5 ga: RSM 5 GA, серия rsm 5ga, marina.

alexxlab | 04.02.1984 | 0 | Разное

Содержание

Заповедная зона – 6372,5 га / КонсультантПлюс

Лесничество	Квартал	Выдела
Тургиновское	30	1 – 12
Тургиновское	40	1 – 19
	49	1 – 16, 18
	50	1 – 25, 27 – 28
	54	1 – 12, 14 – 15
	55	1 – 21
	56	1 – 24
	65	1 – 15, 17
	66	1 – 22
	67	1 – 19
	100	1 – 27
	101	1 – 25, 27
	112	1 – 26, 28 – 29
	113	1 – 16, 18
	133	1 – 7, 9 – 18, 20 – 24, 26 – 28, 30, 33 – 36, 38, 40 – 41
	135	1 – 3, 5 – 9, 12 – 20, 22 – 35, 37 – 40, 42 – 43
	136	3 – 6, 8 – 21, 23 – 24, 26 – 27
Грибановское	24	1 – 34, 36
Грибановское	25	1 – 41
	26	1 – 44, 46 – 49, 51, 53, 55, 57, 59
	27	1 – 37, 39, 41 – 58, 60 – 61
	28	1 – 35
	29	1 – 29
	33	1 – 24, 26 – 27
	34	1 – 41, 43 – 53, 55 – 56, 58 – 59
	35	1 – 9, 11 – 30, 32 – 43, 45 – 46, 48 – 59, 62 – 66, 68, 70
	36	1 – 41
	37	1 – 25
	38	1 – 34
	39	1 – 40, 42 – 44
	41	1 – 16, 18 – 22, 24 – 41, 44 – 45
	42	1 – 8, 10 – 25, 27 – 45, 47 – 51, 53, 55
	43	1, 3 – 41, 43, 45 – 46
	44	1 – 31, 33 – 34
	45	1 – 28
	46	1 – 27, 29 – 35
	47	1 – 20, 22 – 38, 40 – 46, 48 – 49
	54	1 – 7, 9 – 33, 35
	55	1 – 6, 8 – 11, 13 – 26, 28 – 30, 32, 34 – 41
	56	1 – 43, 45 – 47
	57	1 – 59
Александровское	78	1 – 21
Александровское	79	1 – 25, 27 – 28
	80	1 – 45
	86	1 – 14, 16 – 32
	87	1, 3 – 15
	88	1 – 16
	89	1 – 23
	90	1 – 23
	102	1 – 17
	103	1 – 11
	104	1 – 25
	105	1 – 11, 13 – 48
	119	1 – 23

ДОМ.РФ передаст Союзу архитекторов России 55,5 га земли в Подмосковье

ДОМ.РФ передаст в безвозмездное пользование Союзу архитекторов России (САР) земельный участок площадью 55,5 га на территории подмосковной усадьбы Суханово. Это позволит организации сохранить и обустроить парк с историческими зданиями.

Как отметил заместитель генерального директора ДОМ.РФ Денис Филиппов, объединение в одних руках всего историко-культурного комплекса поможет его дальнейшему развитию и благоустройству существующего парка.

«Территория вокруг Дома творчества Союза архитекторов России имеет особый статус, она включена в состав объекта культурного наследия федерального значения «Усадьба Суханово, XIX века». Это еще и яркий памятник русского классицизма, знаковое место для всего Московского региона. После передачи этой территории в пользование Союзу, парковый комплекс должен получить новый импульс для развития», — отметил Денис Филиппов.

Президент Союза архитекторов России Николай Шумаков подтверждает, что факт безвозмездной передачи земли в Суханово Союзу архитекторов России позволит превратить участок, имеющий статус федерального значения, в современную благоустроенную рекреационную территорию. «В полной мере этой территорией смогут воспользоваться не только архитекторы, но и жители Подмосковья, туристы, — все, для кого Суханово всегда было и остаётся заповедным местом, хранящим отечественную историю. Уверен, что подписание этого договора и передача земли Союзу архитекторов России определённо сыграет положительную роль для дальнейшего развития всего историко-культурного комплекса», — добавил он.

Территория подсобного хозяйства «Суханово» в Ленинском районе с 1989 года находилась в ведении Дома творчества Союза архитекторов СССР, преемником которого в 1992 году стал САР. Затем территория с комплексом зданий перешла госпредприятию «Историко-культурный центр «Суханово». В 2000 году здания усадьбы «Суханово» были переданы в безвозмездное пользование Союзу архитекторов, а земля с парком осталась в казне РФ. В конце апреля 2021 года земля вернулась к САР — решение было принято Правительством РФ по поручению Президента России.

Справочно:
ДОМ.РФ в рамках 161-ФЗ «О содействии развитию жилищного строительства» обладает полномочиями агента РФ по вовлечению в оборот и распоряжению земельными участками и иными объектами недвижимого имущества, находящимися в федеральной собственности и не используемыми правообладателями. В настоящее время агентские полномочия ДОМ.РФ установлены в отношении земельных участков и объектов недвижимости в большинстве регионов России.

Лесные пожары охватили новые районы Башкирии, их площадь достигла 3,5 тыс. га | Экология

11 августа. Более 3,5 тыс. га леса охвачены огнем в районах башкирского Зауралья, сообщила пресс-служба ГУ МЧС по республике во вторник.

“Продолжают действовать 25 очагов лесных пожаров на общей площади более 3,5 тыс. га: два – в Хайбуллинском, десять – в Бурзянском, по три – в Зилаирском и Зианчуринском, два – в Белорецком и по одному в Баймакском и Дуванском районах”, – говорится в сообщении.

Большая часть очагов на площади 3,4 тыс. га в настоящий момент локализована.

По состоянию на 8:00 мск среды новых очагов природных пожаров на территории региона не зарегистрировано. За прошедшие сутки полностью ликвидировано восемь очагов на общей площади 25,1 га.

В тушении пожаров задействованы около 1,2 тыс. человек и 285 единицы техники. В частности, тяжелой техникой проводится опашка населенных пунктов, граничащих с лесными массивами, прокладка минерализованных полос. Проводится авиамониторинг лесопожарной обстановки с применением самолета АН-2 и беспилотными летательными аппаратами МЧС России и Росгвардии.

В тушении природных пожаров задействованы также волонтеры. Накануне из Уфы в районы Зауралья выехали три автобуса с 60 добровольцами.

На сайте главы Башкирии в свою очередь сообщается, что 11 августа к ликвидации лесных пожаров в южных районах подключатся промышленные предприятия региона.

“К ликвидации пожаров в Зауралье приступят и ведущие промышленные предприятия региона. В их числе – “Башкирская содовая компания”, “Газпром нефтехим Салават” и другие. На их базе сформируют механизированные бригады тяжёлой гусеничной техники, которые уже утром 11 августа приступят к опашке лесов и созданию минерализованных полос”, – говорится в сообщении.

Как сообщалось, с 4 августа на юге Башкирии бушуют лесные пожары. На утро 10 августа действовали 27 очагов на общей площади 3,1 тыс. га, в том числе 1,3 тыс. га в Хайбуллинском районе, 195 га в Бурзянском, 1,1 тыс. га в Зилаирском, 448 га в Зианчуринском, 3,5 га в Абзелиловском районах.

На Северо-Востоке создадут парк размером 5,5 га. КАМЧАТКА-ИНФОРМ.

12 июля 2021 23:49

Первое выездное совещание по реализации проекта на Вольского, 22 в микрорайоне Северо-Восток состоялось на месте будущего парка размером в 5,5 гектаров.

В совещании приняли участие глава города Константин Брызгин, краевой депутат по 8-му избирательному округу Андрей Стуков, специалисты городской администрации.

Будущий парк с современным наполнением разместится на территории размером в 5,5 гектаров в районе ул. Вольского 22. Сейчас на этом месте – заброшенная зеленая зона с незаконными гаражами. Отвести эту территорию под место массового отдыха стало возможным благодаря кадастровым работам, проведенным по инициативе депутатов 8-го округа.

«В 2018 году по инициативе депутатов 8-го округа были проведены комплексные кадастровые работы в микрорайоне Северо-Восток, в ходе которых были достигнуты две основных задачи: определен участок для строительства дополнительного корпуса СОШ № 40 и участок на Вольского, 22 под парковую зону. А в 2021 году эта территория победила благодаря активности жителей и стала лидером проекта “Комфортная городская среда”. Парк будет масштабным и современным. При его наполнении мы, в первую очередь, будем советоваться с жителями. К первому этапу городские власти планируют приступить уже в этом году – это вертикальная планировка территории и начало строительства детской площадки. В 22-м году здесь будут строить пешеходные и велосипедные дорожки. И так постепенно на этом месте появится прекрасная зона отдыха для взрослых и детей», – рассказал Андрей Стуков.

По проекту в парке построят детские игровые, спортивную и смотровую площадки, скейтпарк, фудкорт, амфитеатр.

«Эта территория станет парком с многими активностями, в том числе – с инклюзивной площадкой, площадкой для выгула собак, – рассказал Константин Брызгин. – Сегодня у нас есть перспективный план, но он неокончательный. Каждую из планируемых зон будем обсуждать с жителями, принимать предложения и реализовывать совместно. В этом году начнем планировку территории под детские площадки. А в следующем году благоустройство будет продолжено по программе «Комфортная городская среда».

Андрей Стуков поблагодарил жителей Северо-Востока за активное участие в голосовании по проекту «Комфортная городская среда».

«Мы наладим общественный контроль за реализацией проекта и пригласим к этому активных жителей микрорайона, чтобы будущий парк стал настоящей территорией комфорта», – сказал депутат.

На Северо-Востоке создадут парк размером 5,5 га

GA-AX370-Gaming 5 (rev. 1.0) Основные характеристики | Материнская плата

Одновременно вы можете добавить не более 5 элементов для сравнения.

Закрывать

Поддерживает AMD Ryzen ™ 3-го поколения / Ryzen ™ 2-го поколения / Ryzen ™ 1-го поколения / Ryzen ™ 2-го поколения с графикой Radeon ™ Vega / Ryzen ™ 1-го поколения с графикой Radeon ™ Vega / Athlon ™ с графическими процессорами Radeon ™ Vega
Двухканальная небуферизованная память DDR4 с ECC / Non-ECC, 4 модуля DIMM
Fast 4 USB 3.1 Gen 2 с USB Type-C ™ и Type-A
Поддержка мульти-графики 2-Way CrossFire ™ / SLI ™ с двойной защитой и дизайном Ultra Durable ™
Разъем NVMe PCIe Gen3 x4 U.2
Сверхбыстрый PCIe Gen3 x4 M.2 с поддержкой режимов PCIe NVMe и SATA
Creative ^® Sound Blaster X-Fi MB5 поддержка
Dual ALC 1220 с передним и задним звуковым сигналом HD 120 дБ с соотношением сигнал / шум 120 дБ и двумя усилителями для смартфонов
Killer ™ E2500 Gaming Network + Intel ^® Gigabit LAN
USB DAC-UP 2 и 4 Передний USB 3.0 портов с регулируемым напряжением
RGB FUSION с многозонным светодиодным световым шоу дизайн
Сменная накладка для светодиода Accent
Smart Fan 5 с 9 датчиками температуры и 8 разъемами для гибридных вентиляторов
2 разъема для внешних термисторов с 2 включенными термисторами
GIGABYTE UEFI DualBIOS ™
APP Center, включающий утилиты EasyTune ™ и Cloud Station ™

* Технические характеристики и внешний вид продукта могут отличаться от страны к стране.Мы рекомендуем вам уточнить у местных дилеров технические характеристики и внешний вид продуктов, доступных в вашей стране. Цвета продуктов могут быть неточными из-за различий, вызванных фотографическими переменными и настройками монитора, поэтому они могут отличаться от изображений, представленных на этом сайте. Несмотря на то, что мы стремимся предоставить наиболее точную и полную информацию на момент публикации, мы оставляем за собой право вносить изменения без предварительного уведомления.

Эффективное использование «тупикового» сайта сплайсинга GA 5 ‘в генах рецептора фактора роста фибробластов человека

Реферат

Мы исследовали использование консервативного неканонического сайта сплайсинга GA 5′, присутствующего в рецепторе фактора роста фибробластов позвоночных (FGFR) гены.Несмотря на предыдущие исследования, предполагающие, что GA в начале интрона несовместима со сплайсингом, мы наблюдаем эффективное использование этого сайта сплайсинга для генных конструкций FGFR1 человека. Мы показываем, что использование сайта сплайсинга GA зависит как от обычного сайта сплайсинга на шесть нуклеотидов выше по течению, так и от элементов последовательности в нижнем интроне. Более того, наши результаты согласуются с конкуренцией между тандемными 5′-сайтами сплайсинга, опосредованными U6 snRNP, а не U1 snRNP.Таким образом, 5′-сайт сплайсинга GA представляет собой продолжение соседнего обычного 5′-сплайсингового сайта, первый естественный пример такого составного 5′-сайта сплайсинга.

Ключевые слова: альтернативный сплайсинг / рецептор фактора роста фибробластов / элемент интронной последовательности / неконсенсусный 5′-сайт сплайсинга

Введение

Эукариотические пре-мРНК содержат промежуточные последовательности (интроны), которые необходимо удалить (сплайсировать) для создания зрелая информационная РНК. Для этого процесса требуются три частично консервативные последовательности на субстрате: сайты сплайсинга 5 ‘и 3′, которые охватывают соединения экзон-интрон и интрон-экзон, и последовательность точки ветвления внутри самого интрона.Во время реакции сплайсинга эти элементы распознаются многокомпонентным комплексом, сплайсосомой (обзор Sharp, 1994; Staley and Guthrie, 1998), который отвечает за катализатор двух этапов, необходимых для удаления интрона и соединения фланкирующих экзонов. На этапе 1 2′-гидроксил аденозина в точке ветвления атакует фосфодиэфирную связь, соответствующую переходу экзон-интрон. Это генерирует свободный 5′-экзон и лариат интрон-3′-экзон, удерживаемые 2′-5′-фосфодиэфирной связью. Атака 3’-гидроксила вышележащего экзона на фосфодиэфирную связь на стыке интрон-экзон (стадия 2) приводит к присоединению экзона и высвобождению интронного лариата.

Центральными компонентами основной сплайсосомы являются небольшие ядерные рибонуклеопротеидные частицы (мяРНП), которые устанавливают РНК-РНК и белок-РНК контакты с пре-мРНК. Кроме того, большое количество белков, не относящихся к snRNP, также требуется во время реакции сплайсинга, облегчая распознавание сайтов сплайсинга, сборку сплайсосом и рециклинг компонентов snRNP после удаления интрона (Staley and Guthrie, 1998; Hastings and Krainer, 2001) . Первоначально считалось, что все интроны начинаются и заканчиваются инвариантными динуклеотидами: GT и AG соответственно.Открытие того, что небольшое количество интронов содержат динуклеотиды AT и AC, привело к характеристике вариантной сплайсосомы, в основе которой лежит отдельный набор snRNP, структурно и функционально сходных с таковыми в «классической» сплайсосоме (Tarn and Steitz , 1997). Удивительно, но каждая сплайсосома способна распознавать интроны как GT-AG, так и AT-AC, причем последовательности сайтов сплайсинга и точки ветвления диктуют, какой комплекс распознает какой интрон (Sharp and Burge, 1997).

Правильная экспрессия гена зависит не только от точного выбора фосфодиэфирных связей, подлежащих расщеплению (обзор Reed 1996, 2000), но также часто зависит от включения определенного подмножества экзонов.Такой альтернативный сплайсинг является обычным механизмом для генерации множества связанных, но структурно или функционально различных продуктов из одного гена (обзор Lopez, 1998; Black, 2000). Альтернативный сплайсинг жестко регулируется факторами, действующими на транс и , которые связываются со специфическими элементами на пре-мРНК, гарантируя, что желаемая изоформа белка экспрессируется на правильной стадии развития или в правильном месте. Примеры таких энхансеров и сайленсеров сплайсинга были обнаружены, часто в комбинации, как внутри интронов, так и во фланкирующих экзонах (обзоры на элементы управления сплайсингом см. Blencowe, 2000; Smith and Valcárcel, 2000).Одно важное семейство trans -действующих факторов, белки SR, функционируют как в конститутивном, так и в регулируемом сплайсинге (Graveley, 2000).

Рецепторы фактора роста фибробластов ( FGFR s) являются паралогическими членами семейства трансмембранных рецепторов тирозинкиназ, передача сигналов с помощью которых может индуцировать широкий спектр биологических процессов, включая индукцию мезодермы, митогенез, ангиогенез, хемотаксис и выживание нейронов (Mason, 1994 ; Маршалл, 1995). Хотя идентифицировано только четыре позвоночных FGFR s, охарактеризовано 22 различных фактора роста фибробластов (Ornitz and Itoh, 2001).Лигандная специфичность FGFR s контролируется альтернативным сплайсингом внеклеточных Ig-подобных доменов (обзор Johnson and Williams, 1993). Кроме того, для FGFR1 – FGFR3 (но не FGFR4 ) два конкурирующих 5′-сайта сплайсинга присутствуют на 3′-конце экзона 10 (Hou et al., 1991). Эти сайты сплайсинга направляют включение или исключение 6 нуклеотидов (нуклеотидов) (GTAACA), кодирующих валин и треонин (VT) (Рисунок A). Этот мотив VT необходим для взаимодействия рецептора с адаптерным белком передачи сигнала FRS2 (Burgar et al., 2002). Кроме того, эксперименты по временной трансфекции показали, что только изоформа VT + человеческого FGFR2 способна инициировать передачу сигналов через сигнальный путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) (Twigg et al., 1998). Таким образом, относительно незначительное изменение последовательности, кодируемой мРНК, оказывает сильное влияние на функцию полученного белка.

Рис. 1. Альтернативный сращивание соседней области FGFR . ( A ) Рисунок альтернативного события сплайсинга, показывающий два альтернативных кодона (для валина и треонина; GTA ACA) и два вида сгенерированной мРНК.( B ) Выравнивание последовательностей FGFR1 , FGFR2 и FGFR3 различных видов, которые, насколько известно, содержат тандемные 5′-сайты сплайсинга как часть консервативной последовательности из 18 нуклеотидов. Сплайсинговые соединения обозначены /, идеально консервативные последовательности выделены черным цветом, а консервация пурина или пиримидина заключена в рамку. Источники: регистрационный номер DDBJ / EMBL / GenBank; † идентифицированы с помощью поиска по геному BLAST; * то же самое, но подтверждено клонирование и секвенирование; # эта работа; ‡ Гиллеспи и др.(1995).

Секвенирование этой области показало, что расположенный ниже (проксимальный) 5′-сайт сплайсинга отличается от консенсуса 5′-сайта сплайсинга, имея A в положении +2 (/ GAAAGT) (Gillespie et al., 1995). В отличие от 5′-сайтов сплайсинга GC и AT, присутствующих в 0,5–1% (Thanaraj and Clark, 2001) и 0,05% (Burset et al., 2000) интронов, соответственно, 5′-сайты сплайсинга GA (и GG) ранее были показано как нефункциональное. На сегодняшний день в базе данных мутаций генов человека (Krawczak and Cooper, 1997) зарегистрировано 43 патологических мутации GT → GA, а эксперименты по сплайсингу in vitro и с модельными субстратами показали, что сайты сплайсинга 5 ‘GA блокируют сплайсинг после этапа 1 ( Aebi et al., 1986, 1987). Последовательность сайта сплайсинга FGFR GA теперь подтверждена у ряда видов (см. Ниже), что отрицает возможность того, что это тривиальная ошибка секвенирования. Кроме того, если известна полная последовательность интрона, можно показать, что дополнительные 6 нуклеотидов, присутствующие в мРНК VT +, не генерируются отдельным микроэкзоном.

Помимо идентификации изоформ VT + и VT–, было проведено мало количественного анализа. Развитие психической регуляции гена Xenopus laevis FGFR1 наблюдали во время эмбриогенеза, при этом продукция формы VT + преобладала на многих ранних стадиях развития бластулы (Gillespie et al., 1995; Патерно и др., 2000). Аналогичным образом, анализ клонов кДНК для гена FGFR1 крысы предполагает, что экспрессия формы VT + преобладает в нескольких тканях (сердце, легкие, печень, кишечник и почки) с более равной экспрессией двух форм, наблюдаемых в мозге (Yazaki и др., 1993). Эти результаты предполагают, что не только активен 5′-сайт сплайсинга FGFR GA, но в некоторых ситуациях он может быть доминантным из двух 5′-сайтов сплайсинга.

В работе, представленной здесь, мы провели эксперименты, чтобы ответить на вопрос, почему гены FGFR могут использовать предположительно «тупиковый» 5′-сайт сплайсинга.Наши результаты расширяют предыдущие исследования сплайсинга дрожжей и млекопитающих, которые предположили, что мяРНК U6 может определять расположение 5′-сплайсингового соединения в мутационно ослабленных сайтах сплайсинга (Kandels-Lewis and Séraphin, 1993) или когда была модифицирована сама мяРНК U6 (Hwang и Коэн, 1996). В частности, мы демонстрируем, что эндогенный U6 snRNP может диктовать расположение 5′-сплайсингового соединения в контексте встречающихся в природе конкурирующих 5′-сплайсинговых сайтов.

Результаты

Чтобы подтвердить универсальность сайта сплайсинга FGFR GA, мы выполнили поиск в GenBank последовательностей FGFR от различных видов.Поразительно, что почти для всех этих генов сайты сплайсинга присутствуют в хорошо консервативной последовательности GNCAG / GT ^A/_C ACA / GAAAGTA (рисунок B) (Twigg et al., 1998), причем большинство последовательностей, по-видимому, в соответствии с GACAG / GTAACA / GAAAGTA). Кроме того, для данного гена FGFR гомология сайтов сплайсинга распространяется дальше в интрон; для генов млекопитающих, например, консервация распространяется на положения +28, +25 и +24 (для FGFR1 , FGFR2 и FGFR3 соответственно).Анализ записей кДНК GenBank для генов млекопитающих показывает, что кДНК FGFR1 должны быть сплайсированы главным образом GA (VT +) и мРНК FGFR3 должны быть сплайсированы всеми GT, но две изоформы FGFR2 немного более однородны (таблица).

Таблица I.

Расщепление изоформ кДНК FGFR , представленных в GenBank ^a

Всего человек FGFR1 2 90 189 2/2

Ген	Изоформа	Мышь	Крыса
VT +	7/7	1/2	16/16	24/25
	VT–	0/7	1/2	0/16	0/16 1/25
FGFR2	VT +	3/3	1/2	6/8	10/13
	VT–	0/3 1	2/8	3/13
FGFR3	VT +	0/4	0/1	0/2	0/7
	9018	4/4	1/1	7/7

Создание модели FGFR GA-сплайсинговых минигенов

Для исследования использования сайта сплайсинга FGFR GA мы сконструировали минигены на основе человеческих FGFR1 , FGFR2 , FGFR2 FGFR3 (Рисунок A).В то время как были использованы полные последовательности из FGFR1 и FGFR3 (с размерами интронов ∼1,1 т.п.н. и ∼300 п.н., соответственно), размер интрона FGFR2 (11 189 п.н.) потребовал создания укороченный миниген, содержащий всего 150 нуклеотидов с каждого конца интрона. Кроме того, FGFR3 отличается от двух других генов FGFR тем, что наличие двух 3′-сайтов сплайсинга (AAG \ CAG \) позволяет продуцировать формы Q + (CAG +) и Q– (Twigg et al., 1998). Следовательно, для упрощения анализа продуктов сплайсинга, генерируемых минигеном FGFR3 , минорный 3′-сайт сплайсинга выше по течению был инактивирован мутацией (AAG → TTC). Эта мутация не влияет на относительное использование двух 5′-сайтов сплайсинга (данные не показаны). Экспрессия этих конструкций в временно трансфицированных клетках 293T выявляется с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Относительное использование двух 5′-сайтов сплайсинга определяют путем разрезания кДНК с обеих сторон стыка сплайсинга, мечения конца с помощью ³² P и разделения продуктов на нативных полиакриламидных гелях.Количественный характер этого анализа был подтвержден амплификацией различных соотношений контрольных кДНК FGFR и сравнением с результатами анализов защиты от РНКазы (типичный эксперимент показан на рисунке D).

Рис. 2. Альтернативный сплайсинг человеческих минигенов FGFR1 , FGFR2 и FGFR3 в клетках 293T. ( A ) Схема базовой конструкции, используемой для временной трансфекции клеток 293T, демонстрирующая последовательности вокруг 5′- и 3′-сайтов сплайсинга.Динуклеотиды сайта сплайсинга подчеркнуты, 5′- и 3′-сплайсинговые соединения обозначены / и \, соответственно, а промотор цитомегаловируса обозначен CMV. Последовательность FGFR3 показывает немутантный восходящий 3′-сайт сплайсинга (подробности см. В тексте). Также показаны схемы кДНК VT + и VT–; стрелки обозначают положения сайтов рестрикции Apa LI (A) и Hin fI (H) (серая стрелка обозначает второй сайт Hin fI в экзоне 11 FGFR1 ), а горизонтальные стрелки указывают положения праймеров ОТ – ПЦР.( B ) Расщепление фрагментов ОТ-ПЦР для FGFR1 , FGFR2 и FGFR3 . Расщепление контрольной кДНК VT + и VT– показано для FGFR1 (дорожки 1 и 2) и FGFR3 (дорожки 5 и 6). Фрагмент FGFR1 , помеченный как ex 11, представляет собой фрагмент Hin fI из экзона 11, а звездочка указывает гетеродуплекс двух кДНК, которые образуются во время ПЦР (данные не показаны). Гели были обрезаны, чтобы исключить фланкирующие фрагменты, образованные в результате двойного переваривания.( C ) Количественное определение относительных частот сплайсинга GT (обозначено T) и GA (обозначено A) для минигенов (среднее и стандартное отклонения четырех независимых экспериментов). ( D ) Сравнение количественного определения с помощью ОТ-ПЦР (P) и РНКазной защиты (R) типичной трансфекции минигена FGFR1 и различных соотношений VT +: VT– конструкций экспрессии кДНК.

На фиг. B показан анализ кДНК трех временно экспрессируемых минигенов; количественное определение показано на рисунке С.Использование сайта сплайсинга GA 5 ‘(относительно расположенного выше сайта) значительно различается между конструкциями: чуть более 70% для FGFR1 (дорожка 3), ∼45% для FGFR2 (дорожка 4) и только ∼12% для FGFR3 (дорожка 7). Таким образом, несмотря на сохранение последовательности, уровень сплайсинга GA для трех генов в нашей модельной системе различается. Основываясь на этих результатах, мы решили изучить минигены FGFR1 и FGFR3 , поскольку они показывают наибольшую разницу в использовании сайта сплайсинга GA.

Вклад экзонных и интронных последовательностей в частоту сплайсинга GA

В качестве первого шага к пониманию механизма сплайсинга GA мы попытались определить местонахождение элементов, ответственных за контроль относительного использования тандемных 5′-сайтов сплайсинга. Гибриды были сделаны между минигенами FGFR1 и FGFR3 , собрав интрон и связанные экзоны во всех возможных комбинациях. Анализ четырех из этих минигенов (названия которых отражают происхождение вышележащего экзона, интрона и нижележащего экзона) показан на рисунке А.Замена одного или обоих экзонов FGFR1 соответствующими экзонами из FGFR3 не влияет на частоту сплайсинга ГА [конструкции 3-1-1 (дорожка 3), 1-1-3 (дорожка 4) и 3- 1-3 (дорожка 5)]. Точно так же небольшой эффект наблюдается, когда экзоны FGFR3 заменяются их аналогами FGFR1 [конструкция 1-3-3 (дорожка 6) и конструкции 3-3-1 и 1-3-1 (данные не показаны). ]. Таким образом, главный элемент (ы), ответственный за контроль относительного использования сайта сплайсинга GA, должен находиться внутри интронов.

Рис. 3. Альтернативный сплайсинг гибридных конструкций. ( A ) Альтернативный сплайсинг выбранных гибридных конструкций, содержащих последовательности из FGFR1 (серый) и FGFR3 (черный). Их названия отражают происхождение вышележащего экзона, интрона и нижележащего экзона (таким образом, FGFR1 – 1-1-1). Чтобы обеспечить выравнивание различных продуктов (те, которые содержат восходящий экзон от FGFR3 , на 3 н. Меньше, чем те, которые имеют соответствующий экзон от FGFR1 ), дорожки одного геля были разделены (только дорожки 3–6).Частота сплайсинга GA (и стандартное отклонение для четырех повторов) приведена под каждой полосой. ( B ) Альтернативный сплайсинг гибридов с замещением экзона FGFR1 . Цифры в скобках обозначают размеры изделий, соединенных с помощью GT и GA. Используемые сайты ограничения: H, Hin fI; Ap, Apa LI; Ac, Acc I. И снова показанные дорожки представляют собой одиночный гель.

Хотя фланкирующие экзоны FGFR1 и FGFR3 кажутся нейтральными с точки зрения определения уровня сплайсинга GA, они обладают значительной гомологией последовательностей.Таким образом, возможно, что присутствуют элементы, управляющие сращиванием ГА. Чтобы исследовать это, мы заменили экзонов FGFR1 экзонами 1 и 2 из человеческого β-глобина: минигены β-1-1, 1-1-β и β-1-β (Рисунок B). Все три конструкции дают по крайней мере столько же продукта GA, сколько конструкция FGFR1 дикого типа. Таким образом, сплайсинг генов FGFR с помощью GA контролируется в первую очередь последовательностями, расположенными внутри интронов.

Идентификация интронных регуляторных элементов

Установив важность интрона в контроле уровня сплайсинга GA, мы предприняли попытку определить местоположения активных последовательностей, присутствующих в интроне FGFR1 .Делеция центральной ∼800 п.н. интрона, уменьшающая его длину до ∼310 п.н., мало влияла на частоту сплайсинга ГА (данные не представлены). Таким образом, элементы интрона должны присутствовать в первых 160 и / или последних 150 нуклеотидах интрона. Чтобы более точно определить расположение этих предполагаемых 5′- и 3′-интронных энхансеров сплайсинга (ISE), мы создали гибриды между интронами FGFR1 и человеческим β-глобином (Рисунок A). Для первого из этих гибридов (конструкция 1-13β-1) все, кроме первых 13 нуклеотидов интрона FGFR1 (до конца консервативной 18-нуклеотидной последовательности), были заменены интроном глобина (из положения 14).Эта конструкция дала только след мРНК, сплайсированной с помощью GA (~ 3%) (рис. A, дорожка 1). Удлинение присутствующей последовательности FGFR1 на 8 нуклеотидов (конструкция 1-21β-1, дорожка 2) практически не влияет на уровень сплайсинга GA. Напротив, присутствие 24 нуклеотидов (конструкция 1-24β-1, дорожка 3) и 28 нуклеотидов (конструкция 1-28β-1, дорожка 4) FGFR1 позволяет последовательно проводить большее количество сплайсинга GA (14 и 33% соответственно) . Однако дополнительное увеличение протяженности 5′-интронной последовательности FGFR1 (до 54, 105 или 160 нуклеотидов) не оказывает значительного влияния на степень сплайсинга GA (дорожки 5-7).Таким образом, энхансер сплайсинга должен присутствовать в первых 28 нуклеотидах интрона FGFR1 .

Рис. 4. Определение энхансеров сплайсинга интронов FGFR1 . ( A ) На схеме показано построение гибридного интрона. Интрон FGFR1 был заменен первым интроном β-глобина (из положения +14), и увеличивающаяся длина последовательности от 5′-конца интрона FGFR1 была включена между 5′-экзоном и интроном глобина (дорожки 1–7).Аналогичным образом, 150, 100, 50 и 25 нуклеотидов последовательности с 3′-конца интрона FGFR1 использовали для замены 3 нуклеотидов 3′-сайта сплайсинга глобина в присутствии различных количеств 5′-интрона FGFR1 . последовательность (дорожки 8–13). Конструкции названы по количеству интронной последовательности FGFR1 , присутствующей перед и после остатков интрона глобина (например, 1-54β100-1 имеет 54 нуклеотида 5′-последовательности и 100 нуклеотидов 3′-последовательности). ( B ) Последовательность области сайта сплайсинга FGFR1 и 5′-ISE, демонстрирующая внесенные изменения.( C ) Сплайсинг 5′-мутантов ISE в отсутствие (дорожки 1–5) и в присутствии (дорожки 6–10) 3 ‘ISE.

Частичный эффект 5′-последовательности FGFR1 подразумевает присутствие дополнительного ISE в последних 150 нуклеотидах интрона. Чтобы идентифицировать расположение этого 3′-ISE, мы заменили последние 3 нуклеотида интрона β-глобина (TAG1) последовательностями с 3′-конца интрона FGFR1 . Первоначально мы заменили 3′-сайт сплайсинга глобина последними 150 нуклеотидами интрона FGFR1 в комбинации с 13 нуклеотидами 5′-последовательности, получив конструкцию 1-13β150-1.Присутствие этой дополнительной интронной последовательности FGFR1 практически не влияло на уровень сплайсинга GA (рис. A, дорожка 8). Однако в сочетании с 54 нуклеотидами 5′-последовательности (конструкция 1-54β150–1, дорожка 9) 150 нуклеотидов 3′-интронной последовательности способствовали очень эффективному использованию сайта сплайсинга GA (более 60%). Ограничение 3′-интронной последовательности до 100 нуклеотидов (конструкция 1-54β100-1, дорожка 10) или 50 нуклеотидов (конструкция 1-54β50-1, дорожка 11) не снижает уровень сплайсинга GA. Однако степень сплайсинга GA была немного снижена, когда было включено 25 нуклеотидов 3′-интронной последовательности (конструкция 1-54β25-1, дорожка 12).Таким образом, 3 ‘ISE находится в последних 50 нуклеотидах интрона. Поразительно, что комбинация минимальных 5′- и 3’-последовательностей (конструкция 1-28β50-1, дорожка 13) приводит к уровню сплайсинга GA, идентичному уровню гена FGFR дикого типа.

Рассечение 5 ‘ISE

Чтобы лучше понять, как функционирует 5′ ISE, мы ввели базовые изменения в различных положениях (подробно показаны на рисунке B) и протестировали их эффекты в отсутствие и в присутствии 3 ‘ISE ( Рисунок C).Наиболее яркой особенностью FGFR1 5 ‘ISE является тракт G ₅, начинающийся в положении +17 и присутствующий во всех интронах FGFR1 , секвенированных на данный момент (Рисунок B). Мутация этой последовательности на C ₅ или A ₅ снижала уровень сплайсинга GA как для 1-28β-1 (дорожки 2 и 3), так и для 1-28β100-1 (дорожки 7 и 8) до 10% или менее. . Таким образом, эта консервативная последовательность жизненно важна для функционирования 5′-ISE. Однако эта последовательность сама по себе не активна как энхансер; последовательность FGFR1 , присутствующая в конструкции 1-21β-1, оканчивается на конце тракта G ₅ и не активирует сайт сплайсинга GA (фигура A, дорожка 2).Также важно отметить, что 5′-элемент не действует как классический усилитель сплайсинга; отделение его от области сайта тандемного сплайсинга даже на 6 нуклеотидов устраняет всю активность (данные не показаны).

Эксперименты с гибридами на основе FGFR3 (аналогично тем, что на рисунке А) выявили присутствие единственного ISE в интроне FGFR3 (данные не показаны). Этот энхансер, также расположенный в первых 28 нуклеотидах интрона, слабее, чем его аналог FGFR1 .Внесение восьми изменений оснований в 5′-энхансер FGFR1 5 ‘в 1-28β-1 для воссоздания энхансера FGFR3 (мутация R3; рис. C, дорожка 5) снижает уровень сплайсинга GA до 18%, лишь немного выше минигена FGFR3 . Поразительно, однако, что мы не видим увеличения уровня сплайсинга GA, когда мутация R3 комбинируется с FGFR1 3 ‘ISE (дорожка 10), что позволяет предположить, что FGFR1 3′ ISE адаптирован для взаимодействия с конкретными последовательностями присутствует в 5′-энхансере FGFR1 5 ‘.

Присутствие энхансеров рядом с тандемными 5′-сайтами сплайсинга как FGFR1 , так и FGFR3 предполагает, что такие элементы могут быть общей чертой генов FGFR . Чтобы исследовать это, мы ввели семь базовых изменений, чтобы воссоздать предполагаемый FGFR2 5 ‘ISE. Мутация R2 приводит к ~ 25% сплайсингу GA в отсутствие 3 ‘ISE FGFR1 (дорожка 4), примерно вдвое меньше, чем наблюдается для минигена FGFR2 (Рисунок B). Как и в случае с FGFR3 ISE, присутствие FGFR1 3 ‘ISE не привело к значительному увеличению уровня сплайсинга GA, наблюдаемого для мутации R2 (32%, дорожка 9).

Мутация консервативной области сайта сплайсинга

Чтобы лучше понять последовательности, необходимые для сплайсинга GA, мы ввели точечные мутации в различные положения через консервативную область сайта сплайсинга из 18 нуклеотидов. Трансверсия каждого из первых четырех положений (от –5 до –2) очень мало влияла на относительное использование двух 5′-сайтов сплайсинга (рис. A, дорожки 2–5). Действительно, мутация –4A → T напоминает ген X.laevis FGFR2 , который также отличается от консенсуса из 18 нуклеотидов в этом положении (5′-GCCAG-3 ‘) (Рисунок B).Однако удивительно, что мутация пятого консервативного нуклеотида (-1) активирует скрытый сайт сплайсинга GT 5 ‘на конце консервативной последовательности (+11), при этом использование этого сайта составляет ~ 50% продуцируемой мРНК (рис. А, дорожка 6).

Рис. 5. Мутагенез области сайта сплайсинга FGFR1 5 ‘. ( A ) Влияние трансверсии первых пяти оснований консервативной последовательности на использование двух сайтов сплайсинга. Позиции изменений оснований показаны (слева) и пронумерованы относительно первого основания интрона.Полоса, соответствующая использованию загадочного 5′-сайта сплайсинга на +11 (дорожка 6), мигрирует вместе с гетеродуплексом. ( B ) Обнаружение ОТ-ПЦР экспрессии конструкций на основе FGFR1 временно трансфицированными клетками 293T. Дорожка 1 показывает лестницу 100 п.н. ( C ) Альтернативный сплайсинг конструкций, показанных на (B) (дорожки 1–5), и спейсинговых конструкций (дорожки 6–8). Обратите внимание, что% GA обозначает частоту использования проксимального сайта сплайсинга (GA, GU, GC или GG, в зависимости от дорожки).

Одноточечные мутации были введены для изменения второго основания каждого 5′-сайта сплайсинга (положения +2 и +8). Мутация + 2A изменяет вышестоящий сайт сплайсинга с GT на GA и устраняет накопление правильно сплайсированной мРНК (рисунок B, дорожка 4). Тот факт, что эта мутация, по-видимому, блокирует оба сайта сплайсинга, предполагает, что использование нижележащего сайта сплайсинга GA зависит от распознавания вышележащего сайта сплайсинга GT, хотя нельзя исключать эффекты более поздней экспрессии гена. Все мутации +8 (преобразование сайта сплайсинга GA в GT, GC и GG) позволяли накапливать мРНК (дорожки 5-7), но с измененными профилями сплайсинга.Обе мутации + 8T и + 8C (рис. C, дорожки 2 и 3) резко увеличивают использование расположенного выше сайта сплайсинга (с ~ 26% с минигеном дикого типа до> 70% для мутантов). Предыдущие исследования показали, что сайты сплайсинга GG 5 ‘(подобные GA) блокируются после стадии 1 (Aebi et al., 1987). Мутация + 8G (дорожка 4) приводит к примерно равному использованию двух 5′-сайтов сплайсинга, демонстрируя, что конкретный контекст тандемных 5’-сайтов сплайсинга в гене FGFR1 допускает сплайсинг обоих «тупиковых» 5′-сайтов. сайты сращивания.Наконец, комбинация мутаций + 2A и + 8T (рисунок C, дорожка 5) приводит к сплайсингу только из нижележащего (теперь GT) сайта сплайсинга, возможно, предполагая, что сайт сплайсинга GA должен лежать ниже сайта сплайсинга GT для распознавания.

На рисунке C также показан эффект увеличения расстояния между двумя точками соединения. Сплайсинга GA не наблюдается, когда расстояние между сайтами сплайсинга GT и GA увеличивается на 3 н. (Конструкция SP + 3, дорожка 6). Это не может быть результатом нонсенс-опосредованного распада или изменений последовательности сайта сплайсинга, поскольку увеличенный интервал был достигнут за счет дублирования положений +4 – +6, сохраняя как рамку считывания, так и последовательность сайта сплайсинга GA.Идентичный эффект наблюдается, когда увеличение интервала вводится в мутацию + 8G (дорожка 8). Однако введение спейсера из 3 нуклеотидов в контексте мутации + 8T приводит к умеренному увеличению сплайсинга от нижележащего сайта сплайсинга (сравните дорожку 7 с дорожкой 2).

Использование двух близко расположенных 5′-сайтов сплайсинга сильно зависит от стерических затруднений: U1 snRNP, связанный с одним сайтом, будет препятствовать связыванию факторов с другим (Cunningham et al., 1991). Таким образом, можно ожидать, что увеличение расстояния между двумя сайтами сплайсинга FGFR 5 ‘на 3 нуклеотида лишь незначительно увеличит использование минорного 5’-сайта сплайсинга.Однако такой скромный эффект наблюдается только для мутанта + 8T. Наблюдение за тем, что использование сайтов GA и GG предотвращается увеличением интервала, предполагает, что выбор сайтов сплайсинга различен для этих «тупиковых» сайтов. В самом деле, конкуренция за связывание U1 может не быть фактором при выборе тандемных сайтов сплайсинга FGFR 5 ‘, то есть U1 snRNP может связываться только с расположенным выше сайтом сплайсинга GT.

Роль U6 в выборе 5′-сайта сплайсинга FGFR

Перед первой каталитической стадией сплайсинга 5′-сайт сплайсинга последовательно распознается мяРНП U1 и U6 (Staley and Guthrie, 1998).Таким образом, консенсусная последовательность 5′-сайта сплайсинга способна к спариванию оснований как с мяРНК U1, так и, более ограниченно, с мяРНК U6. Для 5′-сайтов сплайсинга FGFR сайт сплайсинга GT, расположенный выше по течению, имеет наибольший потенциал для образования пары оснований с мяРНК U1, в то время как потенциал для спаривания оснований с мяРНК U6 выше в нижележащем сайте сплайсинга GA (рис. A). Два результата, показанные на фигуре, предполагают, что конкуренция за связывание U1 snRNP не участвует в определении относительного использования этих тандемных 5′-сайтов сплайсинга.Во-первых, повышение потенциала сайта сплайсинга GA для образования пары оснований с помощью мяРНК U1 (mt + 8A → T) фактически снижает использование этого сайта сплайсинга. Во-вторых, увеличение расстояния между сайтами сплайсинга отменяет использование сайта сплайсинга GA 5 ‘. Если сайт сплайсинга GA не взаимодействует с snRNP U1, возможно, что связывание snRNP U6 контролирует альтернативное использование двух сайтов сплайсинга FGFR 5 ‘. Чтобы исследовать это, мы ввели мутации в сайты связывания U6 в каждом сайте сплайсинга (рисунок B).Увеличение потенциала спаривания оснований сайта сплайсинга GT путем изменения положений +5 (C → G) и +6 (A → T), либо по отдельности (дорожки 2 и 3), либо в комбинации (дорожка 4), отменяет сплайсинг GA. Влияние этих изменений оснований на силу сайта сплайсинга GA, вероятно, будет минимальным, поскольку CA и GT представляют плохие концевые последовательности экзона. Уменьшение совпадения сайта GA с консенсусом сайта сплайсинга путем изменения положений +11 (G → C) и +12 (T → A), отдельно (дорожки 5 и 6) или в комбинации (дорожка 7), также отменяет сплайсинг GA. .Таким образом, эффективное использование сайта сплайсинга GA зависит как от его собственного соответствия консенсусу сайта сплайсинга, так и от наличия субоптимального сайта сплайсинга GT выше по течению.

Рис. 6. Роль U6 в сплайсинге ГА. ( A ) Прогнозируемое спаривание оснований мяРНК U1 (вверху) и U6 (внизу) с сайтами сплайсинга GT и GA. Звездочка обозначает взаимодействие, которое было идентифицировано биохимически, но не генетически (Sontheimer and Steitz, 1993). ( B ) Мутация ключевых положений в каждом 5′-участке сплайсинга.( C ) Возможное спаривание оснований сайтов сплайсинга GT и GA с использованными модифицированными мяРНК U6. ( D ) Альтернативный сплайсинг конструкции FGFR1 wt в присутствии экспрессионных конструкций U6 дикого типа (дорожка 1), GT (дорожка 2) и GA (дорожка 3). ( E ) Альтернативный сплайсинг конструкции FGFR3 wt в присутствии трех экспрессионных конструкций U6. ( F ) Альтернативный сплайсинг различных 1-13β-1 (дорожки 1 и 2) и 1-13β150-1 (дорожки 3 и 4) в присутствии дикого типа (дорожки 1 и 3) и GA (дорожки 2 и 4) конструкции экспрессии U6.

Мутации, которые мы здесь ввели, также влияют на способность сайтов сплайсинга взаимодействовать со связыванием U1 snRNP. Однако специфическое мутирование позиций +5 и +6 в AG (так что сайт сплайсинга GA теперь представляет собой 5′-AAG / GAAAGTA-3 ‘) фактически увеличивает использование сайта сплайсинга GT (до ~ 30%) (Рисунок B, полоса 8), что снова указывает на то, что мяРНК U1 не образует пары оснований с сайтом сплайсинга GA. Чтобы получить прямые доказательства того, что U6 является фактором, ответственным за контроль альтернативного сплайсинга, мы котрансфицировали наши минигены плазмидами, экспрессирующими так называемые «сдвиговые» мяРНК.Эти сдвигающие мяРНК идентичны своим эндогенным аналогам, за исключением изменений в областях, которые соединяют основания с пре-мРНК. Предыдущие сообщения показали, что можно избежать использования мутационно ослабленных 5’-сайтов сплайсинга путем котрансфекции плазмид, экспрессирующих U1 snRNA, с модифицированными последовательностями узнавания (Zhuang and Weiner, 1986; Cohen et al. ., 1994). Более того, в присутствии данного сдвига U1 конкуренция между разными потенциальными (/ GT) сайтами сплайсинга может контролироваться присутствием сдвига U6 snRNAs (Hwang and Cohen, 1996).

Первоначально мы использовали две конструкции экспрессии мяРНК U1, U1 GT и U1 GA , которые содержат мутации в области, которая спаривается с 5′-сайтом сплайсинга (положения 3-11, дикий тип: 5′- ACUUACCUG-3 ‘), чтобы обеспечить 9 п.н. на сайтах сплайсинга GT или GA. Ни одна из конструкций не способна изменить альтернативный сплайсинг минигенов FGFR1 или FGFR3 , несмотря на экспрессию мяРНК на сходных уровнях (данные не показаны). Поэтому мы создали две сдвигающие мяРНК U6 (снова обозначенные GT и GA ) с изменениями в положениях 41–46, которые увеличивают их потенциал для образования пары оснований с сайтами сплайсинга GT и GA (Рисунок C).Мы котрансфицировали экспрессирующие конструкции для этих snRNA с минигеном FGFR1 дикого типа (фигура D), используя конструкцию экспрессии U6 snRNA дикого типа в качестве контроля. Никакого эффекта не наблюдается с конструкциями дикого типа (дорожка 1) и U6 GA (дорожка 3), тогда как конструкция U6 GT (дорожка 2) снижает количество мРНК, сплайсированной с помощью GA. Анализы защиты от РНКазы подтверждают накопление аналогичных уровней мяРНК из каждой из этих конструкций (данные не показаны). С минигеном FGFR3 (рисунок E) обе конструкции U6 активны: U6 GT (дорожка 2) индуцирует небольшое уменьшение количества мРНК, сплайсированной GA, тогда как U6 GA (дорожка 3) удваивает количество GA. сращивание.Никакого эффекта конструкции U6 GA не наблюдается с конструкциями 1-13β-1 и 1-13β150-1 (фигура F). Умеренное увеличение уровня сплайсинга GA наблюдалось для конструкций 1-24β-1 и 1-28β-1 в присутствии U6 GA (данные не показаны), что позволяет предположить, что способность мяРНК U6 GA влиять на сращивание зависит от наличия 5 ‘ISE.

Обсуждение

Мы исследовали использование нового сайта сплайсинга GA 5 ‘, присутствующего в трех из четырех генов FGFR человека, а также в генах FGFR различных видов позвоночных.Частота сплайсинга GA различается для минигенов, происходящих от трех генов FGFR человека, и они хорошо отражают частоту, с которой сообщалось о двух видах мРНК для трех генов млекопитающих (таблица). Эти результаты предполагают, что соотношения сплайсинга GT: GA трех человеческих генов FGFR могут быть статичными во многих тканях, возможно, тонко настраивая функционирование каждого рецептора для его данной роли. Однако регуляция развития гена X.laevis FGFR1 (Paterno et al., 2000) и тканеспецифическая регуляция гена FGFR1 крысы (Yazaki et al., 1993) предполагают, что сплайсинг генов FGFR человека с помощью GT / GA может быть аналогичным динамичным.

Важно отметить, что наши результаты исключают возможность того, что редактирование РНК перед сплайсингом изменяет сайт сплайсинга GA на GT (или GC), аналогично созданию 3′-сайта сплайсинга путем редактирования A → I транскрипта крысы ADAR2 (Rueter et al., 1999). Если бы это было так, частота использования сайта сплайсинга зависела бы, по крайней мере частично, от частоты, с которой происходила маловероятная трансверсия A → T (или C).Такой сценарий исключается из-за мутации + 8A → T (Рисунок C). Это изменение просто устраняет необходимость в событии редактирования и не должно приводить к резкому снижению, которое мы наблюдаем в использовании расположенного ниже по течению (теперь GT) 5 ‘сайта сплайсинга.

Модель для использования сайтов сплайсинга FGFR GA

Мутация сайта сплайсинга GT 5 ‘в положениях +1 и +2 может блокировать сплайсинг после стадии 1 для одиночных интронных субстратов (Aebi et al., 1986). Однако в контексте множественных интронов эти мутации дают разные результаты: мутация a + 1G → A вызывает пропуск связанного экзона, а мутация + 2T → A (генерирующая сайт сплайсинга GA) приводит к накоплению промежуточного звена лариат-экзон. как in vitro , так и in vivo (Aebi et al., 1987). Это предполагает, что мутации +2 менее вредны, чем мутации +1, для начального распознавания сайта сплайсинга с помощью U1 snRNP. Кроме того, для сплайсосомы млекопитающих U6 A45 (5′-ACAGAG-3 ‘) может быть перекрестно связан со вторым нуклеотидом интрона после первой стадии сплайсинга (Sontheimer and Steitz, 1993), и это взаимодействие может быть частью предполагаемая проверка 5’-сайта сплайсинга до завершения реакции сплайсинга (Burgess et al., 1990; Fabrizio and Abelson, 1990; Burgess and Guthrie, 1993; Luukkonen and Séraphin, 1998).

Уменьшение, которое мы наблюдаем при использовании расположенного ниже 5′-сайта сплайсинга после мутации + 8A → T, свидетельствует против роли U1 в распознавании сайта сплайсинга GA, поскольку это изменение фактически увеличивает потенциал для спаривания оснований с мяРНК U1. . Точно так же увеличение расстояния между немутантными сайтами сплайсинга должно частично снимать стерические препятствия, возникающие в результате связывания U1 snRNP с обоими сайтами, а не отменять все использование нижележащих сайтов сплайсинга. Поэтому мы предполагаем, что сайт сплайсинга FGFR GA представляет собой расширение обычного сайта сплайсинга GT, расположенного непосредственно выше по течению.Для обычного 5′-сайта сплайсинга роль U1 заключается просто в том, чтобы обозначить приблизительное местоположение границы экзон-интрон, в то время как фактическое соединение сплайсинга определяется спариванием оснований как U5 (Newman and Norman, 1991, 1992), так и U6 (Kandels-Lewis and Séraphin, 1993; Lesser and Guthrie, 1993) с пре-мРНК. Как уже упоминалось, 5′-сайт сплайсинга FGFR GA представляет лучший сайт связывания U6, чем сайт сплайсинга GT (рис. B). Таким образом, расположенный выше сайт сплайсинга GT содержит единственный сайт связывания U1 на конце экзона и предположительно используется для определения экзона (Berget, 1995).Когда U6 входит в сплайсосому, он может ассоциироваться либо с плохими последовательностями, связанными с сайтом сплайсинга GT, близким к сайту взаимодействия U1, либо с более благоприятными последовательностями ниже по течению на сайте сплайсинга GA.

На рисунке A показано сравнение этой модели [конкуренция за связывание U6 snRNP (путь C по сравнению с путем E)] с традиционным взглядом на выбор 5′-сайта сплайсинга [конкуренция за связывание U1 snRNP (путь A по сравнению с путем B )]. Доказательства в поддержку этой модели предоставлены экспериментами, представленными на рисунке, где модифицированная мяРНК U6 может увеличить использование сайта сплайсинга GA.Важно отметить, что этот эффект не является внутренней способностью мяРНК U6 GA , поскольку требовалась 5′-ISE; более того, мы предполагаем, что именно энхансеры позволяют функционировать нашим экстенсивно модифицированным shift U6 snRNAs (Figure C). Наша модель согласуется с предыдущей работой, демонстрирующей, что расположение 5′-сплайс-перехода может контролироваться с помощью U6 snRNP. Для сайтов сплайсинга у млекопитающих такие эффекты наблюдались только с мутационно ослабленными сайтами сплайсинга в присутствии специфически модифицированных shift U1 и U6 snRNAs (Hwang and Cohen, 1996).У дрожжей аберрантное расщепление на 3–4 нуклеотида выше 5 ‘сайта сплайсинга интрона RP51A, наблюдаемое, когда сайт сплайсинга мутационно ослаблено, усиливается, когда криптический сайт сплайсинга мутируется на GA или GG (Séraphin and Rosbash, 1990). Поразительно, что этот скрытый сплайсинг является результатом неправильного выравнивания U6 с пре-мРНК, поскольку улучшение спаривания оснований мяРНК U6 с подлинным сайтом сплайсинга восстанавливает его использование (Kandels-Lewis and Séraphin, 1993). Однако наши результаты представляют собой первое описание выбора альтернативного сайта сплайсинга, опосредованного связыванием эндогенного U6 snRNP с естественными сайтами сплайсинга.

Рис. 7. Модель использования сайта сплайсинга FGFR GA человека. ( A ) Сравнение моделей выбора места стыковки. Для обычных 5′-сайтов сплайсинга конкуренция зависит от местоположения связывания U1 snRNP (т.е. путь A конкурирует с путем B) с последующей заменой U1 на U6 (пути C или D). Для сайтов сплайсинга FGFR только расположенный выше сайт сплайсинга GT представляет сайт связывания U1. Таким образом, первоначальное определение области сайта сплайсинга происходит только через путь A; Конкуренция между сайтами сплайсинга представляет собой конкуренцию за связывание U6 (т.е.е. путь C конкурирует с путем E). ( B ) Модель, иллюстрирующая функциональную взаимозависимость двух ISE FGFR1 .

Последовательности, необходимые для сплайсинга GA FGFR1

Использование сайтов сплайсинга FGFR GA контролируется последовательностями, присутствующими в интронах. Для FGFR1 мы картировали 5′-элемент на 15 нуклеотида непосредственно ниже сайта сплайсинга GA. Хотя мы называем этот элемент энхансером сплайсинга 5′-интрона, мы отмечаем, что он не функционирует как обычный энхансер.Наблюдение за тем, что этот элемент нельзя отделить от сайта сплайсинга GA, означает, что правильнее считать его неотъемлемой частью сайта сплайсинга GA. Ядром 5′-ISE является тракт G ₅, присутствующий во всех интронах FGFR1 , секвенированных на сегодняшний день (Рисунок B), хотя этой последовательности недостаточно, чтобы действовать как энхансер сам по себе. Мы также идентифицировали одиночный ISE в интроне FGFR3 в положении, соответствующем элементу FGFR1 .Замена 5′-энхансера FGFR1 5′-энхансера в 1-28β-1 на присутствующий в FGFR3 приводит к уровню сплайсинга GA, сравнимому с таковым для минигена FGFR3 (рис. C). Из восьми изменений в мутации R3 большая часть снижения сплайсинга GA может быть связана с отсутствием тракта G ₅ (данные не показаны). Об общности этих 5′-энхансеров свидетельствует сохранение 5′-интронных последовательностей данного гена FGFR между разными видами

Нам еще предстоит исследовать 3′-ISE FGFR1 3 ‘так подробно, но это заманчиво. предположить, что этот элемент отражает некоторую особенность области 3’-сайта сплайсинга.Действительно, предварительные исследования показывают, что точка ветвления FGFR1 (5′-GTGAC-3 ‘) находится на 19 нуклеотидов выше 3’-сайта сплайсинга (данные не показаны) и ей предшествует полипиримидиновая последовательность, консервативная как у крысы, так и у мыши. Представляют интерес два аспекта FGFR1 3 ‘ISE. Во-первых, он функционально не эквивалентен 5′-ISE, будучи неспособным к увеличению использования сайта сплайсинга GA, когда он присутствует отдельно (Рисунок A). Это предполагает, что 3′-энхансер действует через 5′-энхансер (Рисунок B).Во-вторых, 3′-ISE в разной степени синергизирует с различными производными 5’-ISE (рис. C). Таким образом, в то время как активность FGFR1 5 ‘ISE удваивается на 3’ ISE, активности FGFR3 ISE и предполагаемого FGFR2 5 ‘ISE не пострадали. Результаты мутаций C5 и A5 предполагают, что тракт G ₅ имеет решающее значение для синергизма между двумя элементами.

Если наша модель выбора 5′-сайта сплайсинга FGFR верна, функция ISE может заключаться в разрешении перестройки U6 snRNP на пре-мРНК, возможно, за счет стабилизации связывания в сайте сплайсинга GA.В самом деле, такой стабилизации U6 может быть достаточно, чтобы преодолеть блок на стадии 2, обычно связанный с сайтами сплайсинга GA, и может объяснить, почему сдвиг U1 snRNAs был неспособен влиять на использование сайта сплайсинга GA. Наша рабочая гипотеза для FGFR1 состоит в том, что 5′-ISE представляет собой сайт взаимодействия одного или нескольких специфических trans -действующих факторов, связывание которых стабилизируется 3′-ISE либо напрямую, либо с помощью дополнительных факторов. Присутствие богатого пурином элемента в FGFR1 5 ‘ISE может указывать на роль белков SR в активации сайта сплайсинга GA.В самом деле, сплайсинг in vitro в отсутствие U1 может наблюдаться для обычных сайтов сплайсинга в присутствии повышенных концентраций белков SR (Tarn and Steitz, 1994; Crispino and Sharp, 1995). Однако мы не наблюдаем каких-либо устойчивых эффектов, когда различные плазмиды экспрессии белка SR котрансфицируют нашими конструкциями (S.Brackenridge и G.R.Screaton, неопубликованные результаты).

Другие сайты сплайсинга GA

Наши результаты демонстрируют эффективный сплайсинг с предположительно «тупикового» 5′-сайта сплайсинга.Поэтому важно учитывать, насколько широко распространены такие сайты. Первоначальное сообщение о сайте сплайсинга GA 5 ‘было получено из гена Drosophila Antennapaedia , где, как и для генов FGFR , обычный сайт сплайсинга расположен выше сайта сплайсинга GA 5′: TTC / GTAAGTGTCAAC / GAAAGTGATC (Hooper et al. др., 1992). Важно отметить, что альтернативно сплайсированная мРНК была выделена из штамма, отличного от штамма, поставляющего геномную ДНК, что повышает вероятность штамм-специфичного полиморфизма ДНК (Jackson, 1991).Кроме того, разделение двух сайтов сплайсинга значительно больше, чем для генов FGFR . Совсем недавно сообщалось, что интрон 13 гена гепараназы человека содержит сайт сплайсинга GA 5 ‘и сайт сплайсинга GG 3′ (Dong et al., 2000), хотя в более раннем отчете этот интрон не упоминался (Vlodavsky et al. , 1999). Единственный сайт сплайсинга GA, который был исследован досконально, – это скрытый 5’-сайт сплайсинга GA в интроне гена Schizosaccharomyces pombe cdc2 , который используется с низкой частотой (<10%), когда естественным 5'-сайтом сплайсинга является ослаблены мутацией (Romfo et al., 2000). Хотя этот сайт сплайсинга внешне напоминает сайт сплайсинга FGFR GA, он специфически распознается U1 snRNP (Alvarez and Wise, 2001), возможно, отражая различия между сплайсосомами дрожжей и млекопитающих.

Наши результаты показывают, что использование 5′-сайта сплайсинга FGFR GA зависит как от конкретной последовательности тандемных 5′-сайтов сплайсинга, так и от присутствия интронных энхансеров. За исключением сайта сплайсинга GA гена Antennapaedia , ни один из других сайтов сплайсинга GA 5 ‘не похож на те, которые присутствуют в генах FGFR .Однако может оказаться, что другие примеры таких необычных 5′-сайтов сплайсинга будут идентифицированы, когда геном человека будет полностью аннотирован. Более того, есть соблазн предположить, что конкуренция между очень близко расположенными обычными 5′-сайтами сплайсинга также может контролироваться с помощью U6 snRNP.

Материалы и методы

Плазмидные конструкции

Трансфекционные конструкции были основаны на pCG (Tanaka and Herr, 1990) с фрагментами, вставленными с использованием Xba I и Bam HI.Плазмидами экспрессии мяРНК были pG3U1 (Ashe et al., 1997) и pGEM1U6, которые содержат ген U6 человека, клонированный Kunkel и соавторами (Kunkel et al., 1986). Все мутации и гибридные фрагменты были получены с помощью ПЦР с Pfu и подтверждены секвенированием.

Временная трансфекция и экстракция РНК

Клетки 293T культивировали в шестилуночных планшетах в среде RPMI-1640 с 10% фетальной сывороткой теленка, 50 ед. / Мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ l-глутамина. От 30 до 70% субконфлюэнтных клеток в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением, как и ранее, трансфицировали 1 мкг плазмиды в виде преципитатов фосфата кальция.Для экспериментов по котрансфекции, показанных на фигуре, также было включено 4 мкг соответствующей конструкции экспрессии мяРНК. DMEM заменяли на RPMI-1640 через 6–8 часов, а еще через 18–36 часов экстрагировали РНК, как описано ранее (Brackenridge et al ., 1997).

ПЦР с обратной транскрипцией

Реакции RT с 10 микролитрами содержали буфер AMV-RT, 500 мкМ dNTP, 10 пмоль праймер, 10 единиц RNasin (Promega), 4 единицы AMV-RT (Cambio) и 4 мкл цитоплазматической РНК и инкубировали при 42 ° C в течение 1 ч, а затем при 90 ° C в течение 10 мин.Обратный праймер представлял собой βex3R (5′-GTGATGGGCCAGCACACAGACCAG-3 ‘), который отжигался с экзоном 3 β глобина кролика в pCG, за исключением RT-PCRs, показанных на рисунке B, где обратным праймером был βex2R (5’-CACCTTAGGGTTGCCCATAACAGC-3 ‘), Который отжигается с экзоном 2 β-глобина человека. ПЦР (1 × Taq буфер, 1,5 мМ MgCl ₂, 100 мкМ dNTP, 10 пмоль каждого праймера, 1 единица полимеразы Taq , 1 мкл RT реакции) проводили на приборе для ПЦР Hybaid Touchdown с использованием 28 циклов по 1 мин при 94 ° C, 1 мин при 65 ° C (или 60 ° C; рис. B) и 2 мин при 72 ° C.Последние 10 минут при 72 ° C были включены в конец программы. Обратные праймеры были такими же, как для RT, в то время как прямые праймеры были hR1F (5′-CCCTGGAAGAGAGGCCGGCAG-3 ‘, FGFR1 ), hR2F (5′-CGCCTGGAAGAGAAAAGGAGA-3′, FGFG CC2 ‘, hR3GGFAG (5′-CCCTGGAAGAGAGGCCGGCAG-3′), hR3GGFAG (5’-CGCCTGGAAGAGAAAAGGAGA-3 ‘) 3 ‘, FGFR3 ) и βex1F (5′-GCACCTGACTCCTGAGGAGAAG-3′, β-глобин человека).

Расщепление и маркировка продуктов ОТ-ПЦР

Аликвоты ОТ-ПЦР проверяли электрофорезом в 2% агарозных гелях; остаток продукта выделяли осаждением этанолом и центрифугированием (13 000 р.после полудня, 20 мин, 4 ° C). Гранулы сушили на воздухе и растворяли в 20 мкл дистиллированной воды. Переваривали пять микролитров ДНК (1 час, 37 ° C) в конечном объеме 15 мкл с 10 единицами каждого из Apa LI и Hin fI ( FGFR1 , FGFR2 и FGFR3 ; 1- 1-β), Hin fI (β-1-1) или Acc I и Hin fI (β-1-β). Реакцию доводили до 20 мкл добавлением 0,1 единиц полимеразы Кленова для секвенирования (Roche) и 0.037 МБк [α- ³² P] dATP (111 ТБк / ммоль; Amersham Pharmacia) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, со всеми четырьмя дНТФ, добавленными до 125 мкМ после первых 10 минут. Добавляли пять микролитров загрузочного красителя (10 мМ ЭДТА, 1% масс. / Об. Додецилсульфата натрия, 10 мг / мл бромфенолового синего и ксилолцианол) и аликвоты по 5 мкл наносили на 5,8% нативные акриламидные гели (18 × 40 см). Гели запускали в 1 × TBE при 30 Вт в течение 75 мин, сушили на 3MM хроматографической бумаге (Whatman) и экспонировали при –70 ° C с пленкой Kodak BioMax MR-1 или при комнатной температуре на экранах фосфорно-визуализатора Fuji BAS-2000 для количественного анализа.

§ 40-6-391 – Управление автомобилем в состоянии алкогольного, наркотического или другого опьянения; штрафы; публикация сообщения о судимости лицам, осужденным повторно; подвергая опасности ребенка :: Кодекс Джорджии 2010 года :: Кодексы и законы США :: Законодательство США :: Justia

O.C.G.A. 40-6-391 (2010)
40-6-391. Управление автомобилем в состоянии алкогольного, наркотического или иного опьянения; штрафы; публикация сообщения о судимости лицам, осужденным повторно; создание опасности для ребенка

(a) Человек не должен управлять движущимся транспортным средством или физически контролировать его, пока:

(1) В состоянии алкогольного опьянения, поскольку это менее безопасно для человека управлять автомобилем;

(2) в состоянии наркотического опьянения до такой степени, что управление транспортным средством менее безопасно для человека;

(3) Под умышленным воздействием любого клея, аэрозоля или других токсичных паров до такой степени, что управление транспортным средством менее безопасно для человека;

(4) Под совместным воздействием любых двух или более веществ, указанных в пунктах (1) – (3) настоящего подраздела, в той степени, в которой управление транспортным средством менее безопасно для человека;

(5) Концентрация алкоголя у человека равна 0.08 граммов или более в любое время в течение трех часов после такого вождения или фактического физического контроля над алкоголем до того, как такое вождение или физический контроль закончились; или

(6) В соответствии с положениями подпункта (b) данного раздела Кодекса любое количество марихуаны или контролируемого вещества, как определено в разделе 16-13-21 Кодекса, присутствует в крови или моче человека, или оба, включая метаболиты и производные каждого или обоих, независимо от того, присутствует ли алкоголь в дыхании или крови человека.

(b) Тот факт, что любое лицо, обвиняемое в нарушении этого раздела Кодекса, имеет или имело законное право употреблять наркотик, не является защитой от любого обвинения в нарушении этого раздела Кодекса; при условии, однако, что такое лицо не должно нарушать раздел настоящего Кодекса, за исключением случаев, когда такое лицо становится неспособным безопасно управлять автомобилем в результате употребления наркотиков, отличных от алкоголя, которые такое лицо имеет законное право употреблять.

(c) Каждое лицо, осужденное за нарушение данного раздела Кодекса, должно быть виновным в правонарушении в первый или второй раз, в третьем случае виновным в совершении мисдиминора высокой степени тяжести и при отягчающих обстоятельствах, а также в четвертом или последующем правонарушении. осуждение, быть виновным в совершении уголовного преступления, за исключением случаев, предусмотренных в пункте (4) настоящего подраздела, и подлежит наказанию следующим образом:

(1) Первая судимость без осуждения и без признания вины nolo contendere принято к обвинению в нарушении этого раздела Кодекса в течение предыдущих десяти лет, отсчитываемых от дат предыдущих арестов, в отношении которых были вынесены обвинительные приговоры или были приняты ходатайства о nolo contendere, до даты текущего ареста, в отношении которого вынесен обвинительный приговор или принято заявление о nolo contendere :

(A) Штраф в размере не менее 300 долларов США.00 и не более 1 000,00 долларов США, и этот штраф не подлежит приостановлению, приостановлению или испытательному сроку, за исключением случаев, предусмотренных в подразделе (g) данного раздела Кодекса;

(B) Срок тюремного заключения на срок от десяти дней до 12 месяцев, который может, по единоличному усмотрению судьи, быть приостановлен, приостановлен или испытан, за исключением случаев, когда концентрация алкоголя преступником на момент совершения преступления весило 0,08 грамма или более, судья может приостановить, приостановить или завещать все, кроме 24 часов, любого срока лишения свободы, назначенного в соответствии с этим подпунктом;

(C) Не менее 40 часов общественных работ, за исключением случая осуждения за нарушение части (k) данного раздела Кодекса, когда концентрация алкоголя на момент совершения преступления была меньше 0.08 грамм, продолжительность общественных работ не менее 20 часов;

(D) Завершение программы снижения риска употребления алкоголя или наркотиков в результате употребления наркотиков. Спонсор любой такой программы должен предоставить письменное уведомление об утверждении программы отделом лицу при зачислении в программу;

(E) Клиническая оценка, как определено в Разделе Кодекса 40-5-1, и, если рекомендуется как часть такой оценки, завершение программы лечения наркозависимости, как определено в Разделе Кодекса 40-5-1; при условии, однако, что по усмотрению суда такая оценка может быть отменена; и

(F) Если лицо приговорено к тюремному заключению на срок менее 12 месяцев, испытательный срок на 12 месяцев за вычетом любых дней, в течение которых данное лицо фактически находится в заключении;

(2) Для второго осуждения в течение десятилетнего периода, отсчитываемого от дат предыдущих арестов, в отношении которых были вынесены обвинительные приговоры или были приняты ходатайства о nolo contendere, до даты текущего ареста, в отношении которого была вынесена судимость. получено или принято заявление о признании недействительным:

(A) Штраф в размере не менее 600 долларов США.00 и не более 1 000,00 долларов США, и этот штраф не подлежит приостановлению, приостановлению или испытательному сроку, за исключением случаев, предусмотренных в подразделе (g) данного раздела Кодекса;

(B) Срок заключения не менее 90 дней и не более 12 месяцев. Судья должен испытать, по крайней мере, часть такого срока лишения свободы в соответствии с подпунктом (F) этого параграфа, тем самым подчиняя правонарушителя положениям статьи 7 главы 8 раздела 42 и другим условиям, например судья может наложить; при условии, однако, что преступник должен отбыть не менее 72 часов с момента фактического лишения свободы;

(D) Завершение программы снижения риска употребления алкоголя или наркотиков в результате употребления наркотиков.Спонсор любой такой программы должен предоставить письменное уведомление об утверждении программы отделом лицу при зачислении в программу;

(F) испытательный срок на 12 месяцев за вычетом любых дней, в течение которых лицо фактически находится в заключении;

(3) Для третьего осуждения в течение десятилетнего периода, отсчитываемого от дат предыдущих арестов, в отношении которых были вынесены обвинительные приговоры или были приняты ходатайства о nolo contendere, до даты текущего ареста, в отношении которого была вынесена судимость. получено или принято заявление о недопустимости соперничества:

(A) Штраф в размере не менее 1000 долларов США.00 и не более $ 5 000,00, и этот штраф не подлежит приостановлению, приостановлению или испытательному сроку, за исключением случаев, предусмотренных в подразделе (g) настоящего Кодекса;

(B) Обязательный срок тюремного заключения на срок от 120 дней до 12 месяцев. Судья должен испытать, по крайней мере, часть такого срока лишения свободы в соответствии с подпунктом (F) данного параграфа, тем самым подчиняя правонарушителя положениям статьи 7 главы 8 раздела 42 и другим условиям, например судья может наложить; при условии, однако, что преступник должен отбыть не менее 15 дней с момента фактического лишения свободы;

(D) Завершение программы снижения риска употребления алкоголя или наркотиков в результате употребления наркотиков.Спонсор любой такой программы должен предоставить письменное уведомление об утверждении программы отделом лицу при зачислении в программу;

(4) Для четвертого или последующего обвинительного приговора в течение десятилетнего периода, отсчитываемого от дат предыдущих арестов, в отношении которых были вынесены обвинительные приговоры или были приняты ходатайства о nolo contendere, до даты текущего ареста, в отношении которого вынесен обвинительный приговор или принято заявление о признании вины nolo contendere:

(B) Срок лишения свободы от одного года до пяти лет; при условии, однако, что судья может приостановить, приостановить или завещать все, кроме 90 дней, любого срока лишения свободы, назначенного в соответствии с этим параграфом. Судья должен испытать, по крайней мере, часть такого срока лишения свободы в соответствии с подпунктом (F) этого параграфа, тем самым подчиняя правонарушителя положениям статьи 7 главы 8 раздела 42 и другим условиям, например судья может наложить;

(C) Не менее 60 дней общественных работ; при условии, однако, что, если обвиняемый приговорен к трем годам лишения свободы, судья может приостановить общественные работы;

(D) Завершение программы снижения риска употребления алкоголя или наркотиков в результате употребления наркотиков.Спонсор любой такой программы должен предоставить письменное уведомление об утверждении программы отделом лицу при зачислении в программу;

(F) испытательный срок на пять лет за вычетом любых дней, в течение которых лицо фактически находится в заключении;

, однако, предусматривало, что, если десятилетний период времени, измеренный в этом параграфе, начался до 1 июля 2008 года, то такое четвертое или последующее осуждение должно быть мисдиминором высокой степени тяжести и при отягчающих обстоятельствах и наказываться в соответствии с положениями параграфа (3) настоящего пункта;

(5) Если лицо было осуждено за нарушение части (k) настоящего Кодекса, раздел на основании отказа пройти обязательное тестирование или концентрация алкоголя у такого лица на момент совершения преступления была равна 0.08 граммов или более, и такое лицо впоследствии будет признано виновным в нарушении подраздела (а) данного раздела Кодекса, такое лицо должно быть наказано с применением применимого уровня или степени осуждения, указанной в этом подразделе, так что предыдущее осуждение за нарушение подраздела (k ) статьи Кодекса считается судимостью за нарушение части (а) настоящей статьи Кодекса;

(6) Для назначения наказания в соответствии с настоящим подразделом заявление о несогласии на основании нарушения положений настоящего Кодекса считается обвинительным приговором; и

(7) Для целей определения количества предыдущих судимостей или заявлений о несогласии в соответствии с положениями о тяжких преступлениях параграфа (4) настоящего подраздела рассматриваются только те правонарушения, в отношении которых вынесен приговор или заявление о несогласии. принятые 1 июля 2008 г. или позднее, рассматриваются; при условии, однако, что ничто в этом подразделе не должно толковаться как ограничение или изменение каким-либо образом административных процедур или положений об усилении наказания в соответствии с законодательством Джорджии, включая, помимо прочего, положения, касающиеся наказания рецидивистов в соответствии с Разделом 17.

(d) (1) Несмотря на ограничения, установленные в любом муниципальном уставе, любой муниципальный суд любого муниципалитета имеет право налагать проступки или высокие и особо тяжкие наказания за проступки, предусмотренные в этом разделе Кодекса, после осуждения за нарушение настоящего Кодекса. раздела или при осуждении за нарушение любого постановления, принимающего положения этого раздела Кодекса.

(2) Невзирая на любое положение этого раздела Кодекса об обратном, любой суд, уполномоченный рассматривать дела о проступках или тяжких и особо тяжких проступках, связанных с нарушениями этого раздела Кодекса, должен иметь право осуществлять полномочия по завещанию, приостановлению или приостановлению исполнения любого приговора. навязывается.Однако такие полномочия ограничиваются условиями и ограничениями, налагаемыми подразделом (с) настоящего раздела Кодекса.

(e) Вышеупомянутые ограничения по наказанию также применяются, когда ответчик был признан виновным в нарушении одной транзакцией более чем одного из четырех положений части (а) данной статьи Кодекса.

(f) Положения раздела 17-10-3 Кодекса, касающиеся общего наказания за проступки, включая нарушения правил дорожного движения, и положения статьи 3 главы 8 раздела 42, касающиеся испытательного срока первых нарушителей, не применяются к любое лицо, признанное виновным в нарушении любого положения раздела настоящего Кодекса.
(g) (1) Если уплата штрафа, требуемого согласно подразделу (c) данного раздела Кодекса, создаст экономические трудности для ответчика, судья, по своему усмотрению, может приказать ответчику уплатить такой штраф. в рассрочку, и такой приказ может быть приведен в исполнение посредством судебного разбирательства по делу о неуважении к суду или отмены любого испытательного срока, разрешенного настоящим разделом Кодекса.

(2) По единоличному усмотрению судьи он или она может приостановить до половины штрафа, наложенного в соответствии с частью (c) данного раздела Кодекса, при условии, что ответчик проходит лечение в рамках программы лечения наркозависимости, как определено в Разделе Кодекса 40-5-1.

(h) В целях определения в соответствии с данной главой предшествующих осуждений или заявлений о несогласии с нарушением настоящего Кодекса, в дополнение к правонарушению, запрещенному этим разделом Кодекса, осуждение или заявление о признании виновным в нарушении любого из следующих правонарушения считаются нарушением раздела настоящего Кодекса:

(1) Любой федеральный закон, в значительной степени соответствующий или параллельный правонарушению, охватываемому разделом настоящего Кодекса;

(2) Любое местное постановление, принятое в соответствии со статьей 14 данной главы, которое принимает положения этого раздела Кодекса; или

(3) Любой ранее или действовавший в настоящее время закон этого или любого другого штата, который был или по существу соответствует или параллелен этому разделу Кодекса.

(i) Человек не должен управлять движущимся коммерческим транспортным средством или физически контролировать его, если в его крови, дыхании или моче содержится 0,04 процента или более алкоголя по весу. Каждое лицо, признанное виновным в нарушении этого подраздела, должно быть виновно в проступке, и, помимо дисквалификации в соответствии со статьей 7 главы 5 настоящего заголовка, “Закон о единых коммерческих водительских удостоверениях” подлежит штрафу, как предусмотрено в подразделе (c). настоящего раздела Кодекса.
(j) (1) Секретарь суда, в котором лицо осуждено во второй или последующий раз в соответствии с частью (c) настоящей статьи Кодекса в течение пяти лет, считая с дат предыдущих арестов, по которым были вынесены обвинительные приговоры, или Заявление о признании виновным было принято до даты текущего ареста, в отношении которого вынесен приговор или принято заявление о признании виновным, должно быть причиной публикации уведомления о признании виновным для каждого такого осужденного лица. Такие уведомления об осуждении должны быть опубликованы в виде юридических уведомлений в юридическом органе округа, в котором это лицо проживает, или, в случае нерезидентов, в юридическом органе округа, в котором это лицо было осуждено.Такое уведомление об осуждении должно состоять из одной колонки шириной и двух дюймов в длину и содержать фотографию, сделанную правоохранительным органом, производившим арест во время ареста, имя осужденного, город, округ и почтовый индекс осужденного. адрес места жительства, а также дата, время, место ареста и решение по делу, и должны быть опубликованы один раз в юридическом органе соответствующего округа в течение второй недели после вынесения приговора или сразу после того, как публикация может быть опубликована.

(2) Осужденному, в отношении которого опубликовано уведомление об осуждении в соответствии с настоящим подразделом, будет начислено 25 долларов США за публикацию такого уведомления, и такая оценка должна быть наложена во время осуждения в дополнение к любому другому наложенному штрафу. в соответствии с этим разделом Кодекса.

(3) Секретарь суда, издатель любого юридического органа, который публикует уведомление об обвинительном приговоре, и любое другое лицо, участвующее в публикации ошибочного уведомления об обвинительном приговоре, освобождаются от гражданской или уголовной ответственности за такую ошибочную публикацию. , при условии, что публикация была добросовестной.
(k) (1) Лицо в возрасте до 21 года не должно водить или фактически физически контролировать любое движущееся транспортное средство, в то время как концентрация алкоголя у человека составляет 0,02 грамма или более в любое время в течение трех часов после такого вождения или пребывания в физическом состоянии. контроль от алкоголя, употребленного до того, как такое вождение или физический контроль закончились.

(2) Каждое лицо, признанное виновным в нарушении данного подраздела, должно быть виновно в проступке по первому и второму обвинительным приговорам, а после третьего или последующего осуждения виновным в проступке высокой степени тяжести и при отягчающих обстоятельствах и должно быть наказано и оштрафовано в соответствии с положениями подраздела. (c) данного раздела Кодекса, при условии, что отбытый срок тюремного заключения регулируется положениями раздела 17-10-3 Кодекса.1, и любой период общественных работ, наложенный на такое лицо, должен быть завершен в течение 60 дней с даты вынесения приговора.

(3) Никакие заявления о несогласии не принимаются в отношении лиц моложе 21 года, обвиняемых в нарушении положений настоящего Кодекса.

(l) Лицо, которое нарушает этот раздел Кодекса при перевозке в автомобиле ребенка в возрасте до 14 лет, виновно в отдельном правонарушении, представляя опасность для ребенка, управляя автомобилем в состоянии алкогольного или наркотического опьянения.Преступление, связанное с опасностью для ребенка вождением в состоянии алкогольного или наркотического опьянения, не может быть объединено с правонарушением, связанным с вождением в состоянии алкогольного или наркотического опьянения, для целей судебного преследования и вынесения приговора. Правонарушитель, признанный виновным в нарушении данного подраздела, должен быть наказан в соответствии с положениями подраздела (d) Раздела 16-12-1 Кодекса, касающегося правонарушения, связанного с содействием правонарушению, хулиганству или лишению ребенка. .

Посетите наш Douglasville, 9502 Hwy 5, GA Location

В целях соблюдения государственных и местных правил некоторым ресторанам пришлось изменить часы работы.Мы стремимся предоставить вам фаворитов McDonald’s в эти непростые времена и внимательно следим за дополнительными ограничениями, а также за тем, когда они могут быть отменены

Мы внимательно следим за всеми местными, государственными и федеральными законами, чтобы предоставить клиентам возможность бесконтактного получения. В результате этих правил некоторые рестораны обслуживают клиентов только через Drive-Thru, в то время как другие остаются открытыми для еды, а также обслуживают клиентов через Drive-Thru , с Mobile Order & Pay на Приложение McDonald’s и с McDelivery ®

Здоровье и безопасность сотрудников и клиентов ресторана – главный приоритет.В дополнение к нашим стандартным санитарным процедурам в наших ресторанах есть:

* Внедрили бесконтактные операции

* Пройти оздоровительный осмотр перед началом смены

* Обучены передовым методам социального дистанцирования за стойкой

* Установлены защитные ограждения в пунктах заказа

* Носят маски или маскировку для лица, если они не вакцинированы (или полностью вакцинированы, но все еще предпочитают это делать), и перчатки для работы с пищевыми продуктами, а также обеспечивают наличие масок для менеджеров, бригады и клиентов.

* Увеличили частоту очистки, дезинфекции и дезинфекции поверхностей с высоким уровнем касания

* Мы по-прежнему придерживаемся высоких стандартов по продвижению регулярного и тщательного мытья рук и напоминаем членам нашей бригады о наших передовых методах личной гигиены

* Там, где это возможно, увеличивается использование дезинфицирующих средств для рук на спиртовой основе в качестве дополнения к частому мытью рук

Кроме того, новые процедуры и правила для ужина в ресторане включают:

* Закрытие некоторых сидений и столов для обеспечения социальной дистанции

* Сохранение закрытых игровых площадок, требующих особого ухода, и изменение наших процедур подачи напитков, чтобы свести к минимуму контакты

Мы также предоставляем руководству ресторана руководство на основе сценариев о том, как работать в различных ситуациях, связанных с COVID-19, и сообщаем обновления руководств по охране здоровья и безопасности от федеральных органов здравоохранения.Мы продолжим оценивать все существующие меры безопасности и вносить соответствующие коррективы, поскольку мы по-прежнему сосредоточены на здоровье и безопасности сотрудников ресторана и вас, наших клиентов.

Fried Chicken, Extra Crispy Chicken, Bucket of Chicken & More in Douglasville, GA

KFC Доставка и заказ вперед

Посетите местный KFC на шоссе 5, Торговый центр Market Square, чтобы получить свежую партию нашей лучшей курицы в мире. Ручная панировка и свежеприготовленная! Наша курица не сделана…ПодробнееНажмите, чтобы расширить это описание и продолжить чтение

Посетите местный KFC на шоссе 5, торговый центр Market Square, чтобы купить свежую партию нашей лучшей курицы в мире. Ручная панировка и свежеприготовленная! Наша курица не производится ни быстрым, ни легким способом. Это трудный путь. Каждая свежая партия лучшей в мире курицы начинается с того, что наши повара осматривают каждый отдельный кусок. Затем нашу свежую курицу тщательно обваливают 7 раз в секретной смеси из 11 трав и специй, затем 7 раз трясут, а затем готовят под давлением при низкой температуре, чтобы сохранить все великолепные вкусовые качества, которыми мы славимся во всем мире.От нашего оригинального рецепта до курицы Extra Crispy ™, домашних гарниров и пахты – мы готовы удовлетворить ваши потребности в курице в течение всего дня. Позвоните нам по телефону (770) 949-1440, чтобы получить свежеприготовленные вкусные полноценные семейные обеды по доступным ценам.Читать меньшеНажмите, чтобы свернуть это описание

Посетите местный KFC на шоссе 5, Торговый центр Market Square, чтобы купить свежую партию лучшей в мире курицы . Ручная панировка и свежеприготовленная! Наша курица не производится ни быстрым, ни легким способом.Это трудный путь. Каждая свежая партия лучшей в мире курицы начинается с того, что наши повара осматривают каждый отдельный кусок. Затем нашу свежую курицу тщательно обваливают 7 раз в секретной смеси из 11 трав и специй, затем 7 раз трясут, а затем готовят под давлением при низкой температуре, чтобы сохранить все великолепные вкусовые качества, которыми мы славимся во всем мире. От нашего оригинального рецепта до курицы Extra Crispy ™, домашних гарниров и пахты – мы готовы удовлетворить ваши потребности в курице в течение всего дня.Позвоните нам по телефону (770) 949-1440, чтобы получить свежеприготовленные вкусные полноценные семейные обеды по доступным ценам.

Штрафов за нарушение Закона Грузии о контролируемых веществах и опасных наркотиках

Нарушение Закона Грузии о контролируемых веществах и наркопреступления за злоупотребление некоторыми наркотиками

O.C.G.A. §§ 16-13-20–30

Хранение менее одной унции марихуаны является правонарушением согласно O.C.G.A. § 16-13-2 (b), наказывается лишением свободы на срок до 12 месяцев или штрафом до 1000 долларов, или и тем, и другим, или общественными работами на срок до 12 месяцев.Хранение более 1 унции является уголовным преступлением, наказуемым лишением свободы на срок от 1 до 10 лет.

Хранение марихуаны с целью распространения, продажи, доставки или распространения, в зависимости от количества марихуаны, является уголовным преступлением, наказуемым лишением свободы на срок от одного до 30 лет и штрафом от 100 000 до 1 000 000 долларов. O.C.G.A. § 16-13-30 (j) и 16-13-31 (c).

Наркотики и наркотики, которые запрещены или могут храниться только по законному рецепту, являются контролируемыми веществами.Закон Джорджии классифицирует их по 5 таблицам. O.C.G.A. § 16-13-24. Список I наркотиков (например, героин, ЛСД, грибы, экстази) – это те, которые считаются наиболее опасными и не имеют лекарственной ценности. Список II наркотиков (например, кокаин, метамфетамин, гидрокодон, опиум, кодеин и т. Д.) – это препараты, предназначенные только для медицинских целей и требующие рецепта. Список III, (стероиды), Список IV, (ксанакс и валиум) и Список V, – это те препараты, которые должны выписываться на законных основаниях и иметь различный потенциал для злоупотребления.

Незаконное хранение любого контролируемого вещества Списка I, наркотика Списка II или ненаркотического средства Списка II является уголовным преступлением, наказуемым лишением свободы на срок от 2 до 30 лет, в зависимости от количества. Незаконное хранение контролируемых веществ, включенных в Список III, IV или V, является уголовным преступлением и карается лишением свободы на срок от 1 года до 5 лет.

Незаконная продажа / распространение любого контролируемого вещества, включенного в Список I или II, является уголовным преступлением, наказуемым тюремным заключением на срок от одного до 30 лет, в зависимости от количества.Продажа любых контролируемых веществ, включенных в Список III, IV или V, является уголовным преступлением, наказуемым тюремным заключением на срок от одного до десяти лет, в зависимости от количества.

Chatham County, Джорджия | 5 район

История

В 1975 году Милтон был нанят The Savannah Tribune для набора и верстки еженедельной газеты. Спустя всего год ее повысили до редактора и генерального директора и взяли на себя отвечала за выпуск газеты до 1978 года, когда она переехала в Детройт и продолжила свою карьеру в газете Detroit Free Press, а затем и в Kansas. City Star и Times.

В августе 1981 года Милтон вернулась в Саванну и начала карьеру на полную ставку в качестве менеджера по работе с клиентами в Savannah Morning News, где она работала как секретными, так и розничная продажа рекламы. После 20 лет работы в The Savannah Morning News Милтон начала составлять бизнес-план по открытию собственной маркетинговой компании. T-Time Marketing.В июне 2002 года она наняла The Savannah Tribune на должность директора по маркетингу. В июле 2003 года она была нанята на работу в качестве директора по маркетингу и рекламе. Директор. В настоящее время она является вице-президентом и директором по рекламе в The Savannah Tribune.

Как жительница 5-го округа округа Чатем с 1963 года, Милтон активно участвует в жизни своего сообщества, обслуживая несколько организаций, в том числе «Бойскауты Америки» и «Бойскауты Америки». Торговая палата области Саванна, Объединенный путь прибрежной империи, Общество лейкемии / лимфомы, Американская диабетическая ассоциация, Ассоциация строителей жилищ Большого Саванна и вице-президент Джазовой ассоциации Саванны.Недавно она собрала более 12000 долларов в рамках кампании Susan G. Komen Big Wig по борьбе с раком груди. У нее есть в течение последних 10 лет работал в столичной комиссии по планированию в качестве председателя с 2016 по 2018 год. За время службы в своей общине она получила множество наград. Она Победитель конкурса “Зеркальный шар” 2010 года в номинации “Танцы со звездами саванны” по версии CASA.

Милтон является членом отделения Top Ladies of Distinction Savannah Chapter, Национального совета негритянских женщин Savannah Chapter и работает над пожизненным членом саванны.

TOP HEADLINES