

Рисунок 4A, левая панель, действительно показывает, что доля нейронов, которые реагировали на область вознаграждения (17,8%), была немного (но незначимо, критерий знакового ранга Уилкоксона с согласованными парами, p = 0,69) больше, чем доля нейронов. нейроны, которые реагировали на невознаграждаемую область (14,5%). Тем не менее, нормализация доли реагирующих нейронов на ориентацию и поощряемую/невознаграждаемую область (для исходной фигуры 4А) была выполнена с использованием суммы всех реагирующих нейронов как в поощряемой, так и в невознаграждаемой областях, а также всех предпочтительных ориентаций на мышь. .Нормализация была выполнена таким образом, что если бы предпочтительные ориентации мыши имели плоское распределение, каждый бин имел бы значение 1,0 (независимо от абсолютной доли реагирующих клеток на мышь и независимо от ширины бина). Мы понимаем, что легенда рисунка довольно кратко описывает процедуру нормализации и ошибочно предполагает, что мы нормализовали данные по среднему значению отдельных ячеек ориентации. Конкретная причина для выполнения нормализации для каждой мыши заключалась в том, чтобы гарантировать, что анализ доли настроенных нейронов по ориентации/региону не был смещен из-за изменения абсолютного числа реагирующих нейронов у отдельных мышей и различий в записывающих областях у мышей.Поэтому мы хотели бы подчеркнуть, что фактический анализ не был ошибочным (только описание в подписи к рисунку, возможно, было неясным). Мы добавили заявление об общей разнице в количестве реагирующих нейронов в подраздел «Улучшенное кодирование популяции нейронов для определения местоположения условного стимула», расширили рисунок 4, чтобы лучше отразить абсолютные и относительные доли настроенных нейронов, добавили пояснение к легенде к рисунку 4. , и добавил заявление, объясняющее, как была выполнена нормализация в подразделе «Улучшенное кодирование популяции нейронов для определения местоположения условного стимула».

Как указывает рецензент, по-прежнему возможно, что кондиционирование повлияло на представление нейронов нетренированной ориентации. Самый простой способ ответить на этот вопрос – сравнить моменты времени до и после кондиционирования, но данные визуализации кальция не имеют такого контроля, поскольку они были получены в остром эксперименте. Эксперимент с внутренней визуализацией был повторен через временные точки, но амплитуда ответа внутреннего сигнала едва ли сравнима с долей реагирующих нейронов, полученной с использованием визуализации кальция.Однако некоторые эффекты кондиционирования были очень избирательными для клеток, точно настроенных на условную ориентацию (например, повышенная амплитуда ответа на предъявление поощряемого стимула на рисунке 4E и улучшенная производительность декодирования на рисунке 5A). Это свидетельствует о том, что (по крайней мере) в этих случаях репрезентация условного стимула с вознаграждением отличалась от наклонной и ортогональной контрольной ориентации, увеличивая вероятность того, что изменения выражались в репрезентации стимула с вознаграждением выборочно, а не в общей популяции нейронов, исключая вознаграждаемые. представление.Мы рассмотрели это потенциальное предостережение в параграфе в разделе «Обсуждение».

3) Анализ, представленный в рукописи, не показывает убедительно, что представление об условном раздражителе становилось одновременно и более разреженным, и более сильным. Чтобы показать это, было бы лучше изучить все распределение силы настройки по всей совокупности, а не вычислять разреженность и силу, используя произвольный критерий.

По просьбе рецензента мы количественно оценили разреженность откликов кривой настройки популяции для всех клеток, используя меру, описанную в Rolls and Treves (2011).Хотя общий ответ кривой настройки популяции был немного более разреженным для ориентаций, которые были более похожи на тренированную ориентацию, представленную в области вознаграждения, это различие не было значительным. Мы добавили этот результат в рукопись в подраздел «Влияние кондиционирования на корреляции сигнала и шума» и в качестве новой панели на рисунке 4G.

Чтобы лучше описать эти данные, мы адаптировали рукопись, убрав вывод о том, что ответ населения был «редким, но более сильным».Вместо этого в рукописи теперь сообщается, что было меньше нейронов, значительно реагирующих на вознаграждаемую ориентацию в вознаграждаемом месте (что наиболее заметно видно из рисунка 3D, но также и из рисунка 4D), и что нейроны, которые все еще значительно реагировали, делали это с помощью большая амплитуда (как показано на рисунке 4E). Это было обновлено в разделе «Результаты» и разделе «Обсуждение».

https://doi.org/10.7554/eLife.37683.020

Страница не найдена — workaccounts.COM

ప్రభుత్వ ఉద్యోగి కుటుంబం తెలుసుకోవాల్సిన కీలక విషయాలు …… ✍ అంత్యక్రియలకు సాయం ఉద్యోగి మరణిస్తే అంత్యక్రియల ఖర్చుకుగాను తక్షణం రూ .20 వేలు అందిస్తారు. G.O.Ms.No.122, GA (SW) Department, Dt: 11.04.2016 ✍ మరణించిన ఉద్యోగి :: మృతదేహాన్ని తరలించడానికి సంబంధించి రవాణా చార్జీలు సైతం ప్రభుత్వ చెల్లిస్తుంది. ఎక్కడైతే మరణిస్తారో అక్కడి నుంచి తరలించే ప్రాంతాన్ని బట్టి ఈ చార్జీలు చెల్లిస్తారు. దీనికి సంబంధించి 1987 జూన్‌ 23న జీవో 153 జారీచేశారు.✍ ఎన్‌క్యాష్‌మెంట్‌ :: మృతిచెందిన ఉద్యోగి ఎర్న్డ్ లీవ్లకు సంబంధించిన ఎన్క్యాష్మెంట్ను కుటుంబసభ్యులకు చెల్లిస్తారు చెల్లిస్తారు. ఈ ఎన్క్యాష్మెంట్ను 240 రోజుల నుంచి 300 రోజులకు పెంపుదల చేశారు. దీనికి సంబంధించి 2005 సెప్టెంబర్ 16 న జీవో 232 జారీచేశారు. ✍ యాక్సిడెంటల్‌ ఎక్స్‌గ్రేషియా :: విధి నిర్వహణలో నిర్వహణలో ఉద్యోగులు ప్రమాదాల్లో మృత్యువాత పడితే ప్రభుత్వం ప్రభుత్వం ఎక్స్గ్రేషియాను ఎక్స్గ్రేషియాను చెల్లిస్తుంది. దీనికి సంబంధించి 2006 జూలై 7 317 జీవో జారీచేశారు. ✍ రవాణా చార్జీలు :: ఉద్యోగి విధి నిర్వహణలో కానీ.. ఇతర ప్రదేశంలో కానీ చనిపోతే ఆ ప్రభుత్వమే మృతదేహాన్ని ఇంటికి తరలించటానికి చార్జీలను రాష్ట్ర ప్రభుత్వమేప్రభుత్వమే. సంఘటనా స్థలం నుంచి ఇంటికి తీసుకువెళ్లడానికి నిర్ధేశించిన మొత్తాన్ని చెల్లిస్తుంది. ఈఅంశంలో మరిన్ని వివరాలు కావాలంటే 1985 సెప్టెంబర్ 15 న జారీ చేసిన చేసిన 1669 చూడవచ్చు. ✍ సస్పెన్షన్‌లో ఉంటే.. :: ప్రభుత్వ ఉద్యోగి సస్పెన్షన్లో ఉండగా మరణిస్తే చనిపోయిన కాలం కాలం మానవతాభావంతో ఆ డ్యూటీలో ఉన్నట్టుగానే కాలం పరిగణిస్తారుఉన్నట్టుగానే. సస్పెన్షన్లో ఉన్నప్పటికీ పూర్తిస్థాయిలో పరిహారంతో పాటు ఇతరత్రా రాయితీలను కుటుంబ సభ్యులకు చెల్లిస్తారు.ఈ కాలంలో అలవెన్స్లు వంటివి వర్తించినా వాటిని కూడా కుటుంబసభ్యులకు చెల్లిస్తారు. ✍ కారుణ్య నియామకం – కరువుభత్యం :: ఉద్యోగి మరణిస్తే ఆ కుటుంబంలో ఒకరికి కారుణ్య నియామకం కింద ఉద్యోగమిస్తారు ఉద్యోగమిస్తారు. అయితే వారి అర్హతల ప్రాతిపదికన వివిధ స్థాయిల్లో తీసుకునే అవకాశం ఉంది. మరణించిన ఉద్యోగికి సంబంధించి డీయర్నెస్ అలవెన్స్ (డీఏ) ను కుటుంబ పెన్సన్ కింద చెల్లించరు. కానీ కారుణ్య నియామకం పొందిన వారికి ఈ మొత్తాన్ని రెగ్యులర్గా చెల్లిస్తారు. దీని వివరాలను 1998 మే 25 న జారీ చేసి జీవో 89 లో తెలుసుకోవచ్చు.✍ సంఘ విద్రోహ శక్తుల చేతిలో మరణిస్తే… :: విధుల్లో ఉండగా అనుకోని సంఘటనల వల్ల మరణించినా. తీవ్రవాదులు, సంఘ వ్యతిరేక శక్తుల చేతుల్లో దుర్మరణం పాలైతే తక్షణం ఆ ఉద్యోగి కుటంబసభ్యులకు రూ రూ లక్షల ఎక్స్గ్రేషియా ఎక్స్గ్రేషియాఎక్స్గ్రేషియా. ✍ ఫ్యామిలీ పింఛన్‌ :: ఉద్యోగి మృతి చెందితే కుటుంబసభ్యులకు కుటుంబ పింఛన్ను వర్తింపజేస్తారు. ఈ పింఛన్‌ ఉద్యోగిస్థాయి, తరగతిని బట్టి ఉంటుందది. డీసీఆర్జీ పింఛన్రూల్స్కు అనుగుణంగా కుటుంబ పింఛన్ వర్తిస్తుంది. ✍ చెల్లింపులు, అడ్వాన్సులు రద్దు :: ఒక ఉద్యోగి ఉద్యోగి సంస్థ అప్పులు కానీ, అడ్వాన్సులు కానీ తీసుకుని మృతిచెంది ఉంటే ఆమొత్తాన్ని రద్దు రద్దు చేస్తారు.ఉద్యోగి మరణించిన సమయానికి జీపీఎఫ్తో సమానమైన రూ రూ .10 వేలను కుటుంబ సభ్యులకు చెల్లిస్తారు. ✍ రిఫండ్‌ :: ఉద్యోగి సర్వీసులో ఉన్నప్పుడు ఫ్యామిలీ బెనిఫిట్ కింద సభ్యులకు మొత్తాన్ని ఆ ఉద్యోగి మరణించిన కుటుంబ కుటుంబ సభ్యులకు సభ్యులకు సభ్యులకు సభ్యులకుసభ్యులకు. 1974 నవంబర్ 9 న జారీ చేసిన జీవో 307 తో పాటు 1983 ఏప్రిల్ 27 నజారీ చేసిన చేసిన 55 ద్వారా వివరాలను తెలుసుకోవచ్చు.

Сборка модульных метаболитов у C. elegans зависит от карбоксиэстераз и образования связанных с лизосомами органелл

Abstract

Сигнальные молекулы, полученные в результате прикрепления различных метаболических строительных блоков к аскарозидам, играют центральную роль в жизненном цикле C.elegans и другие нематоды; однако многие аспекты их биогенеза остаются неясными. Используя сравнительную метаболомику, мы показываем, что путь, опосредующий образование органелл, связанных с лизосомами кишечника (LRO), необходим для биосинтеза большинства модульных аскарозидов, а также ранее неописанных модульных глюкозидов. Подобно модульным аскарозидам, модульные глюкозиды образуются в результате высокоселективной сборки фрагментов нуклеозидов, аминокислот, нейромедиаторов и липидного метаболизма, что позволяет предположить, что модульные глюкозиды, подобно аскарозидам, могут выполнять сигнальные функции.Далее мы показываем, что карбоксиэстеразы, локализующиеся в кишечных органеллах, необходимы для сборки как модульных аскарозидов, так и глюкозидов через сложноэфирные и амидные связи. Дальнейшее исследование функции LRO и гомологов карбоксиэстеразы у C. elegans и др. животных может выявить дополнительные новые семейства соединений и сигнальные парадигмы.

Введение

Недавние исследования показывают, что метаболомы животных, от модельных систем, таких как Caenorhabditis elegans и Drosophila до человека, могут включать >100 000 соединений 1, 2 .Структуры и функции большинства этих малых молекул не были идентифицированы, что представляет собой в значительной степени неиспользованный резервуар химического разнообразия и биологической активности. В C. elegans 3 большая модульная библиотека низкомолекулярных сигналов, аскарозиды, участвуют почти во всех аспектах его жизненного цикла, включая старение, развитие и поведение 4–7 . Аскарозиды представляют собой структурно разнообразный химический язык, полученный из гликозидов дидезоксисахара аскарилозы и гидроксилированных короткоцепочечных жирных кислот (рис.1а) 8 . Структурная и функциональная специфичность возникает из-за возможного присоединения к сахару дополнительных фрагментов, например, индол-3-карбоновой кислоты (например, icas#3 ( 1 )), или карбоксиконцевых присоединений к цепи жирной кислоты, таких как p – аминобензойная кислота (ПАБК, ascr#8 ( 2 )) или O -глюкозилуровая кислота (например, uglas#11 ( 3 ), рис. 1b) 2, 9–13 . Учитывая, что даже небольшие изменения в химических структурах аскарозидов часто приводят к резкому изменению биологической функции, биосинтез аскарозидов, по-видимому, соответствует тщательно регулируемому процессу кодирования, в котором биологическое состояние транслируется в химические структуры 14 .Таким образом, биосинтез аскарозидов и других сигнальных молекул C. elegans (например, nacq#1) 15 представляет собой интересную модельную систему для эндогенной регуляции межорганизменной низкомолекулярной передачи сигналов у многоклеточных животных. Однако для большинства из >200 недавно идентифицированных метаболитов C. elegans 2, 8, 9 сведения о биосинтезе скудны. Предыдущие исследования показали, что консервативные метаболические пути, т.е. пероксисомальное β -окисление 9, 10 и катаболизм аминокислот 8, 16 (рис.1а), способствуют биосинтезу аскарозидов; однако многие аспекты механизмов, лежащих в основе сборки многомодульных метаболитов, остаются неясными.

Рисунок 1:

(а) Модульные аскарозиды собраны из простых аскарозидов, т.е. ascr#1 ( 5 ) или ascr#3 ( 9 ), а также строительные блоки других метаболических путей, например. глюкозилуровая кислота ( 6 ), p – аминобензойная кислота (ПАБК, 8 ), индол-3-карбоновая кислота ( 11 ) или сукцинилоктопамин ( 12 ).Мы предполагаем, что glo-1 -зависимые кишечные гранулы играют центральную роль в их биосинтезе. (b) Примеры модульных аскарозидов и их биологического контекста. (c) UAR-1 в P. pacificus превращает простые аскарозиды в аскарозиды, содержащие 4′-уреидоизомасляную кислоту, т.е. убас №3 ( 4 ). ( d ) Стратегия сравнительного метаболического анализа LRO-дефицитных мутантов glo-1 . (e) Пример модульных аскарозидов, продукция которых повышена у мутантов glo-1 .

Недавний метаболомный анализ мутантов Rab-GTPase glo-1 , у которых отсутствует определенный тип связанных с лизосомами органелл (LROs, также называемых аутофлуоресцентными кишечными гранулами), выявил полную потерю 4′-модифицированных аскарозидов. 14 . glo-1 -зависимые LRO представляют собой кислые, пигментированные компартменты, которые родственны меланосомам млекопитающих и органеллам пигмента глаз дрозофилы 17, 18 . LRO образуются, когда лизосомы сливаются с другими клеточными компартментами, например.грамм. пероксисомы и, по-видимому, играют важную роль в переработке белков и метаболитов 17 . Кроме того, было высказано предположение, что LROs могут быть вовлечены в продукцию и секрецию различных сигнальных молекул 19, 20 , а наблюдение, что мутантные черви glo-1 дефицитны по 4′-модифицированным аскарозидам, позволяет предположить, что кишечные органеллы могут служат ступицами для их сборки (рис. 1а) 14 . В дополнение к аутофлуоресцентным LRO, несколько других типов кишечных гранул были охарактеризованы в C.elegans , включая липидные капли 21 и родственные лизосомам органеллы, которые не являются glo-1 -зависимыми 22 .

Параллельные исследования других видов CaenorhaBDitis 23-25 ​​ и 23-25 ​​ и PACIONCHUS PACIFICUS 26 , нематодные виды, разрабатываемые в виде системы спутниковой модели до C. Elegans 27 , показали, что производство модульных аскарозидов широко распространен среди нематод. Используя высокое геномное разнообразие секвенированных P.pacificus , полногеномные ассоциативные исследования в сочетании с метаболомным анализом показали, что uar-1 , карбоксиэстераза из надсемейства α/β-гидролаз, гомологичная холинэстеразам (AChEs), необходима для 4′-присоединения уреидоизобутирилового фрагмента. к подмножеству аскарозидов, например убас №3 ( 4 , рис. 1с) 26 . Поиски гомологии выявили большое распространение гомологов карбоксиэстеразы ( cest ) у P. pacificus , а также у C.elegans (рис. S1), а недавно было показано, что у C. elegans гомологи uar-1 cest-3 , cest-8 и cest-9.2 участвуют в 4′-присоединение других ацильных групп в модульных аскарозидах 28 . Основываясь на этих выводах, мы установили, что гомологи cest локализуются в glo-1 -зависимых кишечных гранулах, где они контролируют сборку модульных аскарозидов и, возможно, других модульных метаболитов.В этой работе мы представляем всестороннюю оценку влияния делеции glo-1 на метаболом C. elegans и раскрываем центральную роль гомологов cest , локализующихся в кишечных гранулах, в биосинтезе различных модульных метаболитов. .

Результаты

Новые классы LRO-зависимых метаболитов

Чтобы получить всесторонний обзор роли glo-1 в метаболизме C. elegans , мы использовали полностью нецелевое сравнение метаболомов glo-1. 1 нуль-мутантных червей и червей дикого типа (рис.1г). Данные ВЭЖХ-масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР) для метаболомов экзо- (выделенные соединения) и метаболомов эндо- (соединения, экстрагируемые из тел червей) двух штаммов были проанализированы с использованием сравнительной метаболомической платформы Metaboseek, который объединяет пакет xcms 29 . Эти сравнительные анализы показали, что мутация glo-1 оказывает существенное влияние на метаболизм C. elegans . Например, в режиме отрицательной ионизации мы обнаружили >1000 молекулярных признаков, которые были как минимум в 10 раз реже в метаболомах glo-1 exo- и endo -, а также >3000 молекулярных признаков, которые в 10 раз меньше. активируется у мутантов glo-1 .Для дальнейшей характеристики дифференциальных признаков мы использовали тандемную масс-спектрометрию (MS 2 ), основанную на объединении молекулярных сетей, метод, который группирует метаболиты на основе общих моделей фрагментации (рис. 1d, S2-5) 30 . Полученные в результате четыре сети MS 2 — для данных, полученных в режиме положительной и отрицательной ионизации для метаболомов экзо- и эндо- — выявили несколько больших кластеров признаков, обилие которых было в значительной степени упразднено или значительно увеличено в glo-1. черви.Примечательно, что хотя некоторые дифференциальные кластеры MS 2 представляли собой известные соединения, напр. ascarosides, было обнаружено, что большинство кластеров представляют собой ранее неописанные семейства метаболитов.

В соответствии с предыдущими исследованиями 14 , биосинтез большинства модульных аскарозидов был отменен или существенно снижен у мутантов glo-1 , включая все 4′-модифицированные аскарозиды, т.е. icas#3 ( 1 ) (рис. 1b и S6a). Точно так же продукция аскарозидов, модифицированных по карбокси-концу, т.е.грамм. uglas#11 ( 3 ), полученный в результате образования сложного эфира между ascr#1 ( 5 ) и глюкозидом мочевой кислоты 12 ( 6 ), и ascr#8 ( 2 ), полученный в результате образования амида связь между ascr#7 ( 7 ) и p -аминобензойной кислотой ( 8 ) была в значительной степени уничтожена у мутантов glo-1 (рис. 1а, 1б и S6а). Метаболиты, вероятно представляющие строительные блоки этих модульных аскарозидов, не были сильно нарушены у мутантов glo-1 (рис.С7). Например, обилие немодифицированных аскарозидов, т.е. ascr#3 ( 9 ) и ascr#10 ( 10 ), или метаболиты, представляющие 4′-модификации, например индол-3-карбоновая кислота ( 11 ) и сукцинат октопамина ( 12 ) существенно не нарушались у мутанта (рис. 1а, S6a и S7). Напротив, подмножество модульных эфиров глюкозы аскарозидов (например, iglas#1 ( 13 ) и glas#10 ( 14 ), рис. 1e) было сильно увеличено у мутантов glo-1 (рис.С6б). Эти результаты свидетельствуют о том, что glo-1 -зависимые кишечные органеллы функционируют как центральные узлы биосинтеза большинства модульных аскарозидов, за исключением подгруппы аскарозилированных глюкозидов, повышенная продукция которых у мутантов glo-1 может свидетельствовать о шунтирующий путь для производных аскарозил-КоА 31–33 , которые представляют собой вероятных предшественников модульных аскарозидов, модифицированных на карбокси-конце.

Затем мы проанализировали наиболее заметные кластеры MS 2 , представляющие ранее не охарактеризованные метаболиты, продукция которых отменена или сильно снижена у мутантов glo-1 (рис.2). Детальный анализ их спектров MS 2 показал, что они могут представлять собой большое семейство модульных производных гексозы, включающих фрагменты различных первичных метаболических путей. Например, спектры MS 2 кластеров I , II и III сети положительной ионизации позволяют предположить фосфорилированные гексозогликозиды индола, антраниловой кислоты, тирамина или октопамина, которые дополнительно декорированы широким различные жирные ацильные фрагменты, полученные в результате метаболизма жирных кислот или аминокислот, например, никотиновая кислота, пирроловая кислота или тигловая кислота (рис.2, таблица 1) 17, 34 . Учитывая предыдущую идентификацию глюкозидов iglu#1/2 ( 15/16 , рис. 2e) и angl#1/2 ( 17/18 ), мы предположили, что кластеры I , II и III представляют собой модульную библиотеку глюкозидов, в которой N -глюкозилированный индол, антраниловая кислота, тирамин или октопамин 35 служат каркасами для прикрепления различных строительных блоков. Чтобы дополнительно подтвердить эти структурные назначения, для полного синтеза был выбран ряд модульных метаболитов на основе N -глюкозилированного индола («iglu»).Синтетические стандарты для нефосфорилированных исходных соединений iglu#4 ( 19 ), iglu#6 ( 20 ), iglu#8 ( 21 ) и iglu#10 ( 22 ) соответствовали временам удерживания при ВЭЖХ. и MS 2 спектры соответствующих природных соединений (рис. S8), подтверждающие их структуру и позволяющие предварительно определить структуру большого количества дополнительных модульных глюкозидов, включая их фосфорилированные производные, например iglu#12 ( 23 ), iglu#41 ( 24 ), angl#4 (кластер II , 25 ) и tyglu#4 (кластер III , 26 ) (рис.2). Предложенные структуры включают несколько глюкозидов нейротрансмиттеров тирамина и октопамина, включение которых может быть подтверждено сравнением с данными недавно описанного эксперимента с кормлением меченым стабильным изотопом тирозином 35 . Подобно биосинтезу аскарозидов, производство модульных глюкозидов зависит от стадии жизни; например, продукция специфических тираминовых глюкозидов достигает пика на стадии личинки L3, тогда как продукция angl#4 увеличивается до взрослой стадии (рис.С9 и С10). Примечательно, что модульные глюкозиды были обнаружены в первую очередь как их фосфорилированные производные, поскольку соответствующие нефосфорилированные виды, как правило, были менее распространены. В отличие от большинства аскарозидов, фосфорилированные глюкозиды более распространены в метаболоме эндо , чем в метаболоме экзо , что позволяет предположить, что фосфорилированные глюкозиды могут специфически удерживаться в организме (рис. S9).

Рисунок 2:

(a) Частичная сеть MS 2 (режим положительных ионов) для C.elegans endo -метаболом, выделяющий три кластера модульных глюкозидов, которые подавляются у мутантов glo-1 (см. также рис. S1-4). Красный цвет представляет признаки пониженной экспрессии, а синий цвет повышенной экспрессии по сравнению с C. elegans дикого типа . (b) Кластер I включает несколько модульных производных индолглюкозида. Структуры были предложены на основании паттернов фрагментации MS 2 , см. также табл. 1. Соединения, нефосфорилированные аналоги которых были синтезированы, отмечены (*).Показанные ионные хроматограммы демонстрируют потерю iglu#4 у мутантов glo-1 . (c, d) Примеры модульных глюкозидов, обнаруженных в составе кластеров II и III . Ионные хроматограммы показывают прекращение продукции angl#4 ( 25 ) (c) и tyglu#4 ( 26 ) (d) у мутантов glo-1 . (e) Модульные глюкозиды получают путем комбинаторной сборки широкого спектра строительных блоков. Включение фрагментов было подтверждено путем полного синтеза примеров соединений (зеленый) или мечения стабильными изотопами (синий).Для всех соединений было предложено 3-фосфорилирование на основании установленных структур iglu#2 ( 16 ), angl#2 ( 18 ) и uglas#11 ( 3 ).

Как и в случае модульных аскарозидов, обилие предполагаемых строительных блоков недавно идентифицированных модульных глюкозидов не сильно нарушалось у мутантов glo-1 . Например, содержание антраниловой кислоты, индола, октопамина и тирамина существенно не изменилось у glo-1 нулевых животных (рис.С11). Примечательно, что обилие каркаса глюкозидов, т.е. iglu # 1 и angl # 1 также в значительной степени не изменились или даже немного увеличились у мутантов glo-1 (рис. S11). Кроме того, продукция некоторых из идентифицированных модульных глюкозидов, напр. iglu # 5 снижается, но не полностью устраняется у червей glo-1 (рис. S8).

Чтобы подтвердить наши результаты, мы дополнительно сравнили метаболом glo-1 с метаболомом glo-4 мутантов. glo-4 кодирует предсказанный фактор обмена гуанилнуклеотидов, действующий выше glo-1 , и подобно мутантам glo-1 черви glo-4 не образуют LRO 18 .Мы обнаружили, что метаболом glo-4 очень похож на метаболом червей glo-1 , в нем отсутствует большинство модульных аскарозидов и аскарозидов, обнаруженных у червей дикого типа (рис. S6c). Соответственно, аналогичные наборы соединений активируются у glo-1 и glo-4 мутантов по сравнению с диким типом, включая аскарозилглюкозиды и аскарозидфосфаты. Соединения, накапливающиеся в мутантных червях glo-1 и glo-4 , дополнительно включают разнообразный набор небольших пептидов (в основном от трех до шести аминокислот), что согласуется с предполагаемой ролью LRO в расщеплении пептидов, полученных в результате протеолиза (рис. .S12) 36 . В совокупности наши результаты показывают, что, помимо своей роли в деградации метаболических отходов, LRO служат очагами биосинтетической активности, где строительные блоки различных метаболических путей прикрепляются к глюкозидным и аскарозидным каркасам (рис. 1а).

Карбоксилэстеразы необходимы для модульной сборки

Сравнивая относительное содержание различных членов идентифицированных семейств модульных глюкозидов и аскарозидов, оказывается, что комбинации различных строительных блоков и каркасов являются высокоспецифичными, что предполагает наличие выделенных путей биосинтеза.Например, глюкозид мочевой кислоты, gluric # 1 ( 6 ), предпочтительно сочетается с аскарозидом, имеющим боковую цепь из 7 атомов углерода (с образованием uglas # 11, 3 ), тогда как аскарозиды, несущие боковую цепь из 9 атомов углерода. предпочтительно присоединены к аномерному положению свободной глюкозы, как в glas#10 ( 14 ) 2,8 . Точно так же тигликовая кислота предпочтительно связана с глюкозидами индола и тирамина, но не с глюкозидами антраниловой кислоты (таблица 1). Учитывая, что 4′-модификация аскарозидов в P.pacificus и C. elegans требуется гомологов cest , мы предположили, что биосинтез других модульных аскарозидов, а также недавно идентифицированных глюкозидов может находиться под контролем ферментов семейства cest 26, 28 . Из списка 44 гомологов uar-1 по результатам анализа BLAST (табл. 2) мы выбрали семь для дальнейшего изучения (рис. 3а, S2). Предполагается, что выбранные гомологи имеют экспрессию в кишечнике, один из основных участков биосинтеза малых молекул при C.elegans 2 и тесно связаны с геном UAR-1, представляя при этом разные подветви филогенетического древа. Используя недавно оптимизированный метод CRISPR/Cas9, мы получили два нулевых мутантных штамма для пяти выбранных генов 37 . Ранее были получены мутанты для оставшихся двух гомологов, ges-1 и cest-6 (табл. 3). Затем мы проанализировали экзо-– и эндо-метаболомов этого набора мутантных штаммов с помощью ВЭЖХ-МСВР для выявления признаков, которые отсутствуют или сильно подавлены у нулевых мутантов конкретного гена-кандидата по сравнению с червями дикого типа и всеми другими мутантами в эта учеба.Мы обнаружили, что два из семи протестированных гомологов ( cest-1.1 , cest-2.2 ) дефектны в продукции двух разных семейств модульных аскарозидов, тогда как мутанты cest-4 дефектны в биосинтезе специфического подмножество модульных индольных глюкозидов (рис. 3). Метаболомы мутантов остальных четырех гомологов cest не обнаруживали существенных различий по сравнению с диким типом в тестируемых условиях.

Рисунок 3:

(а) Филогенетическое дерево, относящееся к P.pacificus uar-1 к гомологичным предсказанным генам в C. elegans . Ppa-uar-1 , cest-3 , cest-8 , cest-9.2 (зеленый) промежуточное образование эфира в 4′-положении аскарозидов у P. pacificus и C. elegans . Гены, показанные красным цветом, были выбраны для текущего исследования. (b,c) Продукция ascr#8 ( 2 ), ascr#81 ( 27 ) и ascr#82 ( 28 ) отменена у мутантов cest-2.2 Изогенные ревертантные штаммы cest -2.2 нулевых мутанта, у которых кассета STOP-IN была точно вырезана, демонстрируют сходное с диким типом восстановление ассоциированного метаболита. (d, e) Продукция uglas#1 и uglas#11 отменена у мутантов cest-1.1 (null) и восстановлена ​​у генетических ревертантов. (f) Биосинтез позиционных изомеров uglas#14 ( 31 ) и uglas#15 ( 32 ) не изменяется или увеличивается у мутантов cest-1.1 (f). (g) Производство uglas#1 и uglas#11, но не gluric#1, отменено в cest-1.1 (S213) мутантов. (h,i) Продукция модифицированного антраниловой кислотой глюкозида iglu#4 в значительной степени устранена у мутантов cest-4 и полностью восстановлена ​​у генетических ревертантов. (j) Продукция iglu#6 ( 36 ) и iglu#8 ( 37 ), структуры которых тесно связаны со структурой iglu#4, не отменена у мутантов cest-4 . Ионные хроматограммы на панелях b, d и g дополнительно демонстрируют отмену у мутантов glo-1 . н.д., не обнаружено. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения, а p-значения изображены на рисунке.

Таблица 1.

MS 2 данные зависимых от glo-1 признаков, представленных в этой рукописи. Прикрепил отдельным файлом.

Таблица 2. Результаты

BLASTp из механизма WormBase BLAST при поиске по аминокислотной последовательности целей UAR-1 и CRISPR/Cas9 для этого исследования (красный).

Таблица 3.

Список штаммов C. elegans , использованных в этом исследовании.

Таблица 4.

ДНК-олигонуклеотидов, использованных в этом исследовании.

Анализ метаболомов двух цест-2.У 2 нулевых мутантов обнаружена потеря компонента феромона дауэра и мужского аттрактанта ascr#8 ( 2 ), а также близкородственных ascr#81 ( 27 ) и ascr#82 ( 28 ) (рис. 3b, С13а). С точки зрения биосинтеза, семейство аскарозидов ascr#8 образуется в результате образования амида между ascr#7 (ΔC7, 7 ) и производным фолиевой кислоты p -аминобензойной кислоты (PABA, 8 ), PABA-глутаматом ( 29 ) или ПАБК-диглутамат соответственно. Мы не обнаружили какого-либо значительного снижения продукции вероятных предшественников ascr#8, включая PABA и PABA-глутамат, или ascr#7 (рис.3с, С14б). Биосинтез ascr#8, ascr#81 и ascr#82 был восстановлен у cest-2.2 мутантных червей, у которых последовательность cest-2.2 была восстановлена ​​до дикого типа с помощью CRISPR/Cas9 (рис. 3c, S15b) . Эти результаты показывают, что CEST-2.2 необходим специально для биосинтеза амидной связи между карбоксиконцом ascr#7 и производных ПАБК, в отличие от подразумеваемых функций UAR-1, CEST-8, CEST-3 и CEST- 9.2, которые участвуют в образовании сложноэфирных связей между различными головными группами и 4′-гидроксильной группой аскарилозы 26, 28 .

У нулевых мутантов cest-1.1 ( cest-1.1 (null)) биосинтез нуклеозидоподобного аскарозида uglas#1 ( 30 ) и его фосфорилированного производного uglas#11 ( 3 ) был отменен. (рис. 3d, S13c). uglas#1 и uglas#11 образуются в результате присоединения ascr#1, несущего боковую цепь из семи атомов углерода (C7), к глюконуклеозиду мочевой кислоты gluric#1 ( 6 ). Производство ascr#1 ( 5 ) и gluric#1 ( 6 ), представляющих собой возможные строительные блоки uglas#1 ( 30 ), не сократилось (рис.С14а). Кроме того, производство uglas#14 ( 31 ) и uglas#15 ( 32 ), изомеров uglas#1 и uglas#11, содержащих аскарозильную часть в 6′-положении вместо 2′-положения, не было отменено. но несколько увеличился в cest-1.1 (null) (рис. 3d-e). Эти результаты показывают, что CEST-1.1 необходим для образования сложноэфирной связи конкретно между ascr#1 ( 5 ) и 2′-гидроксильной группой в gluric#1. Как и в случае cest-2.2 , биосинтез uglas#1 и uglas#11 полностью восстановился у cest-1.1 мутантных червей, в которых последовательность cest-1.1 была восстановлена ​​до дикого типа с помощью CRISPR/Cas9 (рис. 3f, S15a).

Выравнивание последовательности с AChE человека показало, что серин 213 является частью консервативной каталитической триады серин-гистидин-глутамат CEST-1.1 (рис. S16). Чтобы проверить, повлияет ли нарушение каталитической триады на продукцию цест-1.1--зависимых метаболитов, мы создали точечный мутант цест-1.1 (S213A). Как и в сест-1.1 (ноль), производство uglas#1 ( 30 ) и uglas#11 ( 3 ) было полностью отменено в cest-1.1 (S213A), тогда как производство gluric#1 не пострадало (рис. 3г).

Предыдущая работа включала cest-1.1 с фенотипами долголетия, связанными с argonaute-подобным геном 2 ( alg-2 ) 38 . Мутантные черви alg-2 являются долгоживущими по сравнению с диким типом, и было также показано, что для их продолжительной жизни требуется daf-16 , единственный ортолог транскрипционных факторов семейства FOXO в C.elegans , а также cest-1.1 . Более того, биосинтез uglas#11 значительно увеличивается у мутантов гомолога рецептора инсулина daf-2 , центрального регулятора продолжительности жизни у C. elegans выше по течению от daf-16 12 . Эти данные указывают на возможность того, что продукция uglas ascarosides лежит в основе цесто-1.1 -зависимого увеличения продолжительности жизни взрослых особей C. elegans .

В отличие от наших результатов для cest-1.1 и cest-2.2 мутантов, сравнительный метаболомный анализ мутантных штаммов cest-4 не выявил дефектов биосинтеза известных аскарозидов. Вместо этого мы обнаружили, что уровни определенного подмножества модульной антраниловой кислоты ( 33 ), содержащей индольные глюкозиды, включая иглу#3 ( 34 ) и его фосфорилированное производное иглу#4 ( 35 ), были устранены в мутантные черви cest-4 (рис. 3h, S13b). Содержание предполагаемых глюкозидов-предшественников, iglu#1 ( 15 ) и iglu#2 ( 16 ), существенно не менялось в cest-4 (рис.3i, S14c). Примечательно, что производство других индольных глюкозидов, т.е. iglu # 6 ( 36 ) и iglu # 8 ( 37 ) не было значительно снижено у червей cest-4 (рис. 3i, S17). Биосинтез iglu # 3 и iglu # 4 был восстановлен до уровней дикого типа в генетических ревертантных штаммах для cest-4 (рис. 3i, S15c). Таким образом, оказывается, что цест-4 особенно необходим для присоединения антраниловой кислоты к 6′-положению предшественников глюкозилиндола, тогда как присоединение тиглиевой кислоты, никотиновой кислоты и других фрагментов цест-4 -независимо (рис. .3j, S17). Таким образом, роль cest-4 в биосинтезе модульных глюкозидов семейства iglu аналогична роли cest-1.1 в биосинтезе аскарозидов uglas: тогда как cest-4 , по-видимому, необходим для присоединения антраниловых кислоты ( 33 ) в 6′-положении ряда индольных глюкозидов, cest-1.1 , по-видимому, необходим для присоединения боковой цепи ascr # 1 к 2′-положению в глюкозидах мочевой кислоты.

ЦЭСТ-2.2 локализуется в кишечных гранулах

Все гомологи cest , отобранные для этого исследования, демонстрируют архитектуру доменов, типичную для белков суперсемейства α/β-гидролаз, включая консервативную каталитическую триаду, и, кроме того, содержат предполагаемый дисульфидный мостик, как в AChE млекопитающих 39 (рис. S16). Гены cest также обладают гомологией с neuroligin, мембраносвязанным членом семейства α/β-hydrolase fold, который обеспечивает образование и поддержание синапсов между нейронами 40 .Анализ последовательности показывает, что пять из семи исследованных здесь гомологов CEST заякорены в мембране (рис. S18), учитывая наличие предсказанного C -концевого трансмембранного домена 41 (состоящего примерно из 20 остатков) с N терминус на просветной стороне пузырька или органеллы (рис. S18). Поскольку продукция всех идентифицированных до сих пор cest -зависимых метаболитов упразднена у glo-1 мутантов, казалось вероятным, что белки CEST локализуются в кишечных гранулах.Чтобы проверить эту идею, мы создали мутантный штамм, который экспрессирует cest-2.2 C , помеченный на конце mCherry в нативном геномном локусе, чтобы избежать потенциально смешанных эффектов сверхэкспрессии. Красный флуоресцентный mCherry был выбран из-за сильной зеленой автофлуоресценции LROs 17 . Мы подтвердили, что продукция всех цесто-2,2 -зависимых метаболитов, включая ascr#8 ( 2 ), ascr#81 ( 27 ) и ascr#82 ( 28 ), не претерпевала значительных изменений в цестох. -2.2 мутантов -mCherry (рис. 4а), что указывает на то, что CEST-2.2 оставался функциональным. Визуализация взрослых червей дикого типа выявила сильную зеленую и более слабую красную автофлуоресценцию в круглых элементах в клетках кишечника, что соответствует LRO. Кроме того, черви с меткой cest-2.2 -mCherry показали красную флуоресценцию в отчетливом наборе кишечных гранул, которые практически не проявляли аутофлуоресценции (Fig. 4b, S19, S20). Неясно, локализуется ли mCherry также в сильно аутофлуоресцентных гранулах, поскольку мы не можем отличить сигнал mCherry от красного компонента аутофлуоресценции, учитывая относительно низкий уровень CEST-2.Экспрессия 2-mCherry в этом штамме без сверхэкспрессии. В совокупности оказывается, что CEST-2.2-mCherry локализуется в подмножестве кишечных органелл, которое частично отличается от аутофлуоресцентных LROs. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, локализуется ли CEST-2.2-mCherry совместно с другими маркерами кишечных гранул, в частности с GLO-1 и лизосомным маркером LMP-1.

Рисунок 4:

(a) Относительные количества cest-2.2 зависимых метаболитов в червях, экспрессирующих C – терминально меченный mCherry CEST-2.2. (b) Красная флуоресценция в кишечных гранулах у взрослых особей дикого типа и cest-2.2 -mCherry беременных. Вверху, контроль дикого типа (N2); дно, цест-2.2 -mCherry черви.

GLO-1

6 GLO-1

-Dectended Metabolites в C. Briggsae

В дополнение к C. elegans и P. Pacificus , модульные аскарозиды были зарегистрированы из нескольких других различных видов Caenorhabditis 42, 43 , включая C. briggsae 23, 44 .Чтобы оценить, сохраняется ли роль LRO в биосинтезе модульных метаболитов у разных видов, мы создали два нокаутных штамма Cbr glo-1 (CBG01912.1) с использованием CRISPR/Cas9. Как и в случае C. elegans , Cbr glo-1 , мутантные черви не имели автофлуоресцентных LRO, которые отчетливо видны у дикого типа C. briggsae (рис. S21). Сравнительный метаболомный анализ эндо – и экзо -метаболомов дикого типа C.briggsae и мутантные штаммы Cbr glo-1 показали, что у червей Cbr glo-1 отсутствует биосинтез всех известных модульных аскарозидов, включая индолкарбоксипроизводные icas#2 ( 1 70 35) и icas#6.2 ( 36 ), которые широко распространены у дикого типа C. briggsae (рис. 5а). 23 Кроме того, сети C. briggsae MS 2 включали несколько крупных Cbr glo-1 -зависимых кластеров, представляющих модульные глюкозиды, включая многие соединения, также обнаруженные в C.elegans , например. иглу#4 и англ#4. Как и в случае C. elegans , производство немодифицированных глюкозидных каркасов, т.е. iglu#1 ( 15 ) и angl#1 ( 17 ) не уменьшались и не увеличивались у мутантов Cbr glo-1 , тогда как биосинтез большинства модульных глюкозидов происходит в результате присоединения дополнительных фрагментов к этим каркасам. был упразднен (рис. 5б). Взятые вместе, эти результаты показывают, что роль LRO как центрального хаба для сборки различных архитектур малых молекул, включая модульные глюкозиды и аскарозиды, может быть широко распространена среди нематод (рис.5в).

Рисунок 5:

Относительное содержание (a) простых и модульных аскарозидов и (b) простых и модульных глюкозидов в эндо -метаболоме Cbr glo-1 мутантов по сравнению с диким типом C. briggsae . н.д., не обнаружено. (c) Модель модульной сборки метаболитов. Белки CEST (связанные с мембраной в LROs, красные) опосредуют присоединение строительных блоков из различных метаболических путей к каркасам глюкозы и пероксисомальным β -окисленным аскарозидам через сложноэфирные и амидные связи.Некоторые из полученных модульных аскарозидов могут подвергаться дополнительному пероксисомальному β -окислению после активации acs-7 25 .

Обсуждение

Наши результаты показывают, что у C. elegans Rab-GTPase glo-1, , необходимая для образования LRO кишечника, играет центральную роль в биосинтезе нескольких больших семейств соединений, полученных из модульной сборки. через гомологов cest . Формирование автофлуоресцентных LRO через glo-1 напоминает роли его человеческих ортологов RAB32 и RAB38, которые необходимы для образования меланосом и, возможно, других LRO 45, 46 .Предполагается, что лизосомы и LROs функционируют в аутофагии, фагоцитозе и гидролитической деградации белков, и было показано, что GTPases семейства Rab32 необходимы для этих процессов у различных организмов 47 . В соответствии с представлением о том, что лизосомы и LRO являются горячими точками деградации, многие из строительных блоков идентифицированных модульных аскарозидов и глюкозидов образуются катаболическими путями, например, антраниловая кислота образуется в результате катаболизма триптофана, мочевая кислота возникает в результате метаболизма пуринов, а аскарозиды с короткой цепью являются конечными продуктами пероксисомального β -окисления предшественников с очень длинной цепью.Важно отметить, что, хотя наши результаты показывают, что карбоксиэстеразы участвуют в glo-1 -зависимой сборке модульных метаболитов, необходимы дополнительные исследования, чтобы выяснить, содержат ли кишечные компартменты, которые локализуются карбоксиэстеразами, также GLO-1 и лизосомальный маркер LMP-1, как это чехол для автофлуоресцентных ЛРО 22 .

Кроме того, наши результаты демонстрируют, что парадигма модульной сборки выходит за рамки аскарозидов. Модульные глюкозиды представляют собой ранее неизвестное семейство метаболитов нематод.В отличие от хорошо известной роли модульных аскарозидов в качестве феромонов, неизвестно, выполняют ли модульные гликозиды определенные биологические функции, например, в качестве сигнальных молекул; однако их специфический биосинтез через cest-4 , а также их продукция, зависящая от стадии жизни, убедительно подтверждают эту гипотезу (Fig. S10). Подобно феромонам аскарозидов, некоторые модульные глюкозиды экскретируются в среду, что указывает на то, что они могут быть вовлечены в межорганизмы.Выявление условий развития и окружающей среды, которые влияют на продукцию модульных глюкозидов, а также более полное понимание их биосинтеза, может помочь раскрыть потенциальную сигнальную и другие биологические роли. В частности, очевидное пероксисомальное происхождение аскарозидных каркасов предполагает связь между активностью пероксисом и кишечных гранул, возможно, посредством пексофагии 48 , а определение роли аутофагии в метаболизме, зависящем от кишечных гранул, может способствовать раскрытию функций модульного глюкозида. и аскарозиды.На связь с аутофагией также указывает наш предыдущий вывод 14 о том, что производство модульных аскарозидов снижено у мутантов atg-18 49 , что необходимо для аутофагии.

Высокая степень селективности, с которой различные строительные блоки объединяются в модульные аскарозиды и глюкозиды, убедительно свидетельствует о том, что эти соединения, несмотря на их количество и разнообразие, представляют собой продукты определенных ферментативных путей, как это недавно было установлено для 4′-ацилированных аскарозидов. .Наши результаты выявили более широкий спектр биосинтетических функций, связанных с гомологами cest , включая этерификацию и образование амида на карбоксиконце аскарозидов и ацилирование глюкозидов (рис. 5с). Примечательно, что все нулевые мутанты cest , метаболомы которых были охарактеризованы до сих пор, дефектны в биосинтезе одного или нескольких соединений, имеющих специфическую структурную особенность, что еще раз подтверждает точку зрения, что эти селективно собранные молекулярные архитектуры выполняют определенные функции.

Все белки CEST, которые до сих пор ассоциировались с модульной сборкой метаболитов, содержат мембранные якоря и демонстрируют архитектуру доменов, типичную для серингидролаз семейства AChE, включая α/β-гидролазную укладку, консервативную каталитическую триаду серин-гистидин-глутамат , и мостиковые дисульфидные цистеины (рис. S16) 39 . Хотя наши попытки гетерологичной экспрессии белков CEST не увенчались успехом, обнаружение мутации каталитического серина в cest-1.1 (S213A) отменил производство всех цест-1.1 -зависимых соединений предполагает, что ферменты CEST непосредственно участвуют в биосинтезе модульных метаболитов. Следовательно, мы предполагаем, что белки CEST после трансляции из эндомембранной системы в glo-1 -зависимые кишечные органеллы участвуют в сборке различных структур на основе аскарозидов или глюкозидов посредством переноса ацила от соответствующих активированных интермедиатов, т.е. КоА или эфиры фосфорной кислоты 39, 50 .Складчатые ферменты α/β-гидролазы функционально очень разнообразны 51 и включают эстеразы, пептидазы, оксидоредуктазы и лиазы, выполняющие различные биосинтетические роли у животных, растений 52 и бактерий 53 . В то время как активность ацилтрансфераз часто наблюдается как побочная реакция эстераз и липаз, ферменты укладки α / β-гидролазы могут функционировать как специальные ацилтрансферазы, например. в микробном биосинтезе натуральных продуктов 51, 54 . Потребуются дополнительные биохимические исследования, чтобы определить точные механизмы, с помощью которых гомологи cest способствуют сборке модульных метаболитов у нематод.

Наконец, хотя наши результаты показывают, что glo-1 необходим для биосинтеза большинства модульных метаболитов, обнаруженных нами до сих пор, примечательно, что некоторые модульные аскарозиды, например, iglas#1 ( 13 ) и модульные глюкозиды, например iglu#6 ( 20 ) и iglu#8 ( 21 ), по-видимому, не зависят от glo-1 (рис. S8). Это предполагает, что различные клеточные компартменты вносят вклад в модульный биосинтез метаболитов, а также может указывать на то, что не все белки CEST доставляются в один и тот же клеточный компартмент.Сходным образом, мутанты glo-1 продолжают генерировать простые глюкозиды и аскарозиды, которые служат каркасами для дальнейшей разработки с помощью белков CEST, которые могут быть получены из UDP-гликозилтрансфераз , 55, .

Напоминая о роли АХЭ в передаче нейронных сигналов у животных, оказывается, что у C. elegans карбоксиэстеразы, гомологичные АХЭ, были кооптированы для установления дополнительных путей передачи сигнала, основанных на модульном химическом языке. , для межорганизмальной коммуникации и, возможно, также для передачи сигналов внутри организма.Биосинтетические функции большинства из 200 серингидролаз в C. elegans , включая более 30 дополнительных гомологов cest , еще предстоит оценить, и представляется вероятным, что это семейство ферментов способствует биосинтезу большого количества дополнительных ферментов. , пока не идентифицированные соединения. Точно так же точные ферментативные роли многих семейств серингидролаз млекопитающих не были исследованы с использованием нецелевой метаболомики на основе HRMS. Наши результаты могут мотивировать систематическую характеристику гомологов cest Metazoan и других серингидролаз в отношении их роли в метаболизме и передаче сигналов малых молекул, связанных ферментативных механизмах и клеточной локализации.

Методы

Общая информация

Если не указано иное, все реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich. Всем вновь идентифицированным соединениям были присвоены четырехбуквенные «SMID» (совместимый с поиском идентификатор малых молекул), например, «icas#3» или «ascr#10». База данных SMID (www.smid-db.org) представляет собой электронный ресурс, поддерживаемый в сотрудничестве с WormBase (www.wormbase.org). Полный список SMID можно найти по адресу www.smid-db.org/browse, а примеры структур для различных SMID можно найти по адресу www.smid-db.org/browse.smid-db.org/smidclasses.

BLAST-анализ

uar-1

Аминокислотная последовательность Ppa -UAR-1 использовалась как ранее опубликованная 26 . BLASTp запускался из движка WormBase по адресу (https://wormbase.org/tools/blast_blat). Порог E-значения был установлен на 1E0. База данных была установлена ​​на WS269, а виды — на C. elegans . Результаты поиска BLASTp приведены в таблице 2. Выравнивание аминокислотной последовательности

hAChE было сопоставлено с Ppa -UAR-1, CEST-1.1, CEST-2.2 и CEST-4 выполняли с использованием выравнивания T-Coffee Multiple Sequence 56 . Белковые последовательности для белков C. elegans CEST взяты из WormBase. Последовательность AChE была получена от NCBI (инвентарный номер P22303). Аминокислоты были окрашены на основе химических свойств: AVFPMILW = красный (малый + гидрофобный), DE = синий (кислотный), RHK = пурпурный (основной), STYHCNGQ = зеленый (гидроксил + сульфгидрил + амин + глицин). См. результаты на рисунке S17.

Филогенетическое дерево

Белковая последовательность Ppa-UAR1 была отправлена ​​на поиск NCBI BLASTp 57 (только для видов C.elegans , условный композиционный BLOSUM62, стоимость открытия пробела: 11, стоимость расширения пробела: 1, размер слова: 6) с использованием программного обеспечения Geneious (Biomatters Inc). Были выбраны лучшие совпадения BLAST по значению E до ace-3 включительно, и для каждого совпадения белковой последовательности сохранялся только вариант транскрипта с наилучшей оценкой. В общей сложности 28 последовательностей были затем импортированы в MEGA7 58 и выровнены с использованием MUSCLE 59 (настройки: штраф за открытие пробела: -2,9, расширение пробела 0, множитель гидрофобности 1.2, макс. итераций 8, метод кластеризации для всех итераций: UPGMB, минимальная длина диагонали: 24). Из этого выравнивания было построено дерево максимального правдоподобия на основе матричной модели JTT 60 . Исходные деревья были построены путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием модели JTT, предполагающей одинаковые коэффициенты замещения по позициям. Достоверность филогенеза была проверена с использованием 200 бутстреп-репликаций. Дерево с наивысшей логарифмической вероятностью (-22299.9282). В каждой ветви указан процент реплик начальной загрузки, содержащих одно и то же событие ветвления. Дерево нарисовано в масштабе, длина ветвей измеряется количеством замен на сайт. Эволюционная история была выведена с использованием метода максимального правдоподобия на основе матричной модели JTT 60 . Показано дерево с наивысшей логарифмической вероятностью (-22299,9282). Рядом с ветвями показан процент деревьев, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе.Исходные деревья для эвристического поиска были получены автоматически путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием модели JTT, а затем выбора топологии с более высоким значением логарифмического правдоподобия. Дерево нарисовано в масштабе, длина ветвей измеряется количеством замен на сайт. В анализе участвовало 28 аминокислотных последовательностей. Все позиции, содержащие пробелы и недостающие данные, были устранены. Всего в финальном наборе данных было 427 позиций.Эволюционные анализы проводились в MEGA7 58, 61 .

Штаммы нематод

Дикого типа (N2) и glo-1(zu437) нулевых животных были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Мутантный штамм cest-2.2 , интегрирующий N-концевой (mCherry- cest-2.2 ) или C-концевой mCherry ( cest-2.2 -mCherry), был создан SunyBiotech. Поколение С.elegans и C. briggsae нуль-мутантов и ревертантов, а также получение точечного мутанта cest-1.1 описано ниже. См. Таблицу 3 для полного списка штаммов, использованных в этом исследовании.

C. elegans Мутагенез CRISPR для получения cest нулевых мутантов Вкратце, штамма C. elegans N2 подвергали генетическому редактированию путем вставки вставки из 43 пар оснований, которая нарушает трансляцию.Независимые гомозиготные мутанты были отобраны среди потомства гетерозиготного потомства F1 инъецированных гермафродитов и получили различные уникальные названия аллелей. Таким же образом осуществляли реверсию мутантов.

C. briggsae Мутагенез CRISPR для создания glo-1 нулевых мутантов in Cohen and Sternberg 2019 62 и Wang et al.2018 37 . Оба штамма были получены с помощью успешной вставки кассеты STOP-IN в середину первого экзона с использованием направляющей AACAAATCTCCGGATGATTG. Для обнаружения вставки использовали прямой праймер GGGTGACGCCCATTTATTG и обратный праймер AAAGGCGCACATCTTGCTTC.

C. elegans Мутагенез CRISPR для получения аллеля cest-1.1(dp683) аллеля, кодирующего каталитический мутант S213A

cest-1(dp683) был получен, как описано ранееВкратце, животных с мутацией daf-2(e1368) инъецировали собранных in vitro комплексов Cas9-crРНК-tracrRNA, нацеленных на cest-1.1 и гена ко-CRISPR dpy-10 и двух репарационных олигонуклеотидов. содержащий желаемую мутацию cest-1.1 и ко-CRISPR мутацию dpy-10(cn64) 64 . Последовательности cest-1.1 crRNA и репарирующего олигонуклеотида представляют собой 5’ acctacCGCTACTATCATAC 3’ и 5’ GAAATTGAAAACTTTGGAGGAAATAAAAACAG-AATTACATTGGCAGGGCATGCCGCTGGAGCAAGTATGATAGTAGCGgtaggtcacataaatgataca ttttg 3’ соответственно.Потомство F1 Rol инъецированных животных отбирали и подвергали скринингу на наличие мутации cest-1.1(dp683) после откладки яиц. Выводки F2 животных F1 Rol, которые были гетерозиготными по cest-1.1(dp683) , подвергали скринингу на животных, гомозиготных по cest-1.1(dp683) и либо дикого типа, либо гетерозиготных по cn64 при dpy- 10 местонахождение. Последующие выводки были проверены на наличие животных дикого типа dpy-10 для удаления ко-CRISPR-мутации.

Визуализация нематод

Для визуализации беременных особей особей C. elegans переносили на агарозный слой предметного стекла с 10 мкМ левамизола для иммобилизации червей. Микроскопический анализ проводили с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5. Зеленую автофлуоресценцию возбуждали при 488 нм, а эмиссионный детектор устанавливали на 490-540 нм. mCherry возбуждали при 561 нм, а эмиссионный детектор устанавливали на 590-650 нм. Черви были изображены с использованием объектива 100x.

Визуализация C. briggsae

0,5 мл 2 мкМ Lysotracker Deep Red (1 мМ исходный раствор Thermo Fisher в ДМСО) добавляли в 6-сантиметровый планшет NGM, засеянный 0,1 мл E. coli OP50, и инкубировали в темноте в течение 24 часа при 20°С. В чашку добавляли личинок L4 C. briggsae и давали им расти в темноте в течение 24 часов при 20°C. Для получения изображения C. briggsae были перенесены на агарозную подушку на предметном стекле с 10 мкМ левамизола для иммобилизации червей.Микроскопический анализ проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Imager Z2 с Apotome.

Культуры нематод, смешанная стадия

Культивирование начинали с разделения C. elegans или C. briggsae на 10-сантиметровые чашки NGM (каждая засеяна 800 мкл OP50 E. coli , выращенная до стационарной фазы в бульоне Леннокса) и инкубировали при 22°С. После употребления пищи культуры инкубировали еще 24 часа. Затем каждую пластину промывали 25 мл S-полной среды в колбу Эрленмейера на 125 мл и 1 мл OP50 E.coli ( культуры E. coli выращивали до стационарной фазы в бульоне Terrific, осаждали и ресуспендировали в количестве 1 г сырой массы на 1 мл буфера M9), встряхивая при 220 об/мин и 22 °C. Через 70 ч культуры центрифугировали при 5000 G в течение 1 мин. После удаления супернатанта добавляли 24 мл H 2 O вместе с 6 мл отбеливателя, 900 мкл 10 М NaOH и смесь встряхивали в течение 3 мин для приготовления яиц. Яйца центрифугировали при 5000 G, супернатант удаляли, а яичный осадок дважды промывали 35 мл буфера М9, а затем суспендировали в конечном объеме 5 мл буфера М9 в центрифужной пробирке объемом 50 мл.Яйца подсчитывали, помещали на качалку и оставляли для вылупления личинок L1 в течение 24 часов при 22°C. 70 000 личинок L1 высевали в 25 мл культур S-complete с 1 мл OP50 и инкубировали при 220 об/мин и 22 °C в колбе Эрленмейера на 125 мл. Через 72 часа культурам добавляли еще 1 мл OP50 и продолжали инкубацию. Еще через 48 часов червей вращали при 1000 G в течение 5 мин и отработанную среду отделяли от осадка тела червя. Отделенную среду и осадок червей быстро замораживали над жидким азотом до дальнейшей обработки.Для всех мутантных штаммов выращивали не менее трех биологических повторов. Мутанты выращивали с параллельными контролями дикого типа, и биологические повторы начинали в разные дни.

Экстракция метаболитов

Образцы лиофилизированных гранул и сред измельчали ​​и гомогенизировали путем встряхивания со стальными шариками диаметром 2,5 мм при 1300 об/мин в течение 3 мин импульсами по 30 с при охлаждении жидким азотом (SPEX Sample Prep miniG 1600). Таким образом, образцы порошкообразной среды и осадка экстрагировали 15 мл метанола в центрифужных пробирках на 50 мл, встряхивая в течение ночи при 22°C.Экстракты осаждали при 5000 g в течение 10 мин при 4 °C, а супернатанты переносили в стеклянные сцинтилляционные флаконы на 20 мл. Затем образцы сушили в вакуумном концентраторе SpeedVac (Thermo Fisher Scientific). Высушенные материалы ресуспендировали в 1 мл метанола и встряхивали в течение 1 мин. Образцы осаждали при 5000 г в течение 5 минут и при 22 °C, а супернатанты переносили во флаконы для ВЭЖХ объемом 2 мл и сушили в вакуумном концентраторе SpeedVac. Затем образцы ресуспендировали в 200 мкл метанола, переносили в 1.пробирки Эппендорфа на 7 мл и центрифугировали при 18 000 g в течение 20 мин при 4 °C. Осветленные экстракты переносили в свежие флаконы для ВЭЖХ и хранили при -20°C до анализа.

Приготовление

образцов экзо--метаболома из голодающих и кормящихся культур

40 000 синхронизированных личинок L1 добавляли в колбы Эрленмейера на 125 мл, содержащие 30 мл S-полной среды. Червей кормили 4 мл концентрированного ОП-50 и инкубировали при 20°С при встряхивании при 160 об/мин в течение: 12 ч (L1), 24 ч (L2), 32 ч (L3), 40 ч (L4) и 58 ч. (беременные взрослые).Для приготовления голодающих образцов каждую из стадий подвергали голоданию в течение 24 ч после достижения желаемой стадии развития в S-complete без OP-50. После инкубации в течение желаемого времени жидкие культуры центрифугировали (1000 x g, 22 °C, 1 мин) и собирали супернатанты. Супернатант отделяли от интактных клеток OP-50 центрифугированием (3000×g, 22 °C, 5 мин) и полученные супернатанты ( экзо--метаболом) лиофилизировали. Лиофилизированные образцы гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса в 10 мл метанола и экстрагировали на мешалке (22°С, 12 ч).Полученную суспензию центрифугировали (4000 g, 22 °C, 5 мин) для удаления любого осадка перед тем, как осторожно перенести в пробирку для образцов ЖХ-МС. Три биологические повторности запускали в разные дни.

Масс-спектрометрический анализ

Анализ ЖХ-МС высокого разрешения выполняли на системе УВЭЖХ Thermo Fisher Scientific Vanquish Horizon в сочетании с масс-спектрометром высокого разрешения с гибридной квадрупольно-орбитальной ловушкой Thermo Q Exactive HF, оснащенным источником ионов HESI.

1 мкл экстракта вводили и разделяли с использованием градиента вода-ацетонитрил на колонке Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 (150 мм x 2.1 мм, размер частиц 1,9 мкм, размер пор 175 Å, Thermo Scientific) и выдерживали при 40 °C. Все растворители были приобретены у Fisher Scientific в чистоте для ВЭЖХ. Растворитель А: 0,1% муравьиной кислоты в воде; растворитель B: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле. Градиент A/B начинался с 1% B в течение 5 минут, затем от 1% до 100% B в течение 20 минут, 100% в течение 5 минут, затем снижался до 1% B в течение 3 минут. Параметры масс-спектрометра: напряжение распыления 3,5 кВ, температура капилляра 380 °C, температура нагревателя зонда 300 °C, скорость потока оболочки 60, скорость вспомогательного потока 20, 1 запасной газ; S-объектив RF уровень 50.0, разрешение 240 000, м/з, диапазон 100-1200 м/з, цель АРУ 3e6. Прибор был откалиброван с помощью калибровочных растворов положительных и отрицательных ионов (Thermo-Fisher) Pierce LTQ Velos ESI pos/neg калибровочные растворы.

Обнаружение и характеристика признаков

Файлы RAW ЖХ-МС для каждого образца были преобразованы в mzXML (режим центроида) с помощью MSConvert (ProteoWizard) с последующим анализом с использованием функции анализа XCMS 65 в METABOSeek (metaboseek.com). Обнаружение пиков было выполнено с помощью алгоритма centWave 29 , значения установлены как: 4 ppm, 320 ширина пика, 3 snthresh, 3100 предварительный фильтр, FALSE fitgauss, 1 интегрирование, TRUE firstBaselineCheck, 0 шум, wMean mzCenterFun, -0.005 мзддиф. Значения группировки признаков XCMS были установлены как: 0,2 минфрак, 2 bw, 0,002 mzwid, 500 макс, 1 мин отсчет, FALSE usegroup. Пиковые значения заполнения METABOSeek установлены как: 5 ppm_m, 5 rtw, TRUE rtrange. Полученные таблицы затем обрабатывались с помощью METABOSeek Data Explorer. Молекулярные признаки были отфильтрованы для каждого конкретного нулевого мутанта по сравнению со всеми другими мутантами. Значения фильтра были установлены следующим образом: от 10 до максимального значения minFoldOverCtrl, от 15000 до максимального значения meanInt, от 120 до 1500 rt, от 0,95 до максимального качества пика, рассчитанного с помощью METABOSeek. Затем функции были отобраны вручную путем удаления изотопной и аддуктивной избыточности.5, максимум IT 80 мс, окно изоляции 1,0 m/z, ступенчатый NCE (нормализованная энергия столкновения) 25, 50, динамическое исключение 3 с.

Статистический анализ

Данные интеграции пиков из анализа ВЭЖХ-МС были логарифмически преобразованы 66 перед статистическим анализом. Значимость различий между средними площадями пиков затем оценивали с использованием непарных t-тестов.

MS

2 на основе молекулярных сетей

Из списка дифференциальных признаков, описанных выше, для этих признаков были получены данные MS 2 .Для создания молекулярной сети MS 2 использовалась программа Metaboseek версии 0.9.6. Используя функции сканирования MS2, дифференциальные функции были сопоставлены с их соответствующим сканированием MS 2 с использованием окна m/z , равного 5 ppm, и окна времени удерживания, равного 15 секундам. Для построения молекулярной сети допуск пиков фрагментов был установлен на m/z 0,002 или 5 ppm, минимальное количество пиков было установлено на 5 с уровнем шума 2%. После того, как сеть была построена, значение cos равно 0.Было использовано 8, а количество возможных соединений было упрощено до 5.

Дендрограмма серингидролазы

Список серингидролаз сообщался ранее 67 . Из этого списка последовательности были введены в Geneious Prime (версия 2020.1.2 Biomatters). Последовательности выравнивали с помощью Clustal Omega, выравнивания по соседним соединениям. Дерево дендрограммы было сгенерировано с помощью Geneious Tree Builder; Модель генетического расстояния Джукса-Кантора, метод построения дерева UPGMA, без внешней группы, повторная выборка Bootstrap, случайное начальное число 508 949, 300 взаимодействий, порог поддержки 1.Ферменты CEST были окрашены в красный цвет, PPA-UAR-1 — в синий, а примеры протеаз — в зеленый (рис. S1).

2. Синтетические процедуры

Синтез иглу#1 (15). iglu#1 был синтезирован, как описано ранее 68 .

Синтез англ №1 (17). angl#1 был синтезирован, как описано ранее 69 .

Синтез 2-(( трет--бутоксикарбонил)амино)бензойной кислоты (Boc-AA, SI-1).

К раствору антраниловой кислоты ( 33 , 300 мг, 2.18 ммоль) в 4 мл ТГФ и Н 2 О (1:1), добавляли Бокангидрид (520,8 мг, 2,39 ммоль) и к смеси добавляли 2 М NaOH до достижения рН 10. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 23 часа раствор концентрировали 90 003 в вакууме 90 004 и добавляли 15% водный раствор лимонной кислоты до достижения рН 4. Белый осадок отфильтровывали и сушили в вакууме с получением 2-(( трет--бутоксикарбонил)амино)бензойной кислоты ( SI-1 , 496.7 мг, 96%) в виде белого твердого вещества. 1 H ЯМР, 600 МГц, хлороформ-d: δ (м.д.) 10,06 (с, 1H), 8,47 (дд, J = 8,7, 0,9 Гц, 1H), 8,08 (дд, J = 7,9, 1,5 Гц, 1H) ), 7,57 (дт, J = 7,9, 1,5 Гц, 1H), 7,03 (дт, J = 7,2, 1,2 Гц, 1H), 1,55 (с, 9H).

Синтез

N β -(6-(2ʹ-аминобензоил)-глюкопиранозил)индол (иглу#3, 34)

К перемешиваемому раствору N -( третбутилоксикарбонил)антил кислота 70 ( SI-1 , 10 мг, 0.042 ммоль) в диметилформамиде, добавляли гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC·HCl, 20,1 мг, 0,105 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин и 4-диметиламинопиридин (ДМАП, 18,1 мг, 0,105 ммоль) и N β -глюкопиранозилиндол (iglu#1, 15 , 9,8 мг, 0,0351 ммоль) были добавлены. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 5 часов смесь концентрировали в вакууме с получением вязкого масла, которое растворяли в 1.4 мл смеси 5:2 дихлорметана и метанола. Медленно добавляли трифторуксусную кислоту (ТФУ, 0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 3 часа смесь концентрировали в вакууме . Препаративная ВЭЖХ дала чистый образец iglu#3 ( 34 , 0,8 мг, 5,7%). См. Таблицу 5 для данных ЯМР-спектроскопии iglu#3.

Таблица 5. Данные спектроскопии ЯМР для iglu#3 (34).

1 H (600 МГц), данные спектроскопии ЯМР HSQC и HMBC были получены в метаноле- d 4 .Химические сдвиги относились к δ (C H D 2 OD) = 3,31 м.д. и δ ( 13 C HD 2 OD) = 49,00 м.д.

HRMS (ESI) m/z : [M – H] рассчитано для C 21 H 21 N 2 O 6 938;138; найдено 397.14017.

Синтез

N β -(6-никотиноилглюкопиранозил)индола (iglu#5, SI-2)

К раствору никотиновой кислоты (7,3 мг, 0,059 ммоль) в смеси диметилформамида и дихлорметана при перемешивании (1:1), ЭДХ·HCl (28.4 мг, 0,148 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем добавляли DMAP (18,1 мг, 0,148 ммоль) и N β – глюкопиранозилиндол (iglu#1, 15 , 13,8 мг, 0,0494 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч, смесь концентрировали 9000 3 в вакууме 9000 4 , и колоночная флэш-хроматография на силикагеле с использованием градиента 0-25% метанола в дихлорметане давала iglu#5 ( SI-2 , 2.5 мг, 13,9%) в виде бесцветного масла. См. Таблицу 6 для данных ЯМР-спектроскопии iglu#5.

Таблица 6. Данные спектроскопии ЯМР для iglu#5 (SI-2).

1 H (600 МГц), данные спектроскопии ЯМР HSQC и HMBC были получены в метаноле- d 4 . Химические сдвиги относились к δ (C H D 2 OD) = 3,31 м.д. и δ ( 13 C HD 2 OD) = 49,00 м.д.

HRMS (ESI) m/z : [M + H] + рассчитано для C 20 H 21 N 2 O 6 385.13941; найдено 385.14038.

Синтез

N β -(6-(2′-метилбут-2′ E -еноил)-глюкопиранозил) индола (iglu#7, SI-3)

К раствору тигловой кислоты при перемешивании ( 5,0 мг, 0,050 ммоль) в смеси 1:1 диметилформамида и дихлорметана, добавляли EDC·HCl (23,9 мг, 0,125 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и добавляли ДМАП (15,2 мг, 0,125 ммоль) и N β -глюкопиранозилиндол (iglu#1, 15 , 11.6 мг, 0,0416 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 22 часов и затем концентрировали в вакууме . Колоночная флэш-хроматография на диоксиде кремния с использованием градиента 0-30% метанола в дихлорметане давала iglu#7 ( SI-3 , 2,5 мг, 11,3%) в виде бесцветного масла. См. Таблицу 7 для данных ЯМР-спектроскопии iglu#7.

Таблица 7. Данные ЯМР-спектроскопии для iglu#7 (SI-3).

1 H (600 МГц), данные спектроскопии ЯМР HSQC и HMBC были получены в метаноле- d 4 .Химические сдвиги относились к δ (C H D 2 OD) = 3,31 м.д. и δ ( 13 C HD 2 OD) = 49,00 м.д.

HRMS (ESI) m/z : [M + H] + рассчитано для C 19 H 24 NO 6 362.15981; найдено 362.16025.

Синтез

N β -(6-(пиррол-2′-карбонил)-глюкопиранозил) индола (iglu#9, SI-4)

К суспензии пиррол-2-карбоновой кислоты (6,0 мг , 0.054 ммоль) в дихлорметане, медленно добавляли оксалилхлорид (14 мкл, 0,163 ммоль), а затем диметилформамид (1 мкл, 0,0129 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов и затем концентрировали досуха в вакууме . Остаток повторно растворяли в диметилформамиде (2 мл), содержащем N β – глюкопиранозилиндола (iglu # 1, 15 , 10,8 мг, 0,0387 ммоль). Добавляли триэтиламин (45 мкл, 0,324 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 35°С в течение 7 дней.Затем смесь концентрировали в вакууме и колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния с использованием градиента 0-30% метанола в диметилформамиде получали iglu#9 ( SI-4 , 1,5 мг, 10,4%) в виде бесцветного масла. . См. Таблицу 8 для данных ЯМР-спектроскопии iglu#9.

Таблица 8. Данные спектроскопии ЯМР для iglu#9 (SI-4).

1 H (600 МГц), данные спектроскопии ЯМР HSQC и HMBC были получены в метаноле- d 4 . Химические сдвиги относились к δ(C H D 2 OD) = 3.31 м.д. и δ( 13 C HD 2 OD) = 49,00 м.д.

Таблица 9.

Список всех модульных метаболитов, упомянутых в тексте и на рисунках.

Таблица 10.

Скомпилированные данные, представленные на рисунках 1, 3, 4, S6, S7, S9, S10, S11, S13 и S16. Прикрепил отдельным файлом.

HRMS (ESI) m/z : [M + H] + рассчитано для C 19 H 21 N 2 O 6 9413; найдено 373.14026.

Синтез стандарта ВЭЖХ ((2

R ,3 S ,4 S ,5 R ,6 S )-6-((2-аминобензоил)окси)-3,4 ,5-тригидрокситетрагидро-2 H -пиран-2-ил)метил 2-аминобензоат (angl#3, SI-5)

К перемешиваемому раствору Boc-AA (2 мг, 0.00, 84 ммоль) в диметилформамиде, добавляли гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC·HCl) (3,9 мг, 0,0203 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут и добавляли 4-диметиламинопиридин (ДМАП) (2,5 мг, 0,0203 ммоль) и angl#1 ( 17 , 2 мг, 0,0068 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 5 часов смесь концентрировали 90 003 в вакууме 90 004 . Неочищенный продукт растворяли в 0,55 мл дихлорметана и метанола (10:1) и медленно добавляли трифторуксусную кислоту (TFA, 500 мкл).Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем концентрировали в вакууме , получая англ#3 ( SI-5 ).

HRMS (ESI) m/z : [M + H] + рассчитано для C 20 H 23 N 2 O 7 9903;.148; нашел 403.15100.

Синтез стандарта ВЭЖХ

N -( p -аминобензоил)глутамат (ПАБК-глутамат) (29)

p -Аминобензойная кислота (Chem-Impex) ( 8 дихлорметан (DCM), содержащий триэтиламин (0.1 экв.). К реакционной смеси добавляли EDC·HCl (Amresco Biochemicals) (1 экв.) и ди--трет--бутилглутамат (1 экв.). Затем к смеси добавляли N , N -диметиламинопиридин (1,1 экв.) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили сульфатом натрия и упаривали досуха в вакууме . Неочищенный продукт растворяли в ДХМ и добавляли трифторуксусную кислоту (ТФУ) (100 экв.).Затем реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре. ТФУ и ДХМ выпаривали с получением сырого ПАБК-глутамата ( 29 ). 1 H ЯМР, 600 МГц, метанол: δ (м.д.) 7,93 (д, 8,6 Гц, 2H), 7,37 (д, 8,5 Гц, 2H), 4,61 (дд, 5,0, 9,3 Гц, 1H), 2,09–2,28 (м, 4ч).

Вклад авторов

Рукопись была написана благодаря вкладу всех авторов, и все авторы одобрили окончательную версию рукописи.

Эти авторы внесли одинаковый вклад.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось за счет учебного гранта NIH Chemical Biology Interface (CBI) 5T32GM008500 (для B.C.), грантов Национального института здравоохранения R35 GM131877 (для FCS) и R24OD023041 (для PWS). Ф.С.С. является научным сотрудником Медицинского института Говарда Хьюза. Мы благодарим WormBase за последовательности, Tsui-Fen Chou за белок Cas9, Ying (Kitty) Zhang за помощь в спектроскопии ЯМР и Navid Movahed за помощь в масс-спектрометрии.

Список литературы

  1. 1.↵
  2. 2.↵
  3. 3.↵
  4. 3.↵
  5. 4.↵
  6. 5.
  7. 5.
  8. 6.
  9. 7.
  10. 9.↵
  11. 9
  12. 10 .
  13. 11.
  14. 12.↵
  15. 13.↵
  16. 14.↵
  17. 15.↵
  18. 15.↵
  19. 16.↵
  20. 17.↵
  21. 18.↵
  22. 19.↵
  23. 20. ↵
  24. 21.↵
  25. 22.↵
  26. 23.↵
  27. 24.
  28. 25.↵
  29. 26.↵
  30. 27.957↵
  31. 28.↵
  32. 29.↵
  33. 30.↵
  34. 31.
  35. 33.
  36. 33.
  37. 33.↵
  38. 34.↵
  39. 35.↵
  40. 36.↵
  41. 37.↵
  42. 37.↵
  43. 37

    Ван, Х., Парк, Х., Лю, Дж. и Штернберг, П. В. Эффективная стратегия редактирования генома для создания предполагаемых нулевых мутантов Caenorhabditis elegans с использованием CRISPR/Cas9. G3 (Bethesda) 8, 3607–3616, doi: 10.1534/g3.118.200662 (2018).

  44. 38.↵
  45. 39.↵
  46. 40.↵
  47. 41.↵
  48. 42.↵
  49. 43.↵
  50. 44.↵
  51. 45.↵
  52. 45.↵
  53. 47.↵
  54. 47.
  55. 47.↵
  56. 49.
  57. 49.↵
  58. 50.↵
  59. 51. ↵
  60. 52.↵
  61. 53.↵
  62. 54.↵
  63. 55.↵
  64. 56.↵
  65. 56.↵
  66. 57.↵
  67. 58.↵
  68. 59.↵
  69. 60.↵
  70. 61. ↵
  71. 62.↵
  72. 63.↵
  73. 64.↵
  74. 65.↵
  75. 66.↵
  76. 67.↵
  77. 68.↵
  78. 69.↵
  79. 70. ↵

    Крюгер, Э.Б., Роусон, Т.Е., Бердик, Д.Дж., Лян, Дж. и Чжу, Б.-Ю. ИНГИБИТОРЫ ПИРИМИДИНКИНАЗ. (2008).

Мягкое небо является важным местом адаптации трансмиссивных вирусов гриппа

Аннотация

Вирусы гриппа А представляют серьезную угрозу для общественного здравоохранения, вызывая сезонные эпидемии и спорадические пандемии. Их эпидемиологический успех зависит от воздушно-капельной передачи от человека к человеку; однако свойства вируса, определяющие передачу вирусов гриппа А воздушно-капельным путем, сложны.Вирусная инфекция гриппа А опосредована связыванием вирусного гемагглютинина (HA) с терминально прикрепленными α2,3 или α2,6 сиаловыми кислотами на гликопротеинах клеточной поверхности. Вирусы гриппа А человека предпочтительно связывают α2,6-связанные сиаловые кислоты, тогда как вирусы птичьего гриппа А связывают α2,3-связанные сиаловые кислоты на сложных гликанах эпителиальных клеток дыхательных путей. Исторически сложилось так, что вирусы гриппа А с преимущественной ассоциацией с α2,3-связанными сиаловыми кислотами не передавались эффективно воздушно-капельным путем у хорьков.Здесь мы наблюдаем эффективную передачу по воздуху пандемического вируса h2N1 (h2N1pdm) 2009 года (A/California/07/2009), сконструированного таким образом, чтобы предпочтительно связывать α2,3-связанные сиаловые кислоты. Передача воздушно-капельным путем была связана с быстрым отбором вируса с изменением в одном сайте HA, которое обеспечивало связывание с длинноцепочечными α2,6-связанными сиаловыми кислотами без потери связывания с α2,3-связанными сиаловыми кислотами. Трансмиссивный вирус появился у экспериментально инфицированных хорьков в течение 24 часов после заражения и значительно увеличился в мягком небе, где на поверхности носоглотки преобладают длинноцепочечные α2,6-связанные сиаловые кислоты.Примечательно, что наличие длинноцепочечных α2,6-связанных сиаловых кислот сохраняется в мягком небе хорька, свиньи и человека. Используя подход потери функции с этим одним вирусом, мы продемонстрировали, что мягкое небо хорька, ткань, обычно не отбираемая в животных моделях гриппа, быстро отбирает трансмиссивные вирусы гриппа А с человеческим рецептором (α2,6-связанные сиаловые кислоты). ) предпочтения.

Отделение
Гарвардский университет – Отдел медицинских наук и технологий Массачусетского технологического института; Массачусетский Институт Технологий.кафедра биологической инженерии; Институт Коха интегративных исследований рака при Массачусетском технологическом институте

Цитата

Лакдавала, Сима С. и др. «Мягкое небо является важным местом адаптации трансмиссивных вирусов гриппа». Природа 526.7571 (2015): 122–125.

Версия: Окончательная версия рукописи автора

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.