Кч 30 6 расшифровка: Марочник стали и сплавов – Чугун КЧ30-6 : химический состав и свойства

alexxlab | 29.04.1970 | 0 | Разное

Марочник стали и сплавов – Чугун КЧ30-6 : химический состав и свойства



Марочник стали и сплавов – Чугун КЧ30-6 : химический состав и свойства
На шаг назадВернуться в справочникНа главную
Материалы -> Чугун ковкий     ИЛИ     Материалы -> Чугун-все марки

Марка	КЧ30-6
Классификация	Чугун ковкий
Применение	детали, работающие при низких статических и динамических нагрузках; сантехническое и строительное оборудование

Химический состав в % материала КЧ30-6

C	Si	Mn	S	P	Cr
2.6 – 2.9	1 – 1.6	0.4 – 0.6	до   0.2	до   0.18	до   0.08

Механические свойства при Т=20^oС материала КЧ30-6 .

Сортамент	Размер	Напр.	sв	sT	d5	y	KCU	Термообр.
–	мм	–	МПа	МПа	%	%	кДж / м2	–
			294		6

Твердость материала   КЧ30-6   ,

HB 10 -1 = 100 – 163   МПа

Физические свойства материала КЧ30-6 .

T	E 10– 5	a 10 6	l	r	C	R 10 9
Град	МПа	1/Град	Вт/(м·град)	кг/м3	Дж/(кг·град)	Ом·м
20	1.55

Обозначения:

Механические свойства :
sв	– Предел кратковременной прочности , [МПа]
sT	– Предел пропорциональности (предел текучести для остаточной деформации), [МПа]
d5	– Относительное удлинение при разрыве , [ % ]
y	– Относительное сужение , [ % ]
KCU	– Ударная вязкость , [ кДж / м2]
HB	– Твердость по Бринеллю , [МПа]

Физические свойства :
T	– Температура, при которой получены данные свойства , [Град]
E	– Модуль упругости первого рода , [МПа]
a	– Коэффициент температурного (линейного) расширения (диапазон 20 o – T ) , [1/Град]
l	– Коэффициент теплопроводности (теплоемкость материала) , [Вт/(м·град)]
r	– Плотность материала , [кг/м3]
C	– Удельная теплоемкость материала (диапазон 20o – T ), [Дж/(кг·град)]
R	– Удельное электросопротивление, [Ом·м]

Источник: http://www.splav-kharkov.com/

Марка – ковкий чугун – Большая Энциклопедия Нефти и Газа, статья, страница 1

Марка – ковкий чугун

Cтраница 1

Марки ковких чугунов: КЧ 30 – 6, КЧ 33 – 8, КЧ 35 – 10, КЧ 37 – 12 и др. Буквы КЧ означают ковкий чугун, первые две цифры указывают предел прочности при растяжении, последние цифры – относительное удлинение при растяжении.  [1]

Марки ковкого чугуна: КЧЗО-6, КЧЗЗ-8, КЧ35 – 10 и др. Буквы означают ковкий чугун, две первые цифры – предел прочности при растяжении, вторая цифра – относительное удлинение. Рассмотрим кристаллизацию спокойной, хорошо раскисленной стали в изложнице. Сталь разливают по изложницам при 1540 – 1560 С. При этом она соприкасается с холодными днищем и стенками изложницы, вследствие чего очень быстро охлаждается.  [2]

Марки ковких чугунов по ГОСТ 1215 – 59: КЧ 30 – 6; КЧ 33 8; КЧ 35 – 10; КЧ 37 – 12 и др. Буквы КЧ означают ковкий чугун, первое число указывает предел прочности при растяжении, последнее – относительное удлинение при растяжении.  [3]

Примерами марок ковких чугунов могут служить КЧ 38 – 8; КЧ 35 – 10; КЧ 37 – 12; КЧ 30 – 6 с ферритной металлической основой и КЧ 45 – 6; КЧ 50 – 4 и КЧ 60 – 3, имеющие феррит-но-порлитную основу.  [5]

Обозначение марок ковкого чугуна

по ГОСТ 1215 – 59 начинается с букв КЧ – ковкий чугун. За ними следует двухзначное число, показывающее минимальное значение предела прочности на растяжение в кГ / мм2, а далее через дефис – минимальное значение относительного удлинения в процентах.  [7]

Обозначение марки ковкого чугуна включает буквы КЧ и стоящие после букв цифры, указывающие предел прочности при растяжении в кГ / мм2 и относительное удлинение ( отношение приращения длины образца после разрыва к его исходной длине) в процентах.  [8]

Обозначение марок ковкого чугуна по ГОСТ 1215 – 59 начинается с букв КЧ – ковкий чугун.  [10]

Примерами марок ковких чугунов могут служить КЧ 30 – 6; КЧ 33 – 8; КЧ 35 – 10; КЧ 37 – 12 с ферритной металлической основой и КЧ 45 – 7; КЧ 50 – 5 и КЧ 60 – 3, имеющие перлитную основу.  [12]

Обозначение марок ковкого чугуна по ГОСТ 1215 – 59 начинается с букв КЧ – ковкий чугун. За ними следует двухзначное число, показывающее минимальное значение предела прочности на растяжение в ( кГ / мм2), а далее через дефис – минимальное значение относительного удлинения в процентах.  [13]

Условное обозначение марок ковкого чугуна включает буквы КЧ и две двузначные цифры, первая из которых означает величину предела прочности при растяжении, а вторая – относительное удлинение в процентах. В настоящее время ковкий чугун все более и более вытесняется модифицированным серым чугуном с шаровидным графитом.  [14]

Марки высокопрочного чугуна обозначаются аналогично маркам ковкого чугуна. Из него отливают коленчатые валы, гильзы цилиндров, распределительные валы, стойки осей коромысел клапанов.  [15]

Страницы:      1    2    3

КЧ30-6 – Чугун ковкий – Марочник стали и сплавов – Производитель тканых металлических сеток

Прямые телефоны в вашем городе ХарьковМобильный УкраинаКиевУфа

+380 57 716-23-91, 716-23-92

НАВИГАЦИЯ: Материалы -> Чугун ковкий     ИЛИ     Материалы -> Чугун-все марки

Характеристика материала КЧ30-6.

Марка :	КЧ30-6
Классификация :	Чугун ковкий
Применение:	детали, работающие при низких статических и динамических нагрузках; сантехническое и строительное оборудование

Химический состав в % материала   КЧ30-6

ГОСТ   1215 – 79

C	Si	Mn	S	P	Cr
2.6 – 2.9	1 – 1.6	0.4 – 0.6	до   0.2	до   0.18	до   0.08

Механические свойства при Т=20^oС материала КЧ30-6 .

Сортамент	Размер	Напр.	sв	sT	d5	y	KCU	Термообр.
–	мм	–	МПа	МПа	%	%	кДж / м2	–
			294		6

Твердость материала   КЧ30-6   ,

HB 10 -1 = 100 – 163   МПа

Физические свойства материала КЧ30-6 .

T	E 10– 5	a 10 6	l	r	C	R 10 9
Град	МПа	1/Град	Вт/(м·град)	кг/м3	Дж/(кг·град)	Ом·м
20	1.55

Обозначения:

Механические свойства :
sв	– Предел кратковременной прочности , [МПа]
sT	– Предел пропорциональности (предел текучести для остаточной деформации), [МПа]
d5	– Относительное удлинение при разрыве , [ % ]
y	– Относительное сужение , [ % ]
KCU	– Ударная вязкость , [ кДж / м2]
HB	– Твердость по Бринеллю , [МПа]

Физические свойства :
T	– Температура, при которой получены данные свойства , [Град]
E	– Модуль упругости первого рода , [МПа]
a	– Коэффициент температурного (линейного) расширения (диапазон 20o – T ) , [1/Град]
l	– Коэффициент теплопроводности (теплоемкость материала) , [Вт/(м·град)]
r	– Плотность материала , [кг/м3]
C	– Удельная теплоемкость материала (диапазон 20o – T ), [Дж/(кг·град)]
R	– Удельное электросопротивление, [Ом·м]

Расшифровка обозначений марок сталей и чугунов.

     Чугун  –  сплав  железа  с  углеродом,  содержащий  более  2,14% углерода, постоянные примеси. Они мало  пластичны, не прокатываются  и не  куются. Чугуны  обладают пониженной температурой плавления и хорошими литейными свойствами. За  счет  этого  из  чугунов  можно  делать  отливки  значительно  более  сложной  формы, чем из сталей. 

Разновидности чугунов:

   В  зависимости  от  того,  какой  формы  присутствует  углерод  в  сплавах различают белые, серые, ковкие и высокопрочные чугуны. 

• Белый чугун – Такое название он получил по виду излома, который имеет матово-белый цвет. Весь углерод в этом чугуне находится в связанном состоянии в виде  цементит. Белые чугуны имеют большую твердость (НВ 450-550) и , как  следствие этого, они очень хрупкие и для изготовления деталей машин не  используются.  

         Высокая твердость белого чугуна обеспечивает его износостойкость, в том числе и при воздействии агрессивных сред. Это                         свойство  учитывают при изготовлении из него поршневых колец. Однако белый чугун применяют  главным образом для отливки                 деталей на ковкий чугун, поэтому его  называют передельным.

• Серый чугун – В сером чугуне углерод находится в виде графита пластинчатой формы. Серые чугуны маркируются сочетанием букв «С»  –  серый, «Ч»-  чугун  и  цифрами, которые обозначают   временное сопротивление разрыву при растяжении в Мпа.
• Высокопрочный чугун – Отличительной особенностью      высокопрочного чугуна являются его высокие   механические   свойства, так как структура углерода в нем – шаровидный графит.  Это повышает прочность чугуна и позволяет получить сплавы с достаточно высокой пластичностью и вязкостью.

  Обозначение марки включает буквы «В» – высокопрочный, «Ч» – чугун и цифры, обозначающие временное сопротивление разрыву при растяжении в Мпа.

• Ковкий чугун – Ковкими называют чугуны, в которых графит имеет хлопьевидную форму. Несмотря на свое название, они никогда не подвергаются ковке. Конфигурация детали из ковкого чугуна определяется формой отливки. Ковкие  чугуны  маркируют  «К»  –  ковкий,  «Ч»  –  чугун  и  цифрами. 

Первая группа цифр – показывает  предел прочности чугуна  при  растяжении,  МПа: 

Вторые – относительное удлинение при разрыве в %.

Чугуны со специальными свойствами.

В зависимости от назначения различают износостойкие, антифрикционные, жаростойкие и коррозионностойкие чугуны.

Износостойкие (антифрикционные ) чугуны. 

Обозначают сочетанием букв АЧС, АЧК, АЧВ. Буквы С, К, В обозначают вид чугуна: серый, ковкий, высокопрочный. Цифра обозначает номер чугуна.

Для легирования антифрикционных чугунов применяют хром, никель, медь, титан.

Жаростойкие и жаропрочные чугуны.

Обозначают набором заглавных букв русского алфавита и следующими за ними букв. Буква «Ч» – чугун. Буква «Ш», стоящая в конце марки означает шаровидную форму графита. Остальные буквы означают легирующие элементы, а числа, следующие за ними, соответствуют их процентному содержанию в чугуне.

Жаростойкие чугуны применяют для изготовления деталей контактных аппаратов химического оборудования, работающих в газовых средах при 0 температуре 900-1100 С.

Коррозионностойкие чугуны.

Коррозионностойкие чугуны, обладают высокой стойкостью в газовой, воздушной и щелочных средах. Их применяют для изготовления деталей узлов трения, работающих при повышенных температурах.

Примеры обозначения и расшифровки:

1.  СЧ15   –   серый   чугун, временное сопротивление при  растяжении 150Мпа.

2.  КЧ45-7  –   ковкий  чугун,  временное  сопротивление  при растяжении 450Мпа, относительное удлинение 7%.

3.  ВЧ70      –   высокопрочный чугун, временное сопротивление при растяжении 700 МПА

4.  АЧВ – 2 – антифрикционный высокопрочный чугун, номер 2.

5.  ЧН20Д2ХШ –  жаропрочный  высоколегированный чугун, содержащий никеля 20%, 2% меди, 1% хрома, остальное –  железо, углерод, форма графита – шаровидная

6.  ЧС17  –   коррозионностойкий  кремниевый  чугун,  содержащий  17% кремния, остальное –железо, углерод.

Определение :

Сталь –  сплав железа с углеродом, содержащий углерода не более 2,14%, а также ряд других элементов.

Классификация: 

Для правильного прочтения марки необходимо учитывать ее место в

классификации стали по химическому составу, назначению, качеству, степени раскисления.

– По химическому составу стали подразделяют на углеродистые и легированные.

– Стали по назначению делят на конструкционные, инструментальные и стали специального назначения с особыми свойствами.

– Стали по качеству классифицируют на стали обыкновенного качества, качественные, высококачественные и особо                             высококачественные.

– Классификация по степени раскисления. Стали по степени раскисления классифицируют на спокойные, полуспокойные и кипящие .

Таблица 1. – Классификация сталей

Стали по химическому составу
Углеродистые			Легированные
низкоуглеродистые (до 0,25% С),   среднеуглеродистые (0,25-0,6% С высокоуглеродистые (более  0,6% С)			низколегированную (с суммарным содержанием легирующих элементов до 2,5%), среднелегированную (от 2,5до 10%) и высоколегированную (свыше 10%).
По назначению
инструментальные		конструкционные
По качеству (содержанию вредных примесей)
Обыкновенного качества содержат до 0,06% S и 0,07% Р	Качественные до 0,035% S и 0,035% Р			Высококачествен- ные  не более 0,025% S и 0,025% Р	Особо высококачествен- ные  не  более  0,015%  S и 0,025% Р

 

Конструкционные стали – стали, предназначенные для изготовления различных деталей, узлов механизмов и конструкций.

    Инструментальные стали – стали, применяемые для обработки материалов резанием или давлением, а также для изготовления измерительного инструмента.

Специальные стали — это высоколегированные (свыше 10%) стали, обладающие особыми свойствами – коррозионной стойкостью, жаро – стойкостью, жаропрочностью, износостойкостью и др

Углеродистые стали

К углеродистым  сталям относят стали, не содержащие специально введенные легирующие элементы.

Конструкционные углеродистые стали.

Стали  углеродистые  обыкновенного  качества  (сталь  с  достаточно высоким содержанием вредных примесей S  и P) обозначают согласно ГОСТ 380-94.

Эти наиболее  широко  распространенные  стали  поставляют  в  виде проката  в  нормализованном  состоянии  и  применяют  в  машиностроении, строительстве и в других отраслях.

Углеродистые  стали  обыкновенного  качества  обозначают  буквами:

Ст  и  цифрами  от  0  до  6.  Цифры — это  условный  номер  марки.  Чем  больше число, тем больше содержание углерода, выше прочность и ниже пластичность.

Перед символом Ст указывают группу гарантированных свойств: А, Б,В.  Если указание о группе отсутствует, значит предполагается группа  А.

Например, СТ3; БСт4; ВСт2.

Сталь  обыкновенного  качества  выпускается  также  с  повышенным содержание  марганца  (0,8-1,1%  Mn)/  В  этом  случае  после  номера марки добавляется буква Г.   Например, БСТ3Гпс.

 После номера  марки стали указывают степень  раскисления:  кп – кипящая, пс – полуспокойная, сп – спокойная сталь.  

    Например, ВСт3пс.

Таблица 2. – Структура обозначения углеродистых сталей.

Группа стали	Обозначение	Номер стали	Степень раскисления	Категория
А	Ст	0	–	1, 2, 3
		1, 2, 3, 4	кп, пс, сп
		5, 6	пс, сп
Б	БСт	1, 2, 3, 4	кп, пс, сп	1, 2
		5, 6	пс, сп
В	ВСт	1, 2, 3, 4	кп, пс, сп	1, 2, 3, 4, 5
		5	пс, сп

 

Таблица 3. –Значение букв и цифр, употребляющихся при маркировке сталей обыкновенного качества.

Обозначение	Расшифровка обозначения
А	Группа сталей, поставляемая с гарантированными механическими свойствами. Обычно при обозначении сталей букву  А опускают.
Б	Группа сталей, поставляемая с гарантированным химическим составом.
В	Группа сталей, поставляемая с гарантированными химическими и механическими свойствами.
Ст	Сокращенное обозначение термина «сталь»
0 – 6	Условные марки стали.
Г	Наличие буквы Г после номера стали означает повышенное содержание марганца.
Кп	Сталь «кипящая», раскисленная только ферромарганцем.
Пс	Сталь «полуспокойная», раскисленная ферромарганцем и алюминием.
Сп	Сталь «спокойная», то есть полностью раскисленная.

 

Примеры обозначения и расшифровки:

1. БСТ2кп –  сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества, группы  Б, поставляемая с гарантированным химическим составом, номер 2,  кипящая.

2. СТ5Гпс –  сталь конструкционная обыкновенного качества , группы , поставляемая с гарантированными механическими свойствами, номер 5, содержание марганца до 1%, полуспокойная.

3. ВСт3сп – сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества, группы  В, поставляемая с гарантированным химическим составом и механическими свойствами, номер 3,  спокойная.

Обозначение углеродистых качественных конструкционных сталей

Качественная конструкционная сталь – сталь с заметно меньшим содержанием серы, фосфора и других вредных примесей. Обозначается согласно ГОСТ 1050-88.

Сталь  маркируют  двузначными  числами,  которые  обозначают  содержание углерода в сотых долях процента, и поставляют с гарантированными показателями  химического  состава  и  механических  свойств.  По  степени раскисления  сталь  подразделяют  на  кипящую  (кп),  полуспокойную  (пс), спокойную  (без  указания  индекса).  Буква  Г  в  марках  сталей  указывает  на повышенное содержание марганца (до 1%).

Примеры обозначения и расшифровки

1. Сталь 05кп –сталь конструкционная низкоуглеродистая, качественная, содержащая углерода 0,05%, кипящая.

2. Сталь  25  –  сталь  конструкционная  низкоуглеродистая, качественная содержащая углерода 0,25%, спокойная.
3. Сталь 60Г  –  сталь конструкционная среднеуглеродистая,  качественная, содержащая углерода 0,6%, арганца 1%, спокойная.

 

Автоматные стали

Обозначение автоматных сталей 

По ГОСТ 1414-75  эти стали маркируют буквой  А и цифрами, показывающими среднее содержание углерода в сотых долях процента.         Применяют следующие марки автоматной стали:  А12,А20, АЗО, А40Г.

Из  стали А12 готовят неответственные детали, из стали других марок  — более ответственные детали, работающие при значительных напряжениях и  повышенных давлениях. Сортамент автоматной стали предусматривает изготовление  сортового  проката  в  виде  прутков  круглого,  квадратного  и шестигранного сечений. Эти стали не применяют для изготовления сварных конструкций.

Примеры обозначения и расшифровка

АС12ХН  – сталь автоматная легированная, низкоуглеродистая, содержащая 0,12 % углерода, 1% хрома и никеля.

Котельные стали.

Стали листовые для котлов и сосудов, работающих под давлением, применяют для изготовления паровых котлов, судовых топок,

камер горения газовых турбин и других деталей. Они должны работать при переменных давлениях и температуре до 450″С. Кроме того, котельная сталь должна хорошо свариваться. Для получения таких свойств в углеродистую сталь вводят технологическую добавку (титан) и дополнительно раскисляют ее алюминием. Выпускают следующие марки углеродистой котельной стали 12К, 15К, 16К, 18K.20K.22Kc содержанием в них углерода от 0,08 до 0,28%.

Эти  стали  поставляют  в  виде  листов  с  толщиной  до  200  мм  и  поковок  в состоянии после нормализации и отпуска.

 

Инструментальные углеродистые стали.

Обозначение инструментальных углеродистых сталей

Инструментальный углеродистые стали, маркируют в соответствии с ГОСТ1435-90.

Инструментальные  углеродистые стали выпускают следующих марок:

У7.У8ГА.У8Г, У9, У 10, У 11, У 12 и  У 13. Цифры указывают на содержание углерода в десятых долях процента. Буква Г после цифры означает, что сталь имеет повышенное содержание марганца. Марка инструментальной углеродистой стали высокого качества имеет букву А.

Примеры обозначения и расшифровки 

1. У12 – сталь инструментальная, высокоуглеродистая, содержащая 1,2% углерода, качественная.

2. У8ГА –  сталь  инструментальная,  высокоуглеродистая, содержащая 0,8% углерода,   1% марганца, высококачественная.

3. 3. У9А – сталь инструментальная, высокоуглеродистая, содержащая 0,9% углерода, высококачественная.

 

Легированные стали.

 Легированной называют сталь со специально введенным одним или более легирующим элементом.

Обозначение легированных сталей 

Легированные стали маркируются комбинацией цифр и заглавных букв алфавита. В обозначении нет слова «сталь» или символа «Ст». Например, 40Х, 38ХМ10А, 20Х13. Первые две цифры обозначают содержание углерода  в сотых долях процента. Следующие буквы являются сокращенным  обозначением элемента. Цифры, стоящие после букв, обозначают содержание этого элемента в  целых процентах. Если за буквой не стоит  цифра, значит содержание этого элемента до 1%.

Таблица 4. – Обозначение элементов марка.

Ю-АI Алюминий	C-Si Кремний	A-N Азот
Р-В Бор	Г- Mn Марганец	Д –Cu Медь
Ф-V Ванадий	М-Мо Молибден	Е-Se Селен
В-W Вольфрам	Н-Ni Никель	Ц-Zr Цирконий
Ж-Fe Железо	T-Ti Титан	Б-Nb Ниобий
К- Co Кобальт	Та – Тантал	Х- хром

 

Для изготовления измерительных инструментов применяют X, ХВГ.

Стали для штампов: 9Х, Х12М, 3Х2Н8Ф.

Стали для ударного инструмента: 4ХС, 5ХВ2С.

Обозначение быстрорежущих сталей

Все  быстрорежущие  стали  являются  высоколегированными.  Это  стали  для оснащения рабочей части резцов, фрез, сверл и т.д.

Маркировка  быстрорежущих  сталей  всегда  начинается  с  буквы  Р  и  числа, показывающего содержание  вольфрама в процентах. Наиболее распространенными марками являются Р9, Р18, Р12.

Легированные стали с особыми свойствами.

1. Коррозионностойкие стали.  Коррозионностойкой (или нержавеющей) называют  сталь,  обладающую  высокой  химической  стойкостью  в агрессивных средах. Коррозионностойкие стали получают легированием низко-  и среднеуглеродистых сталей хромом, никелем, титаном, алюминием, марганцем.  Антикоррозионные свойства сталям придают  введением в них большого количества хрома или хрома и никеля. Наибольшее распространение получили хромистые и хромоникелевые стали.

Например, хромистые стали 95Х18, 30Х13, 08Х17Т.

Хромоникелевые  нержавеющие  имеют  большую  коррозийную  стойкость, чем хромистые стали, обладают повышенной прочностью и хорошей технологичностью в отношении обработки давлением.

Например, 12Х18Н10Т, 08Х10Н20Т2.

2. Жаростойкие обладают стойкостью против химического разрушения в газовых средах, работающие в слабонагруженном состоянии.

Жаропрочные стали  – это стали, способные выдерживать механические нагрузки без существенных деформаций при высоких температурах. К числу жаропрочных относят стали, содержащие хром, кремний, молибден, никель и др.

Например, 40Х10С2М, 11Х11Н2В2МФ.

3.Износостойкие – стали, обладающие повышенной стойкостью к износу:

шарикоподшипниковые, графитизированные и высокомарганцовистые.

Особенности обозначения подшипниковых сталей.

Маркировка начинается с буквы Ш, цифра, стоящая после буквы Х, показывает содержание хрома в десятых долях процента.

Например, ШХ9, ШХ15ГС. 

Примеры обозначения и расшифровки

1. 40ХГТР – сталь конструкционная, лкгированная, качественная, содержащая 0,4% углерода и по 1% хрома, марганца, титана, бора, остальное – железо и примеси.
2. 38Х2МЮА – сталь конструкционная, легированная, высококачественная, содержащая 0,38% углерода, 2% % хрома, 1%   молибдена, алюминия, остальное- железо и примеси.
3. ХВГ – сталь конструкционная, легированная, качественная,  содержащая 1% углерода и по 1% хрома, марганца, остальное – железо и примеси.
4. ШХ15 – сталь подшипниковая, инструментальная, качественная, содержащая 1% углерода, 1,5% хрома, остальное-железо.

5. Р10К5Ф5 – сталь быстрорежущая, инструментальная, качественная,  содержащая 1% углерода, 10% вольфрама, 5% кобальта, 5% ванадия, остальное-железо.

 

 

 

 

 

Ковкий чугун | Литейные сплавы, их свойства и приготовление

Ковкий чугун представляет собой сплав железа с углеродом, в котором содержится 2,2—3,0 % углерода, 1,1—1,3% кремния, 0,3—0,6% марганца, до 0,2% фосфора и до 0,1% серы. Название «ковкий» следует понимать лишь в том смысле, что этот чугун по сравнению с серым является более вязким и пластичным. Благодаря этим свойствам ковкий чугун широко применяют для изготовления машиностроительных деталей, испытывающих в работе ударные нагрузки.

Ковкие чугуны для отливок по ГОСТ 1215—59 (см. табл. 1) изготовляют следующих марок: КЧ 30—6, КЧ 33—8, КЧ 35—10, КЧ 37—12, КЧ 45—6, КЧ 50—4, КЧ 56—4, КЧ 60—3, КЧ 63-2. Условные обозначения марок: К — ковкий; Ч — чугун; первые две цифры — предел прочности при растяжении в кгс/мм², а последняя цифра — относительное удлинение в процентах. Большинство технологических операций (изготовление форм и стержней, заливка расплава, выбивка и очистка отливок) в литейных цехах ковкого чугуна осуществляют обычными способами. При формовке изменяют лишь способ подвода расплава к отливке и устройство литниково-питающей системы. Следует, однако, иметь в виду, что производство отливок из ковкого чугуна более сложно и длительно, чем из серого. Так как в вагранке получить чугун с низким (менее 3%) содержанием углерода очень трудно, то плавку обычно проводят последовательно в двух печах. Шихту расплавляют в вагранке, а полученный в ней жидкий чугун переливают в дуговую электрическую печь и уже там доводят до требуемого химического состава. Полученный расплав разливают в песчаные формы. Низкое содержание кремния и углерода приводит к образованию в отливках белого чугуна, обладающего большой твердостью и хрупкостью, обусловленной присутствием в основе чугуна цементита (рис. 15, а).

Таблица 1. Физические, технологические и механические свойства литейных сплавов

Сплав	Плотность, г/см3	Усадка линейная, %	Температура заливки, °С	Предел прочности при растяжении, к гс/мм2	Относительное удлинение, %	Твердость НВ
Серый чугун (обыкновенный)	7,0—7,3	0,8—1,0	1180—1450	12—44	28—64*	143—289
Ковкий чугун	7,1—7,4	1,4-1,6	1350—1480	30—63	2—12	163—269
Сталь литая углеродистая	7,7—7,85	1,6—2,0	1350—1570	40—60	10—24	109—199
Бронза	7,4—8,9	1,3-2,4	1000—1200	3—60	2—20	14—250
Латунь	8,3—8,6	1,9—2,0	1050—1150	15—70	4—20	30—160
Алюминиевые сплавы	2,5—2,9	1,25—1,35	690—780	12—35	0,5—15	45—95
Магниевые сплавы	1,7—1,85	1,35—1,6	690—800	9—28	1—6	30—75

* Предел прочности при изгибе, кгс/мм².

После выбивки из форм и очистки отливки подвергают отжигу при температуре 900— 1000° С в специальных томильных печах. При отжиге цементит белого чугуна разлагается на феррит и свободный углерод, в результате чего исчезает свойственная белому чугуну хрупкость и он становится пластичным. При распаде цементита объем чугуна несколько увеличивается, отчего отливки во время отжига деформируются (коробятся). Если коробление достигает значительной величины, то отливки правят под прессом или ударами молота.

На рис. 15, б показана схема структуры наиболее распространенного ферритного ковкого чугуна, который характеризуется темным цветом излома и используется при производстве деталей сельскохозяйственных машин, ответственных автомобильных деталей, деталей тормоза и т. д.

Рис. 15. Структуры белого (а) и ковкого (б) чугуна: 1 — цементит, 2 — феррит, 3 — углерод отжига

Чугун ковкий

Рекомендуемые марки чугуна	Детали	Условия работы
Автомобилестроение
	Картер редуктора заднего моста, дифференциала, руля; ступицы колес, крон­штейны двигателя, рессор, тормозные колодки, на­кладки; балансиры, катки, барашки, пробки	Сложные переменные динамические (ударные) нагрузки
КЧ 45-7; КЧ 50-5; КЧ 55—4	Ступицы колес, тормозные барабаны, крышки под­шипников коленчатого вала, картеры распределитель­ной коробки, редуктора заднего моста, втулки	Статические и динамиче­ские нагрузки, износ
КЧ 60—3; КЧ 65—3; КЧ 70—2; КЧ 80-1,5	Шатуны, поршни, шестер­ни, коленчатые валы	Высокие статические и динамические нагрузки, износ
Сернистый перлитный чугун	Распределительные валы, направляющие втулки кла­панов, заготовки для на­плавки толкателей	Сильный износ
Обезуглероженный чу­гун	Сварные конструкции — выхлопные коллекторы, карданные валы, крон­штейны и др.	Статические и динамиче ские нагрузки
Тракторное и сельскохозяйственное машиностроение
КЧ 30-3; КЧ 33-8; КЧ 35—10; КЧ 45—7	Шестерни, муфты, храпо­вики, рычаги, звездочки, собачки, ступицы, вилки валов, катки, кронштейны, втулки, звенья цепей, клю­чи, барашки и др.	Изгибающие, скручиваю­щие, растягивающие ста­тические и динамические нагрузки, износ
Вагоностроение и судостроение
КЧ 33-8; КЧ 35—10; КЧ 37—12; КЧ 45—7	Детали воздушных тормо­зов, кронштейны, скобы, иллюминаторные кольца	Изгиб, ударные нагрузки износ
Электропромышленность
КЧ 35—10; КЧ 45-7	Державки проводов, шап­ки, крючья изоляторов, клеммы и др.	Изгиб, ударные нагрузки
Станкостроение, текстильное машиностроение
КЧ 35-10; КЧ 45—7; АКЧ-1; АКЧ-2	Втулки, вилки, шестерни, банкоброши и др.	Износ, статические идинамические нагрузки
Санитарно-техническое и строительное оборудование
КЧ 33—8; КЧ 35—10 Обезуглероженный чу­гун	Фиттинги, вентили, уголь­ники, радиаторные нип­пели, кронштейны, пневмо­корпуса и др.	Внутреннее давление до 2 МПа

Ковкий чугун

Ковкий чугун получают графитизирующим отжигом белого чугуна определенного состава по содержанию основных элементов и примесей.

В зависимости от режима термической обработки структура ковкого чугуна может состоять из феррита + углерод отжига, перлита или других продуктов распада аустенита (сорбита, троостита, игольчатого троостита, мартенсита и т.п.) + углерод отжига.

Ковкий чугун, полученный путем обезуглероживающего отжига, со структурой феррита в поверхностном слое и перлита + углерод отжига в сердцевине сечений отливки, в настоящее время утратил промышленное значение и не рассматривается.

Графитизация белого чугуна происходит при специальной термической обработке – отжиге.

Для получения ферритного и перлитного ковкого чугуна отжиг отливок ведут в нейтральной среде; основным процессом является графитизация, а обезуглероживание имеет ограниченные размеры и происходит попутно.

При отжиге отливок в защитной атмосфере наружный обезуглероженный и следующий за ним слой со структурой перлита отсутствует.

Свойства ферритного ковкого чугуна зависят от содержания углерода и кремния.

При конструировании рекомендуется ограничивать размеры сечений в отливках при плавке двойным процессом вагранка – электропечь – 30-40 мм, при плавке в вагранке – 20-30 мм. При модифицировании исходного белого чугуна присадками теллура и особенно магния максимальный размер сечений отливок может быть значительно увеличен – до 100-120 мм.

Минимальная толщина сечений отливок из ковкого чугуна в зависимости от их конфигурации и состава чугуна принимается в пределах 2,5-8 мм.

Усадка белого чугуна зависит от содержания в нем углерода.

В таблице 30 приведены размеры объемной усадки стали, белого и серого чугуна при перегреве расплавленного сплава на 100оС, в таблице 31 – величина линейной усадки в твердом состоянии.

Вследствие большего модуля упругости и меньшей теплопроводности величина напряжений в отливках белого чугуна значительно выше, чем в отливках серого чугуна, а вследствие меньшей прочности и теплопроводности – больше, чем в стальных отливках. Поэтому при проектировании следует предпочитать конструкции со свободной усадкой и избегать резких переходов между различными сечениями отливки, вызывающих концентрацию напряжений и пониженную усталостную прочность.

Таблица 30. Объемная усадка в %

Сплав	В жидком состоянии	При затвердевании	Общая
Сталь	1,6	3	4,6
Белый чугун*	2-2,3	4,6-3	6,6-5,3
Серый чугун	2,5	0,9	1,4

 * В зависимости от содержания углерода

Таблица 31. Линейная усадка в %

Сплав	Доперлитная	Перлитная	Полная в твердом состоянии
Сталь	1,2	1	2,2
Белый чугун*	0,3	1	1,3
Серый чугун	0	1	1

 Остаточные напряжения в отливках из ковкого чугуна вследствие длительной термической обработки значительно меньше, чем в отливках из стали и серого чугуна, и не превышают 0,5 кГ/мм2.

При термической обработке отливки ковкого чугуна увеличиваются в объеме в зависимости от содержания углерода (примерно на 50% от величины усадки).

Сопротивление статистическими нагрузками. Механические свойства ковкого чугуна зависят от свойств основной металлической массы, принимающей на себя почти все силовое поле и в меньшей мере ослабленной включениями графита по сравнению с серым чугуном. Прочность графита очень мала, и площадь его включений обычно исключается при расчетах (таблице 32)

32. Влияние включений графита на силовое поле в чугуне

Показатель	Серый чугун	Ковкий чугун
Уменьшение площади основной металлической массы а = Ест / Ечуг	До 3	1,15
Надрезающие действия включений графита B = σст / σчуг	1,2-2	1,15-1,6

 Главное преимущество ковкого чугуна по сравнению с серым заключается в его пластичности. Диаграммы деформацией при растяжении образцов различных сортов ковкого чугуна характеризуют его упругие и пластические свойства. Так как область текучести незначительна, при испытаниях ковкого чугуна определяют условный предел текучести σ_0,2.

Общая зависимость предела прочности при растяжении σ_в от относительного удлинения δ ковкого чугуна различна для его отдельных сортов.

Для ферритного ковкого чугуна увеличение σ_в всегда связанно с увеличением пластичности. Предела пропорциональности изменяется с изменением величины предела прочности при растяжении; соотношение этих величин

σ_пц / σ_в = 0,65 / 0,75

В соответствии с малой изменяемостью структурных составляющих ферритного ковкого чугуна – графита и феррита – механические его свойства могут быть надежно улучшены главным образом снижением содержания углерода и практически не зависят от изменений величины включений графита.

Таблица 33. Марки и механические свойства ковкого чугуна

Марки ковкого чугуна	Временное сопротивление разрыву в кГ/мм2 (не менее)	Относительное удлинение в % (не менее)	Твердость НВ (не менее)
КЧ 30-6 КЧ 33-8 КЧ 35-10 КЧ 37-12 КЧ 45-6 КЧ 50-4 КЧ 56-4 КЧ 60-3 КЧ 63-2	30 33 35 37 45 50 56 60 63	6 8 10 12 6* 4 4 3 2	163 163 163 163 241 241 269 269 269

 * С согласия заказчика допускается понижение относительного удлинения на 3%.

По ГОСТ 1215-59 ковкий чугун подразделяется по маркам (таблица 33)

Перлитный ковкий чугун является одним из прочных сортов чугуна и по структурному составу и механическими свойствами близко подходит к стали; с увеличением σ^в относительное удлинение снижается.

Количество связанного углерода в перлитном ковком чугуне изменяется в пределах 0,3-0,8% в зависимости от температуры нормализации, скорости охлаждения и условий термической обработки области эвтектоидных превращений.

Эти факторы определяют и структуру основной металлической массы перлитного ковкого чугуна, которая может меняется от пластинчатого и зернистого перлита до сорбита, мартенсита, а в некоторых случаях и с дисперсными включениями цементита.

Дальнейшее улучшение свойств перлитного ковкого чугуна достигается его легированием и модифицированием, присадками титана, алюминия, бора, висмута или сурьмы в различных сочетаниях.

Присутствие феррита в структуре перлитного ковкого чугуна ухудшает его свойства, так как влечет за собой резкое снижение прочности (σ_в) при незначительном увеличении пластичности (δ). Когда основная металлическая масса чугуна становится перлитной, незначительное снижение пластичности при стабилизации, сфероидизации и пр. приводит к значительному увеличению прочности.

Особое место занимает термически улучшенный ковкий чугун, закаленный и отпущенный, отличающийся высокой однородностью свойств как в отдельных сечениях, так и во всей партии.

Сопротивление динамическим нагрузкам. Динамические свойства качественного ферритного ковкого чугуна характеризуются следующими данными. Ударная вязкость при сечении образца 10Х10 мм с клиновым вырезом глубиной 2 мм а_н = 2кГ*м/см², при вырезе глубиной 5 мм с радиусом закругления 0,5 мм а_н = 0,8кГ*м/см². Динамическая вязкость (предел выносливости) σ_-1 = 17 кГ/мм². Отношение предела выносливости к пределу прочности при растяжении

σ_-1 / σ_вр = 0,5

Ударная вязкость резко снижается при появлении белого интеркристаллитного излома, которого можно избежать весьма ускоренным или очень замедленным охлаждением после отжига в интервале температур 650-450^оС

Предел выносливости ферритного ковкого чугуна в 1,2-2 раза меньше, чем стали, и в 4-6 раз больше чем серого чугуна; он зависит от асимметричности нагрузок и повышается при отрицательных величинах средних напряжений. Поэтому отливки, работающие при повторно-переменных растягивающее – сжимающих усилиях, следует подвергнуть предварительному сжатию без растягивающих напряжений при периодических нагружениях.

Предел выносливости ферритного ковкого чугуна равен 12-16 кГ/мм² и специальных малоуглеродистых легированных перлитных ковких чугунов 30-35 кГ/мм².

Состояние поверхности ковкого чугуна оказывает влияние на величину предела выносливости, чем у стали. Удаление поверхностного слоя ферритного чугуна повышает динамическую вязкость на 15-25% (таблица 34)

Таблица 34. Относительное влияние механической обработки на свойства ковкого чугуна

Состояние поверхности	Статистические свойства		Динамические свойства
	σв	δ	ан	σ-1
Литая	1	1	1	1
Механически обработанная	0,95	0,3	0,75	1,3

 Коэффициенты усталостной прочности для железоуглеродистых сплавов при различных видах нагрузок даны в таблице 35.

Таблица 35. Коэффициенты усталостной прочности

Напряжения	Сталь	Ковкий чугун	Серый чугун
σ-1 σ-1p t-1k	1.00 0.70 058	1.00 0.60 0.70	1.00 0.50 0.80

Примечание. Ковкий чугун превосходит сталь при кручении, а серый чугун при растяжении – сжатии.

Технологические свойства. Обрабатываемость ковкого чугуна зависит от структуры основной металлической массы и от включений графита. Наличие промежуточного перлитного слоя под наружной ферритной оболочкой определяет толщину первой стружки в 1,5-2,0 мм.

Обрабатываемость ферритного ковкого чугуна весьма высока; включения графита оказывают смазывающее действие и дробят стружку.

Обрабатываемость перлитного ковкого чугуна уступает обрабатываемости ферритного и определяется степенью однородности и дисперсности структуры основной металлической массы. Так, обрабатываемость чугуна со сфероидизированной структурой перлита и даже цементита вполне удовлетворительна, несмотря на повышенную твердость.

Износостойкость и антифрикционные свойства ковкого чугуна определяются структурой, условиями трения и величиной зазоров.

Наиболее благоприятной структурой обладает перлитный ковкий чугун, при отсутствии в нем изолированных включении графита, окруженных ферритной отсрочкой.

Коэффициент трения перлитного ковкого чугуна равен при жидкостном трении 0,05-0,10 и при сухом 0,30-0,45.

Втулки из этого чугуна работают на металлорежущем оборудовании при pv=50, на металлодавящем оборудовании при pv = 120, на тракторах при рv= 160 кГ/см²*сек.

Зазоры между валом и втулками по сравнению с бронзовыми увеличиваются на 10-15%.

Ферритный ковкий чугун применяется при малых давлениях (рv ≤ 20 кГ/см²*сек), особенно при малых скоростях и работе со смазкой.

Обработанные поверхности ферритного чугуна корродируют быстрее, чем перлитного чугуна и стали. Стойкость поверхности ковкого чугуна повышается применением диффузионных покрытий: фосфатированием, бесщелочным оксидированием, пассивированием и пр.

При контактной коррозии ковкий чугун обнаруживает пониженный, положительный электродный потенциал.

Ковкий чугун, особенно ферритный, хорошо поддается запрессовке, расчеканке и легко заполняет зазоры.

Прочность запрессовки втулок из ковкого чугуна при одном и том же натяге выше по сравнению с латунным на 50%.

Механические и физические свойства ковкого чугуна. В таблице 36 приведены основные характеристики наиболее часто применяемых марок ковкого чугуна применительно к следующим исходным условиям: толщина стенок 10 мм; поверхность обработанная, форма сечения при изгибе прямоугольная, при прочих нагрузках любая; рабочая температура 20^оС.

В условиях, отличных от перечисленных, значения характеристик получаются умножением данных таблицы 36 на коэффициент массы К_м, поверхности К_п, формы К_ф, температуры К_t , причем влияние температур учитывается только в условиях их отрицательного действия. Поправочный коэффициент для усталостных характеристик учитывает только характер поверхности.

Нормы прочности приведены для обработанных разрывных образцов. Поправочные коэффициенты приведены в таблице 36. В таблице 37  приведены примеры применения ковкого чугуна.

Упругие свойства ковкого чугуна определяются из основных данных таблиц – модулями нормальной упругости Е и сдвига G и коэффициентом Пуассона u. Величины же пластических деформаций и условного модуля упругости находятся по соответствующим графам таблицы. При этом учитывается, что при многократных повторных нагрузках пластические деформации уменьшаются и остаются почти одни упругие деформации.

Поправочный коэффициент для усталостных характеристик учитывает только характер поверхности. По влиянию массы, формы сечения и температуры проверенные данные отсутствуют.

Физические свойства определяются из таблицы с поправками на температуру К_t. Например, коэффициент линейного расширения в интервале до 500^оС определяется выражением

а₀⁵⁰⁰ = а₀¹⁰⁰ [1 + К_t (T – 100 = 10.8 * 10^-в [1 + 0,00072 (500-100) ] = 14 * 10^-в

Данные таблицы являются минимальными для ковкого чугуна соответствующей марки, гарантийными, и могут быть использованы для расчета деталей.

Общий объем применения ковкого чугуна в машиностроении относительно невелик и составляет около 3% от применяемых отливок из железоуглеродистых сплавов. Главной причиной этого являются технологические затруднения в процессе производства отливок, необходимость применения длительной термической обработки и ограниченная величина допускаемых размеров сечений отливок, сложность операций поверхностного упрочнения и операций сварки.

Таблица 30. Объемная усадка в %

Сплав	В жидком состоянии	При затвердевании	Общая
Сталь	1,6	3	4,6
Белый чугун*	2-2,3	4,6-3	6,6-5,3
Серый чугун	2,5	0,9	1,4

 

* В зависимости от содержания углерода

Таблица 31. Линейная усадка в %

Сплав	Доперлитная	Перлитная	Полная в твердом состоянии
Сталь	1,2	1	2,2
Белый чугун*	0,3	1	1,3
Серый чугун	0	1	1

 

Таблица 32. Влияние включений графита на силовое поле в чугуне

Показатель	Серый чугун	Ковкий чугун
Уменьшение площади основной металлической массы а = Ест / Ечуг	До 3	1,15
Надрезающие действия включений графита B = σст / σчуг	1,2-2	1,15-1,6

Таблица 33. Марки и механические свойства ковкого чугуна

Марки ковкого чугуна	Временное сопротивление разрыву в кГ/мм2 (не менее)	Относительное удлинение в % (не менее)	Твердость НВ (не менее)
КЧ 30-6 КЧ 33-8 КЧ 35-10 КЧ 37-12 КЧ 45-6 КЧ 50-4 КЧ 56-4 КЧ 60-3 КЧ 63-2	30 33 35 37 45 50 56 60 63	6 8 10 12 6* 4 4 3 2	163 163 163 163 241 241 269 269 269

* С согласия заказчика допускается понижение относительного удлинения на 3%.

Таблица 34. Относительное влияние механической обработки на свойства ковкого чугуна

Состояние поверхности	Статистические свойства		Динамические свойства
	σв	δ	ан	σ-1
Литая	1	1	1	1
Механически обработанная	0,95	0,3	0,75	1,3

 

Таблица 35. Коэффициенты усталостной прочности

Напряжения	Сталь	Ковкий чугун	Серый чугун
σ-1 σ-1p t-1k	1.00 0.70 058	1.00 0.60 0.70	1.00 0.50 0.80

Примечание. Ковкий чугун превосходит сталь при кручении, а серый чугун при растяжении – сжатии.

Таблица 36. Основные характеристики ковкого чугуна марок КЧ 35-10 и КЧ 37-12

Наименование свойства	Обозначение	Размерность	Марки чугуна
			КЧ 35-10	КЧ 37-12
Механические свойства
Растяжения
Предел текучести	σ0,2	кГ/мм2	22,0	23,0
Предел прочности	σв	кГ/мм2	33,2	35,0
Относительное удлинение	δ	%	9,0	10,8
Относительное сужение	ψ	%	11,0	13,0
Кручения
Предел текучести	t0.4	кГ/мм2	15,0	16,0
Предел прочности	tв	кГ/мм2	35,0	37,0
Относительный угол закручивания	t	–	23,0	25,0
Сжатия
Предел текучести	σ0сж	кГ/мм2	24,0	25,0
Изгиб
Предел текучести	σ 0,2 И	кГ/мм2	34,0	35,0
Предел прочности	σви	кГ/мм2	57,0	58,0
Предел прочности	tв ср	кГ/мм2	30,0	30,0
Другие механические и физические свойства
После отжига	ан	кГ * м/см2	1,4	1,6
Предел выносливости при изгибе	σ-1	кГ/мм2	14,0	14,0
Предел выносливости при растяжении-сжатии	σ-1 р	кГ/мм2	8,0	8,0
Предел выносливости при кручении	t-1	кГ/мм2	13,0	13,0
Твердость НВ	НВ	кГ/мм2	163	163
Модуль нормальной упругости	Е	кГ/мм2	16 600	17 000
Коэффициент Пуассона	u	–	0,27	0,25
Удельный вес	y	Г/см3	7,22	7,21
Коэффициент линейного расширения	а0-100оС	см/см * град	10,2	10,0
Теплопроводность	λ	кал/см * сек * оС	0,150	0,150
Теплоемкость	с	кал/Г * оС	0,122	0,122
Электросопротивление	р	мк * ом * см3	36,0	38,0
Магнитная индукция	В25 В50 В100 Вr	гс	12 000 13 500 14 600 5 500	12 300 13 800 14 600 5 500
Остаточная коэрцитивная сила	Нс	э	1,3-3,0	1,3-3,0
Химический состав (примерный)
Углерод	C	%	2.3-2.0	2.2-2.5
Марганец	Mn	%	0.3-0.5	0.3-0.5
Кремний	Si	%	1.1-1.3	1.2-1.4
Сера	S	%	0.12	0.12
Фосфор	P	%	0.12	0.12
Хром	Cr	%	0.06	0.026
Критические точки в оС
–	Ас1	oC	685	790
–	Ас3	oC	815	820
–	Аr1	oC	725	730
–	Ar3	oC	760	765

 

Поправочные коэффициенты к основным характеристикам ковкого чугуна
1. Коэффициенты литой поверхности R_n для всех марок ковкого чугуна
σ_Т – 1,05
δ – 1,1
а_н – 1,3
σ^-1 – 0,75
2. Физические константы для всех марок ковкого чугуна:
а -100 +0,0007
С +0,0005
λ -0,00024 +0,0025
3. Температурные коэффициенты Кt ( для σ_Т):

t oC	КЧ 35-10	КЧ 37-12
200-100	1,0	1,0
300	0,95	0,98
500	0,78	0,85

 

Таблица 37. Примеры применения ковкого чугуна в различных отраслях промышленности

Отросоль машиностроения	Детали	Условия работы	Рекомендуемые марки чугуна
Сельскохозяйственное	Шестерни, звенья цепей, собачки, пальцы, ключи, гребни, головки ножей и т.д.	Статистические и динамические нагрузки	КЧ 30-6
Текстильное	Банкаброши, желоньеры и т.п.	Статистические и динамические нагрузки	КЧ 30-6
Автомобильное и тракторное	Картеры – заднего моста, дифференциала, руля, ступицы колес, кронштейны двигателя, рессор, тормоза, тормозные колодки, педали, накладки, пробки, балансиры, катки, втулки	Сложные переменные динамические нагрузки Износ	КЧ 35-10 КЧ 30-6 КЧ 45-6
Вагоностроение	Детали тормозов, подшипника, кронштейны, тяговые сцепления, скобы и т.д.	Внутреннее давление, ударные нагрузки	КЧ 35-10 КЧ 30-6
Судостроение	Иллюминаторы, кронштейны и т.д.	Изгиб, ударные нагрузки	КЧ 35-10 КЧ 30-6
Станкостроение	Втулки	Износ	КЧ 45-6 КЧ 50-4
Санитарное строительство, водо -, газо – и паропроводная арматура	Фитинги, вентили, радиаторные ниппели, пневматические корпуса и т.д.	Внутреннее давление до 20 ат	КЧ 30-5

 

генов | Бесплатный полнотекстовый | Идентификация и характеристика изоформ транскрипта IRX4 с альтернативным сплайсингом при раке простаты

1. Введение

Альтернативный сплайсинг (AS) в мРНК-предшественнике играет жизненно важную роль в регуляции экспрессии генов за счет увеличения кодирующей способности геномов. Разнообразные комбинации сайтов сплайсинга и альтернативных промоторов в пре-мРНК выбираются для получения структурно различных мРНК и, таким образом, изоформ белков, которые варьируются от слегка отличающихся до имеющих противоположные функции [1].Были идентифицированы различные механистические режимы AS, такие как пропуск экзонов, сохранение интронов, альтернативные сайты сплайсинга 5 ‘/ 3’, альтернативные промоторы, альтернативные сайты полиаденилирования и изменения в сплайсосомах [1]. Помимо вклада в большее разнообразие протеома, AS ведет ко всем признакам прогрессирования рака [2]. Результаты недавних исследований предсказывают, что огромная гетерогенность рака человека может быть результатом различных ролей изоформ протеазы, возникающих в результате AS [3].Сообщалось, что AS изменяет сеть белковых взаимодействий разрушительным, нерегулируемым образом, тем самым нарушая нормальную функцию клеток через посредство путей, управляемых раком [2]. Кроме того, AS может индуцировать деградацию транскриптов супрессоров опухолей путем распада, не опосредованного смыслом, или индуцировать мутации в сайтах сплайсинга, таким образом сохраняя интроны в супрессорах опухолей [2]. AS может значительно изменить кодирующую область белков-мишеней лекарств, что приводит к устойчивости к лекарствам и терапии во многих случаях рака [4].Хотя активность факторов транскрипции чрезвычайно и скоординированно регулируется во время роста и дифференцировки эмбриона, AS может изменять регуляцию транскрипции и может переключать клетки с физиологической на патологическую трансформацию [5]. В 2020 году рак предстательной железы (РПЖ) был вторым по частоте диагностированием. и пятая по значимости причина смертности от рака среди мужчин во всем мире [6]. Альтернативный сплайсинг играет важную роль в РПЖ, регулируя злокачественное прогрессирование, агрессивность, пластичность клонов опухолевых клеток и устойчивость к терапии [7,8].Хотя сплайсинг андрогенных рецепторов (AR) хорошо изучен при РПЖ, сведения об АС других онкогенов РПЖ недостаточны [9]. Непрерывные попытки понять и перевести знания в области АС на РПЖ могут ускорить открытие новых диагностических и терапевтических целей для улучшения ухода за пациентами с РПЖ. член семейства генов гомеобокса [10]. Гены семейства гомеобоксов в основном действуют как факторы транскрипции и обнаруживаются почти во всех многоклеточных организмах [11].Они играют решающую роль в регуляции многих аспектов эмбрионального развития, включая формирование паттернов [11]. Гены IRX человека homo sapiens состоят из шести членов и организованы в виде двух кластеров, содержащих по три гена каждый: кластер IRX1, 2 и 4 на хромосоме 5 и кластер IRX3, 5 и 6 на хромосоме 16, которые разделены большими межгенными областями [12]. . IRX4 расположен в локусе хромосомы 5p15.3 и был описан как наиболее дивергентный член семейства IRX [10,13]. Семейство генов гомеобокса IRX отличается от других генов гомеобокса дополнительным удлинением петли из 3 аминокислот (TALE) в их гомеодомене (63 аминокислоты) и 9-аминокислотным доменом (Iro-бокс) [12].Ген IRX4 экспрессируется в различных органах человека, включая развивающуюся центральную нервную систему, грудь, пищевод, кожу, простату и влагалище, но преимущественно экспрессируется в желудочках сердца [10]. IRX4 играет решающую роль в регуляции экспрессии гена, специфичного для камеры желудочков, путем запуска гена тяжелой цепи миозина-1 желудочков (VMHC1) и подавления гена тяжелой цепи миозина-1 предсердий (AMHC1) [14]. IRX4 поддерживает сократительную функцию сердца и играет защитную роль при кардиомиопатии, гипертрофии сердца и врожденных пороках сердца [15,16].Кроме того, экспрессия IRX4 была идентифицирована в сетчатке как критический регулятор экспрессии Slit1 [17]. В недавних исследованиях было высказано предположение, что далеко за пределами его физиологической роли дифференциальная экспрессия и онкогенная роль IRX4 была высказана. Сообщалось о высоких уровнях IRX4 в образцах плазмы рака молочной железы, что указывает на потенциал IRX4 в качестве биомаркера рака молочной железы [18]. Было обнаружено, что экспрессия IRX4 подавляется в популяции мезенхимальных клеток по сравнению с эпителиальными клетками при раке груди [19].Сверхэкспрессия IRX4 стимулирует пролиферацию клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и напрямую связана с общей выживаемостью пациентов [20]. Было обнаружено, что область промотора IRX4 часто гиперметилирована при раке поджелудочной железы, что обеспечивает преимущество для роста клеток при раке поджелудочной железы [21]. IRX4 был недавно идентифицирован как потенциальный ген-кандидат при РПЖ после того, как полногеномные исследования ассоциации (GWAS) обнаружили, что локус 5p15 связан с риском РПЖ. Многие исследования, проведенные Batra et al.[22], Wang et al. [23], Lindstrom et al. [24] и Qi et al. [25] идентифицировали ассоциацию SNP rs12653946 в 5p15, цис-eQTL IRX4, с риском РПЖ в многоэтнических популяциях. IRX4 был описан как опухолевый супрессор при РПЖ при взаимодействии с рецептором витамина D [26]. Сообщалось о дифференциальной роли IRX в микроокружении опухоли [27,28,29], что, возможно, предполагает их тканеспецифическую роль и / или их сплайсинг, которые влияют на уровень белка, тем самым изменяя функциональную способность нормальных клеток вызывать и противостоять множеству механизмов, связанных с прогрессированием опухоли.IRX4 – это человеческий мультиэкзонный фактор транскрипции, который, как сообщается, имеет альтернативный сплайсинг и высоко экспрессируется в РПЖ [26]. На сегодняшний день идентифицировано пять транскриптов IRX4, включая четыре предсказанных альтернативных промотора [26,30]. IRX4 имеет в основном два типа транскриптов, которые отличаются от присутствия дополнительного четвертого экзона, дополнительно разделенных на пять транскриптов, отличающихся только от области 5’UTR, и об экспрессии этих транскриптов сообщалось при РПЖ [26]. Предполагается, что в общей сложности пять транскриптов будут транслироваться в две изоформы белка IRX4, которые отличаются только наличием дополнительных 27 аминокислот, которые кодируются дополнительным четвертым экзоном (база данных UniProt), функциональная роль которого все еще неизвестна.В этой статье мы представляем разнообразие транскриптов IRX4 и экспрессию белка IRX4 в линиях клеток РПЖ и клинических образцах, поскольку изоформы белка IRX4 могут играть различную роль в прогрессировании РПЖ. Это исследование позволяет получить широкое представление о регуляции и механизмах онкогенеза простаты, которые в настоящее время очень ограничены.

2. Материалы и методы

2.1. Культура клеток

Панель клеточных линий РПЖ (LNCaP, VCaP, DuCaP, C42B, PC3, DU145, RWPE2, 22RV1) и клеточных линий доброкачественной простаты (BPh2, RWPE1) была приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, Вирджиния, США).Клеточные линии RWPE-1 и RWPE-2 выращивали в бессывороточной среде для кератиноцитов с добавлением 5 нг / мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF) и 50 мкг / мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота (Gibco ™, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). ), тогда как все другие клеточные линии выращивали в RPMI1640 (1X) без фенолового красного (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) с добавлением 5% или 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Life Technologies, Thornton, NSW, Австралия). Клеточные линии были подтверждены профилированием коротких тандемных повторов (STR) и дали отрицательный результат на микоплазму.Клетки поддерживали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ .

2.2. Выделение РНК и синтез кДНК

Полную РНК экстрагировали из клеток РПЖ с использованием набора Isolate II RNA Mini Kit (Bioline, Лондон, Великобритания) в соответствии со стандартным протоколом. Концентрацию и чистоту РНК измеряли с помощью NanoDropTM1000 (Thermo Scientific, BiolaB, Scoresby, VIC, Австралия). Всего 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК SensiFast ^TM (Bioline, GmbH, Luckenwalde, Германия).КДНК разводили до 100 мкл перед использованием в качестве матрицы для реакции ПЦР.

2.3. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR)

Праймеры для RT-PCR и qRT-PCR были разработаны с использованием программы NCBI tool Primer BLAST – NCBI – NIH. Было разработано несколько наборов праймеров для распознавания границы между 2 экзонами (область, охватывающая экзон-экзон) для специфической идентификации экспрессии транскриптов IRX4. Все последовательности праймеров приведены в таблице S1. ОТ-ПЦР выполняли с реакцией, содержащей 1X буфер для ПЦР, 1.5 мМ MgCl ₂ , 0,2 мМ dNTP и 0,2 мкМ каждого из прямых и обратных праймеров (Sigma Aldrich, Castle Hill, Новый Южный Уэльс, Австралия), 1 ед. ДНК-полимеразы Platinum ™ Taq (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и 1 ед. мкл той матрицы кДНК. Реакцию ПЦР проводили на аппарате Mastercycler ^® nexus (Eppendorf, North Ryde, NSW, Australia). Образцы, смешанные с загрузочным красителем (NEB # B7024S), загружали на 0,7–2% агарозные гели (Bioline, Александрия, Новый Южный Уэльс, Австралия), приготовленные в буфере трис-борат-ЭДТА (TBE) (89 мМ трис-основания, 89 мМ бората). , 2 мМ ЭДТА), содержащий 0.5 мкг / мл бромистого этидия (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Приблизительно 0,5 мкг лестницы размером 1 т.п.н. (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) загружали для сравнения размеров продуктов ДНК. Изображения были получены с помощью системы документирования гелей QUANTUM ST5 (Fisher Biotec, Wembley, WA, Australia).

2.4. Относительная количественная оценка с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Количественная ОТ-ПЦР выполнялась с использованием системы ViiA7 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Каждая реакция содержала 1X конечную концентрацию SYBR Green PCR Master Mix 2X (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), прямой и обратный праймер 50 нМ, 2.0 мкл разбавленной кДНК (1: 5) и воды, свободной от нуклеаз, в конечном объеме 8 мкл. Параметры цикла были 95 ° C в течение 10 минут, 40 циклов при 95 ° C в течение 15 с и 60 ° C в течение 1 минуты с последующей стадией диссоциации. Все значения CT были нормализованы к экспрессии гена домашнего хозяйства RPL32 (ΔCT) [31]. Относительную экспрессию по сравнению с контролем проводили сравнительным методом CT (ΔΔCT).

2,5. Анализ депривации андрогенов

Клетки LNCaP, VCaP и DuCaP высевали в среду RPMI1640 (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) с добавлением 5% FBS и инкубировали при 37 ° C в течение 3 дней.Затем среду заменяли культурной средой, обедненной андрогенами (RPMI1640), содержащей 5% очищенную от угля сыворотку (CSS, Sigma-Aldrich, Castle Hill, Австралия). Через 48 часов в клетки в CSS добавляли 10 нМ дигидротестостерона (DHT), 10 нМ DHT + 10 мкМ антиандрогенов (бикалутамид или энзалутамид) и контрольный этанол (EtOH) и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов.

2.6. In Silico анализ транскриптов и изоформ IRX4

2.7. RNA-seq и данные генотипа для анализа cis-eQTL

В исследовании использовались данные RNA-seq (формат bam) 483 пациентов с РПЖ и 49 соответствующих контролей программы Атлас генома рака (TCGA) [33].RASflow использовали для анализа RNA-seq [34]. HISAT2, быстрая и чувствительная программа выравнивания, была выбрана для выравнивания с транскриптомом [35]; подсчет функций использовался при количественной оценке, а Deseq2 использовался при нормализации данных. Очищенные данные генотипов SNP риска РПЖ rs10866528 использовали для анализа цис-eQTL.

2,8. Повторная обработка данных LC-MS / MS клеточной линии PRIDE PCa

Файлы сырых данных LC-MS / MS экстрактов ядер клеток LNCaP были извлечены из базы данных Proteomics Identification Database (PRIDE), принадлежащей к ID проекта: PXD003262 [36].Все файлы были преобразованы в файлы пиков общего формата MASCOT (MGF) с использованием MSConvertGUI (версия 3) [37]. Затем все файлы пиков были найдены в SearchGUI (версия 3.3.17) и PeptideShaker (версия 1.16.43) по базе данных FASTA, содержащей новые пептидные последовательности IRX4, объединенные с эталонной базой данных UniProt для человека и примесными белками [38,39]. ИКС! Алгоритмы тандемного поиска были реализованы с использованием следующих параметров поиска: ошибка массы предшественника: 10 ppm, ошибка массы фрагмента: 0,05 Да, фиксированная модификация: карбамидометилирование цистеина, переменная модификация: окисление метионина, определенное как переменная модификация.Минимальная длина пептида составляла шесть аминокислот. 1% -ный коэффициент обнаружения (FDR) был установлен для идентификации конкретных триптических пептидов, представляющих каждую изоформу белка IRX4.

2.9. Секвенирование ДНК

Продукты ПЦР очищали с помощью геля Wizard ^® SV и системы очистки ПЦР (Promega, Мэдисон, США) и секвенировали с помощью AGRF (Gehrmann Laboratories, Research Rd, Университет Квинсленда, Брисбен, Австралия). Всего было отправлено 11 мкл очищенных продуктов ПЦР с 1 мкл праймеров (10 мкМ) в стандарте 1.Пробирки Эппендорфа на 5 мл, результаты были получены через онлайн-сайт AGRF. Для идентификации амплифицированных фрагментов ДНК последовательности ДНК сравнивали с базой данных NCBI [32] и браузером генома UCSC [40].

2.10. ЖХ-МС / МС анализ клеток РПЖ Осадки

клеток получали и лизировали с использованием буфера дезоксихолата натрия (SDC) (1% SDC в 1M Трис, pH 8,0). Затем образцы обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне (Thermo Scientific ™, Уолтем, Массачусетс, США) в течение 15 минут (при 4 ° C, 100% мощности) для денатурирования белков и сдвига ДНК.Концентрацию белков рассчитывали с использованием анализа бицинхониновой кислоты (BCA) со стандартами бычьего сывороточного альбумина Pierce ™ (BSA) (Thermo Scientific ™). Всего 10 мкг белкового экстракта денатурировали при 95 ° C в течение 5 мин с использованием термомиксера (Eppendorf ThermoMixer ^® F1.5, Гамбург, Германия). Образцы денатурированного белка восстанавливали 10 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфином (TCEP) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, Новый Южный Уэльс, Австралия), алкилировали 40 мМ 2-хлорацетамидом (2CAA) (Sigma-Aldrich) и инкубировали в течение 30 минут. мин в темноте при комнатной температуре.Затем образцы переваривали в течение ночи при 37 ° C, добавляя трипсин (Sigma-Aldrich) в соотношении фермент-белок 1:50. Пептиды обессоливали с использованием наконечников Pierce ™ C18 Spin (Thermofisher, Waltham, MA, USA), промывали 0,1% TFA и пептиды растворяли в элюирующем буфере с 80% ацетонитрилом (ACN) (степень чистоты для ВЭЖХ, Sigma-Aldrich). Растворители выпаривали в центрифуге SpeedVac (Savant Speed ​​Vac, SPD121P-230, Thermo Electron Corporation, Милфорд, Массачусетс, США) при 35 ° C и повторно суспендировали с использованием калибровочной смеси iRT, содержащей 2% ACN и 0.1% TFA (Biognosys AG, Шлирен, Швейцария). Образцы были приготовлены в трех биологических повторах и проанализированы методом последовательного оконного сбора всех теоретических масс-спектров (SWATH-MS) в соответствии с нашим ранее опубликованным протоколом [41].

2.11. Анализ данных ЖХ-МС / МС

Зависимые от данных данные были импортированы в программное обеспечение ProteinPilotTM (версия 5.0.1, AB SCIEX) и проанализированы с использованием алгоритма Paragon ™ в базе данных FASTA, состоящей из новых пептидных последовательностей IRX4, объединенных с базой данных UniProt для людей и загрязняющие белки.Использовались следующие параметры поиска: Тип выборки: Идентификация; Cys-алкилирование: йодацетамид; Пищеварение: трипсин; Инструмент: TripleTOF 5600+; Виды: Нет; Усилия по поиску: Тщательный идентификатор; Качество результатов: пороговое значение обнаруженного белка [Unused ProtScore (Conf)] ≥ 0,05 с FDR. Сгенерированная ионная библиотека была импортирована в микроприложение PeakView ^® SWATH (версия 2.1, AB SCIEX), сохранена в текстовом формате и очищена с помощью инструмента iSwathX (версия 2.0). Кураторская библиотека ионов была импортирована в программное обеспечение Skyline (версия 1.1) [42]. Следующие настройки пептида и переходов были соблюдены: Фермент: Трипсин [KRǀP]; Максимальное количество пропущенных сколов: 1; Мин. Длина: 6; Максимальная длина: 35, Заряды предшественников: 2+, 3+, 4+; Ионные заряды: 1+, 2+, 3+; Типы ионов: y / b; Допуск совпадения ионов: 0,5. Были импортированы независимые от данных данные, и количественное определение пептидов было выполнено с использованием статистического инструмента на основе MSstats R (версия 2.0) [43]. Для количественной оценки использовали пептиды, специфичные только для каждой изоформ белка IRX4, и нормализованные интенсивности пептидов использовали для расчета относительной кратности экспрессии.

2.12. Статистический анализ

Все статистические данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism 9.0.0 (121). Сравнение было проанализировано с помощью парного t-критерия (две группы) и критерия Краскела – Уоллиса с множественными сравнениями Данна (более двух групп). Результаты считались статистически значимыми, если * p <0,05 при 95% доверительном интервале. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях.

4. Обсуждение

Новые исследования доказали, что изоформы белков являются сложными биомаркерами на основе экспрессии для прогнозирования и прогрессирования рака [46,47,48,49,50,51].Систематическое секвенирование генома и транскриптома человека показало, что более 90% генов экспрессируют множественные мРНК через события AS, что предполагает большое влияние на функциональное разнообразие белков [52]. Однако раковые клетки часто обнаруживают аномалии сплайсинга РНК, чтобы выжить, расти и развиваться до терапевтической устойчивости [53]. Многие исследования подчеркнули, что альтернативный сплайсинг РНК является общим внутренним механизмом, ведущим к терапии и лекарственной устойчивости при РПЖ [8,9,54]. Например, конститутивно активный ARtranscript 7 (AR-V7) в опухолевых клетках простаты придает первичную или приобретенную устойчивость к терапии депривацией андрогенов [55].Помимо AR, несколько других генов, подверженных AS, такие как FGFR, VEGF, Bcl-x, Sh4GLB1 и CCDN1, были связаны с развитием и прогрессированием РПЖ [8]. Показано, что факторы транскрипции гомеодомена часто подвергаются альтернативному сплайсингу [56]. Например, было показано, что ген гомеодомена HNF1B, который кодирует три изоформы белка A, B и C, имеет разные функции по отношению к транскриптам, поскольку изоформы белков HNF1B A и B действуют как активаторы транскрипции, а изоформа белка HNF1B C который лишен трансактивационного домена, функционирует как репрессор транскрипции [56,57,58].Nguyen et al. идентифицировали четыре новых транскрипта IRX4 в клетках РПЖ [26]. Хотя для этих четырех транскриптов IRX4 последовательности экзонов с 1 по 6 были высококонсервативными, последовательности их вышележащих экзонов, которые кодируют 5’UTR, разнообразны по последовательности и длине [26]. Теперь мы обнаруживаем значительно большее разнообразие транскриптов IRX4 человека, чем предполагалось ранее. В настоящем исследовании мы идентифицировали с помощью анализа RT-PCR 12 транскриптов IRX4, включая семь новых транскриптов в клетках РПЖ. Это разнообразие гена IRX4 в основном возникает из-за использования альтернативных промоторов, удержания интронов, пропуска экзонов и использования альтернативных 3′- и 5′-сайтов сплайсинга.5’UTR мРНК играют важную роль в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов [59]. Nguyen et al. идентифицировали дополнительные экзоны 5’UTR области IRX4 с помощью Нозерн-блоттинга транскриптов IRX4 [26]. Выявленные новые транскрипты IRX4 еще предстоит охарактеризовать для их UTR-областей. Это сложное разнообразие изоформ гена IRX4 может не ограничиваться РПЖ, но может отклоняться от других видов рака со значительной экспрессией IRX4; таким образом, стоит изучить их патологическое и / или физиологическое воздействие.Андрогены и АР играют решающую роль в патогенезе РПЖ. Андрогенная депривационная терапия (ADT) была основой лечения позднего РПЖ. Несмотря на первоначальный сильный ответ на терапию депривацией андрогенов, у большинства пациентов с распространенным рецидивом РПЖ наблюдается фатальный кастрационно-резистентный РПЖ (CRPC) [60]. Согласно нашим данным, IRX4 и его изоформы по-разному экспрессируются в зависимости от андрогенной чувствительности клеточных линий. Клеточная линия C42B, устойчивая к кастрации, показала наивысшую экспрессию большинства транскриптов IRX4 на уровне мРНК.Однако экспрессия РНК не коррелирует с протеомными данными и затрудняет точное понимание устойчивости к кастрации и ее взаимосвязи с IRX4. Наборы транскриптомных данных IRX4 в РПЖ показали плохую корреляцию с протеомными данными в соответствии с недавними исследованиями в РПЖ [41,61,62] из-за различной дискордантной регуляции между регуляцией транскрипции и трансляции, посттранскрипционных модификаций, связанных с регуляцией трансляции, отсутствия временной синхронизации между транскрипцией и трансляцией и кинетических изменений между генерацией и оборотом белка в сложных биологических образцах [63].Однако, в соответствии с экспрессией РНК IRX4, уровень экспрессии изоформ белка IRX4 был более заметным в андроген-чувствительных клеточных линиях, чем в андроген-нечувствительных клеточных линиях. В целом, результаты показывают, что изоформы белка IRX4 регулируются андрогеном. Одновременная избыточная экспрессия транскриптов IRX4 вместе с KLK3 с андрогеном может указывать на роль IRX4 на ранних стадиях прогрессирования РПЖ, а лечение антиандрогенами бикалутамидом и энзалутамидом не полностью эффективно в устранении избыточной экспрессии транскриптов IRX4 в клетках РПЖ.Влияние андрогенов и антиандрогенов на регуляцию транскриптов IRX4 по сравнению с клетками VCaP и DuCaP ниже в клетках LNCaP, что свидетельствует о дифференциальной андрогенной регуляции IRX4 в клетках LNCaP, что требует дальнейшего изучения. Таким образом, IRX4 будет лучшей терапевтической мишенью в сочетании с антиандрогенной терапией для лечения РПЖ. Отсутствие ответа на лечение антиандрогенами транскриптов 6 и 7 IRX4 было обнаружено в клетках DuCaP. Изоформа 4 белка IRX4 кодируется транскриптами 6 и 7, и эти два транскрипта используют альтернативный промотор, отличный от других транскриптов, которые расположены непосредственно перед экзоном 3a.Это может критически повлиять и изменить регуляцию андрогенов изоформы 4 белка IRX4 в клетках РПЖ и может привести к терапевтической резистентности к антиандрогенной терапии у пациентов с РПЖ. Хотя функция IRX4 строго регулируется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях в желудочках сердца человека [64], регуляция транскрипции IRX4 все еще не совсем ясна при РПЖ. Nguyen et al. исследовали опухолевую супрессорную роль IRX4 через взаимодействие с рецепторами витамина D при РПЖ, но специфическая для изоформ роль неизвестна [26].Поскольку в изоформе 4 белка IRX4 отсутствуют как N-конец, так и C-конец, а также предсказанные функциональные домены по сравнению с полноразмерными белками IRX4, мы подозреваем возможность этой изоформы действовать как фактор транскрипции. Таким образом, эта изоформа 4 может действовать отчетливо по сравнению с полноразмерными изоформами с помощью различных механизмов. Недавние исследования выяснили, что ассоциированный с раком AS транскрипционных факторов генерирует изоформы с измененной активностью, противоположной транскрипцией или антагонистическими функциями, которые серьезно влияют на начало и прогрессирование опухоли [3].Как сообщает Belluti et al. Подводя итог, можно сказать, что отсутствие связывающих доменов в факторах транскрипции может проявлять противоположные функции в прогрессировании рака [65]. Например, изоформа AP-2B, продуцируемая AS AP-2, не имеет ДНК-связывающего домена и демонстрирует ингибирующий эффект трансактивации AP2 и приводит к повышенной онкогенности, независимому от закрепления росту, инвазивности и ангиогенезу при меланоме [66,67 ]. Кроме того, функциональные домены, в которых отсутствуют изоформы факторов транскрипции, могут быть неправильно локализованы в раковой клетке и проявлять доминантно-отрицательную активность в результате чрезмерной экспрессии нефункциональной изоформы по сравнению с функциональным или цитоплазматическим титрованием функциональной изоформы или регуляцией полного длины изоформ на нефункциональные изоформы прямо или косвенно [65].Например, изоформа HELIOS-V1 не имеет экзона 6 для сигнала ядерной локализации и, следовательно, имеет цитоплазматическую локализацию в линиях лейкозных Т-клеток человека и способствует росту и выживанию Т-клеток. Кроме того, экспрессия изоформ HELIOS запускает дерегуляцию различных нижестоящих генов-мишеней в Т-клетках по сравнению с полноразмерными изоформами [68]. Ожидается, что изоформа 3, кодируемая из транскриптов 12, 8 или 9, будет иметь важные домены, такие как домен трансактивации и гомеодомен, которые необходимы для связывания ДНК и действуют как факторы транскрипции.Однако по сравнению с полноразмерными изоформами IRX4 эта изоформа 3 лишена N-концевой области, которая может влиять на структуру и функцию в РПЖ, что требует дальнейшего выяснения. К сожалению, мы не смогли увидеть экспрессию белка в данных масс-спектрометрии в нескольких транскриптах (10 и 11), идентифицированных в линиях клеток РПЖ, что может указывать на нонсенс-опосредованный распад этих транскриптов. Ввиду этого, хотя потенциальное значение изоформ IRX4 для прогрессирования РПЖ до сих пор неизвестно, диагностическое и терапевтическое значение этих изоформ нельзя игнорировать.Дополнительные функциональные исследования с использованием моделей сверхэкспрессии и нокдауна, специфичной для изоформ, необходимы для доказательства дифференциальной роли изоформ IRX4 при РПЖ. GWAS идентифицировал более 160 локусов риска РПЖ, некоторые из которых действуют как регуляторные элементы цис-eQTL, которые модулируют экспрессию близлежащих генов. . Было обнаружено, что SNP риска РПЖ rs12653946, идентифицированный в локусе 5p15, имеет сильную связь с геном IRX4 (P = 4,91 × 10 ^-5 , FDR = 0,00468) [22,44]. rs10866528 был использован для маркировки SNP rs12653946, и было обнаружено, что он имеет более низкую экспрессию IRX4 с гомозиготным генотипом GG высокого риска РПЖ, чем с обычным гетерозиготным генотипом AG в выборке из 50 пациентов [44].Подобно опубликованным результатам, с SNP rs10866528 мы наблюдали низкие уровни экспрессии транскриптов IRX4 в общих генотипах AA и генотипе GG, связанном с риском РПЖ, в большой выборке (483 образца). Все проанализированные транскрипты IRX4 показали аналогичную картину, и мы не смогли наблюдать несоответствия между проанализированными транскриптами. Это говорит о том, что транскрипты IRX4 в равной степени способствуют риску РПЖ, и нельзя игнорировать индивидуальную ценность в прогрессировании РПЖ. Открытие изоформ является сложной задачей в исследованиях рака.Хотя многие транскрипты идентифицируются на клеточном уровне, только небольшая часть транскриптов кодирует изоформы контекстно-зависимым образом [63]. Большинство изоформ имеют перекрывающиеся области; поэтому идентификация уникальных изоформ чрезвычайно затруднительна в лабораторных анализах и на вычислительном уровне. Часто используемые методы, такие как ПЦР, РНК-секвенирование и масс-спектроскопия, имеют свои собственные ограничения при идентификации и количественной оценке изоформ с низким содержанием. Мы выбрали небольшое количество клеточных линий РПЖ для количественной оценки экспрессии изоформ IRX4 с помощью масс-спектрометрии, но их необходимо было измерить в большой когорте образцов, включая клинические образцы.Низкая воспроизводимость, низкая чувствительность, высокая вариабельность и высокий уровень шума данных инструментов – настоящие проблемы при аннотации изоформ. Более того, ограниченная корреляция между транскриптомными и протеомными данными затрудняет интерпретацию различий в экспрессии изоформ между линиями раковых клеток.

Анализ изоформ-специфической экспрессии при прогрессировании опухоли простаты может дать ясное представление о разработке лекарств против конкретных изоформ, способствующих развитию опухолей. Помимо РПЖ, разнообразие гена IRX4 может быть признаком других видов рака; таким образом, характеристика этих изоформ расширит наши знания для разработки конкретных терапевтических стратегий.Принимая во внимание экспрессию, специфичную для изоформы IRX4, наше исследование предполагает, что IRX4 может играть различные роли в РПЖ, что предполагает клиническую важность специфичных для изоформ терапевтических целей в улучшении ухода за пациентами РПЖ.

Освещение темной стороны человеческого транскриптома с помощью длинного секвенирования транскриптов | BMC Genomics

TAMA – аннотация транскриптомов с помощью модульных алгоритмов

TAMA состоит из модульных инструментов с прозрачными алгоритмами, точным контролем параметров и отслеживаемыми выходными данными, позволяющими пользователям анализировать, интерпретировать и диагностировать полученные модели расшифровки.Основные функции анализа состоят из двух модулей: TAMA Collapse и TAMA Merge.

TAMA Collapse использует сопоставленные чтения и сборку эталонного генома для создания аннотации транскриптома. TAMA Collapse использует четыре основных метода определения истинных стыков: фильтрация качества выравнивания, фильтрация ошибок локальной плотности (LDE), ранжирование стыков и покрытие стыков. Все эти методы могут быть настроены пользователем. Во-первых, применяется фильтрация качества выравнивания путем оценки охвата длины выравнивания и идентичности выравнивания каждого отображенного считывания относительно эталонного генома.Чтения ниже пороговых значений, определенных пользователем, отбрасываются. Чтения, прошедшие этот первый шаг, затем проверяются с помощью алгоритма LDE на количество несовпадений, фланкирующих каждое предсказанное стыковочное соединение. Ошибки вокруг стыков усугубляют неправильное сопоставление и вызывают предсказание ложных стыков. Эта оценка удаляет считывания с высокой плотностью ошибок в пределах указанного расстояния пары оснований от каждого стыка. Остальные считывания затем группируются на основе структуры экзон-интрон с учетом определяемых пользователем различий (называемых колебанием в номенклатуре ТАМА) в начале и конце экзона, измеренных в парах оснований (рис.1в). Прогнозируемые стыковые соединения для сгруппированных считываний затем ранжируются на основе профилей несоответствия флангов и покрытия. Затем в окончательной модели транскрипции используются стыки с наивысшим рейтингом. Большой порог вобуляции может помочь удалить ложные положительные прогнозы для соединений сращивания, но может удалить реальные соединения сращивания в пределах длины вобуляции. Таким образом, алгоритм LDE и ранжирование сращивания стыков позволяют уменьшить длину колебания, а также уменьшить количество ложных предсказаний сращивания стыков.

В дополнение к строгой идентификации стыков, TAMA Collapse также позволяет учитывать достоверность начальных сайтов транскрипции, выполняя программу в ограниченном или не закрытом режиме. Например, для 5′-захваченных РНК режим кэпа позволит сохранить транскрипты с альтернативными стартовыми сайтами транскриптов; в то время как для не 5′-захваченных РНК режим без кэпинга удаляет модели транскриптов, которые кажутся 5′-деградированными. Режим кэпа требует, чтобы сгруппированные отображенные чтения имели одинаковое количество экзонов и одинаковую структуру экзон-интрон.Режим без кэпа аналогичен режиму с кэпом, но позволяет сгруппированным считываниям иметь различия в количестве экзонов на 5′-конце, отражая считывания, полученные из РНК с деградацией с 5′-конца. Таким образом, все предсказанные сплайсинговые соединения для более короткой отображенной модели считывания и 3′-конца должны совпадать с таковыми для более длинной модели. Эти два метода группировки описаны в предыдущем исследовании, в котором они были названы коллапсом сайта начала транскрипции (эквивалентно закрытому режиму) и каскадному коллапсу экзонов (эквивалентному режиму без ограничения) [4].

В дополнение к сборке транскриптома, TAMA Collapse также выводит подробную информацию, показывающую качество отображения считывания, свернутые группы считывания, предсказанные вариации последовательности и модели транскриптов с 3′-геномным поли-A (геномное загрязнение или усеченный транскрипт). Эти выходные данные предназначены для предоставления пользователям полного понимания поведения TAMA Collapse и, таким образом, позволяют пользователям отслеживать, диагностировать и улучшать свои сборки транскриптомов.

TAMA Merge объединяет модели транскриптов путем изучения экзон-интронных структур моделей транскриптов для создания неизбыточного набора генов и транскриптов.TAMA Merge можно использовать для аннотации одного входного транскриптома, чтобы удалить избыточность, или можно использовать для аннотации нескольких транскриптомов для создания единой аннотации. TAMA Merge также создает выходные файлы, которые можно использовать для понимания различий между входными аннотациями. TAMA Merge использует те же алгоритмы режима сворачивания, что и TAMA Collapse. Одной из уникальных особенностей TAMA Merge является возможность объединять сборки транскриптов путем назначения различных режимов сворачивания и приоритетов функций модели транскрипции между разными аннотациями.Например, при использовании TAMA Merge для комбинирования аннотации, полученной при последовательном считывании, со справочной аннотацией, справочной аннотации может быть отдан приоритет для сайтов начала / конца транскрипции и стыков сплайсинга. Аннотации, созданные пользователем, также можно установить в режим без ограничения, чтобы модели, созданные пользователем, могли свернуться с опорными моделями длиной 5 футов. Выходные файлы TAMA Merge включают подробные отчеты о том, как было выполнено слияние. Эти файлы отчетов показывают, какие входные аннотации поддерживали каждую из окончательных моделей транскриптов и генов, а также количество колебаний, которые произошли в начале и конце каждого экзона между объединенными моделями.

Наряду с TAMA Collapse и TAMA Merge, набор инструментов TAMA содержит множество других инструментов, которые либо применяют дополнительные фильтры, либо добавляют информацию. Другие инструменты TAMA, используемые в этом исследовании, более подробно описаны в разделе «Методы». Более подробное описание того, как работает TAMA, можно найти здесь: github.com/GenomeRIK/tama/wiki/.

Бенчмаркинг TAMA и связанного программного обеспечения

Мы протестировали сборку транскриптомов на основе длинного чтения TAMA, Stringtie2 [9], TALON [10] и Cupcake [7], используя три различных набора данных: смоделированные данные PacBio, смоделированные данные Nanopore и PacBio. Sequel II Iso-Seq данные из контрольной смеси Lexogen’s Spike-in RNA Variant (SIRV).Смоделированные считывания PacBio и Nanopore были получены в предыдущем исследовании [11] с использованием PBSIM [12], а также использовались для сравнительного анализа в исследовании Stringtie2 [9]. Моделируемые наборы данных были основаны на аннотациях хромосомы 19 справочной аннотации человека. Подробности смоделированных и человеческих наборов данных можно найти в дополнительных файлах (Таблица S1). Используя эти смоделированные наборы данных, исследование Stringtie2 показало, что Stringtie2 превзошел FLAIR [13] и Traphlor [14]. Мы использовали тот же метод оценки, что и в исследовании Stringtie2.Хотя эти смоделированные наборы данных полезны из-за наличия достоверной информации, они не совсем точны в своем представлении данных длительного считывания секвенирования. В частности, имитированные чтения были созданы путем случайной фрагментации моделей транскриптов, что нереально, поскольку фрагментация транскриптов не является случайной и зависит от характеристик последовательности и методов обработки выборки. Смоделированный набор данных PacBio представляет считывания, эквивалентные считываниям полной длины нехимерного пакета PacBio (FLNC).Это означает, что они предполагают, что внутричитываемая коррекция кольцевой согласованной последовательности (CCS) была выполнена, и что адаптеры и поли-A-хвосты были удалены. Смоделированный набор данных Nanopore эквивалентен чтению Nanopore после удаления поли-A-хвоста и последовательностей адаптеров. Поскольку программное обеспечение PacBio Iso-Seq (Cupcake) требует определенных сгенерированных PacBio метаданных, которые не содержатся в этих смоделированных наборах данных, мы не могли протестировать программное обеспечение PacBio Cupcake на этих наборах данных. Это означает, что мы не могли использовать исправление ошибок перечитываемого чтения PacBio Cluster / Polish для этих наборов данных.Таким образом, эти смоделированные наборы данных можно использовать только для оценки влияния случайных ошибок при длительном чтении на производительность инструментов сопоставления и сборок транскриптомов.

Для решения проблем с смоделированными наборами данных мы также использовали чтения из набора данных SIRV Lexogen из набора данных PacBio UHRR Sequel II Iso-Seq. Контрольная смесь Lexogen SIRV содержит синтезированные молекулы РНК, представляющие 7 экспрессируемых локусов (18 генов с учетом цепи) с 69 уникальными транскриптами. Истина в этом наборе данных предоставлена ​​Lexogen в виде ожидаемых генных моделей, основанных на их синтетическом геноме.Однако возможно, что не все РНК из набора данных SIRV были секвенированы и / или в образце SIRV есть другие РНК, которые не представлены в файле аннотации, представленном на веб-сайте Lexogen. Это может объяснить более низкую точность всех неуправляемых трубопроводов для набора данных SIRV (точность <68% для всех неуправляемых заходов на посадку).

Мы использовали GffCompare [15] для расчета чувствительности и точности для каждого конвейера. Чувствительность определяется как количество правильных моделей транскрипции в прогнозируемой аннотации, деленное на все модели транскрипции, используемые для моделирования.Точность определяется как количество правильных моделей транскрипции в предсказанной аннотации, деленное на количество всех предсказанных моделей транскрипции. Эти оценки могут быть рассчитаны либо на уровне транскрипта, либо на уровне локусов гена. Эти определения взяты из программы GffCompare. Этот метод расчета идентичен методу, использованному в исследовании Stringtie2 [9]. Поскольку TAMA, Stringtie2 и TALON могут работать как с неуправляемым подходом, так и с использованием подхода, основанного на аннотациях, мы протестировали оба метода для каждого из этих инструментов.Поскольку TAMA предназначена для настройки параметров, мы применили два набора параметров для неуправляемых конвейеров TAMA, которые мы называем TAMA Low и TAMA High. TAMA Low использует параметры, чтобы максимизировать чувствительность генных локусов за счет точности модели транскрипции, в то время как TAMA High использует более строгие параметры для удаления ошибочных моделей транскриптов. Выбор параметров для TAMA High и TAMA Low отличается для синтетических наборов данных и данных PacBio Sequel II Iso-Seq (SIRV и UHRR), поскольку синтетические наборы данных имеют более высокий уровень ошибок.Выбор параметров TAMA High и TAMA Low более подробно описан в разделе «Методы». Вкратце, конвейер TAMA High использует более строгие настройки LDE (меньшее количество несоответствий, окружающих стыковые соединения) и требует поддержки чтения из обеих ячеек SMRT (в данных Iso-Seq PacBio Sequel II), в то время как TAMA Low имеет более низкие настройки строгости для LDE и требует поддержка только с одного чтения. Требование TAMA High для поддержки чтения из обеих ячеек SMRT можно рассматривать как измененную форму метода, который используется на этапе кластеризации / полировки для фильтрации ошибочных моделей транскрипции (удаление всех операций чтения, которые не кластеризуются).Однако подход TAMA High может обеспечить большую чувствительность, поскольку он допускает большую дисперсию на 5′-конце моделей транскриптов для учета низкоэкспрессированных генов, которые могут быть представлены только усеченной 5′-моделью в одной из клеток SMRT (где предсказанная 5 ‘полная модель была подобрана в другой ячейке SMRT). Этот метод фильтрации также может обеспечить более высокую точность, поскольку требование поддержки чтения во время выполнения секвенирования может помочь уменьшить артефакты, вызванные техническими эффектами пакетной обработки.Этот алгоритм можно настроить, если выполнялась только одна ячейка SMRT или прогон секвенирования, требуя только поддержки множественного чтения для каждой модели транскрипции. Это все равно обеспечит более высокую чувствительность, чем метод кластера / полировки, из-за большего допуска 5 ‘изменчивости. Управляемый конвейер TAMA сопоставляет модели транскриптов из длинных считываемых данных с аннотацией входной ссылки и принимает прогнозы стыковочных соединений из аннотации ссылки. Он отбрасывает любые модели, не соответствующие справочной аннотации, с использованием алгоритма слияния TAMA.См. Раздел «Методы» для описания слияния TAMA и выбора параметров конвейера.

Для наборов данных, смоделированных как PacBio, так и Nanopore, управляемые подходы достигли большей чувствительности и точности по сравнению с неуправляемыми подходами (рис. 2). Подход TAMA Guided имел наивысшую точность для всех наборов данных при немного меньшей чувствительности по сравнению с подходом Stringtie2 Guided для смоделированных наборов данных. В наборе данных SIRV метод TALON Guided показал немного более высокую оценку чувствительности по сравнению с TAMA Guided.Более высокий показатель чувствительности для TALON Guided был обусловлен включением еще одной модели транскрипции по сравнению с TAMA Guided. Когда мы проверили эту модель транскрипции, найденную только в сборке TALON Guided, мы обнаружили, что она не соответствует поддерживающим чтениям (рис. 2f). Считывания, используемые для поддержки предсказания TALON Guided этой конкретной модели транскрипции, имеют длинное 3′-расширение по сравнению с предсказанной моделью транскрипта. Это расширение присутствует в других моделях транскриптов в аннотации SIRV, и кажется, что эти чтения, вероятно, происходят из 5′-усеченной / деградированной РНК из этих транскриптов.Это поднимает вопрос, почему эти чтения были отнесены к модели транскрипции и как это может повлиять на неуправляемый TALON.

Рис. 2

Бенчмаркинг сборки с длинной стенограммой. Чувствительность и точность управляемых и неуправляемых методов сборки длинных транскриптомов. – уровень локусов гена для симулированных считываний PacBio. b Уровень локусов генов для имитированных считываний нанопор. c Уровень транскрипции для моделирования чтения PacBio. d Уровень транскрипции для моделирования чтения нанопор. e Уровень транскрипции для PacBio Sequel II Iso-Seq SIRV читает. f Пример ошибочного предсказания транскрипции управляемым Talon, где вспомогательные чтения взяты из другой модели транскрипции. Эти поддерживающие считывания исходят из 5′-деградированной РНК, что приводит к путанице.

В целом следует ожидать лучшей производительности управляемых подходов, поскольку управляемые подходы по существу соответствуют моделям транскрипции аннотации, которая имеет большое сходство с аннотацией оценки.Однако управляемые подходы не так полезны для открытия транскриптомов, поскольку они только подтверждают уже известные модели генов / транскриптов. Среди всех неуправляемых методов TAMA Low обеспечивает лучшую чувствительность на уровне локусов гена, в то время как TAMA High обеспечивает наивысшую точность и чувствительность на уровне транскриптов по сравнению с подходами без TAMA. Сравнение локусов генов SIRV не было включено, поскольку транскриптом SIRV состоит только из 18 локусов генов на 7 каркасах. Все методы имели идеальную чувствительность и точность на уровне локусов генов для набора данных SIRV.

Влияние исправления ошибок между считыванием на открытие модели гена

Мы обработали данные UHRR Iso-Seq, используя четыре различных конвейера, чтобы понять влияние исправления ошибок между считыванием перед картированием на открытие гена и точность предсказания модели (рис. 3а). Набор данных UHRR Iso-Seq состоял из двух отдельных прогонов Sequel II с использованием 8 M ячеек SMRT. Было 4 461 529 и 4 473 633 чтения CCS, сгенерированных двумя ячейками SMRT, что привело к 3 504 905 и 3 447 471 чтению FLNC, соответственно.График длин чтения FLNC можно найти в дополнительных файлах (Рисунок S1). Все четыре конвейера используют инструменты TAMA, поскольку конвейер TAMA High имеет наивысшее сочетание чувствительности и точности по сравнению со всеми другими неуправляемыми методами в тестовых тестах, а конвейер TAMA Low имеет самую высокую чувствительность. Мы сравнили два конвейера без исправления ошибок между считыванием (конвейеры TAMA Low и TAMA High), один конвейер с исправлением ошибок между считыванием при длительном считывании (Polish Pipeline) и один конвейер с гибридным исправлением ошибок между считыванием (Lordec Pipeline).Польский конвейер использует исправление ошибок между считыванием (в форме кластеризации длинных считываний и использования выравнивания для полировки последовательностей перед отображением) вместе с TAMA Collapse с использованием тех же параметров, что и конвейер TAMA Low. Конвейер Lordec использует коррекцию ошибок между чтениями LoRDEC [16] (выравнивание данных короткого чтения RNA-seq с длинными чтениями до сопоставления) с TAMA Collapse (те же настройки, что и TAMA Low). Для конвейера Lordec мы использовали данные короткого чтения RNA-seq из UHRR, но из другого исследования [17].

Рис. 3

Сравнение различных конвейеров в UHRR Iso-Seq Dataset. a Схема рабочего процесса для четырех конвейеров, используемых для анализа набора данных UHRR Iso-Seq. b Пример польского трубопровода, в котором отсутствует полная модель транскрипции из-за низкого покрытия чтения для 5 ‘полного чтения. Поскольку Cluster / Polish отфильтровывает любые чтения, которые не объединяются хотя бы с одним другим чтением, поддержка одиночного чтения для более длинной модели была отфильтрована в польском конвейере, но захвачена TAMA.В этом случае усеченная модель на польском языке совпадает с моделью транскрипта в аннотации Ensembl

Пайплайны TAMA Low и Lordec дали наиболее предсказуемые модели генов и транскриптов с более чем 160 K генами и 750 K транскриптами (Таблица 1). Эти чрезвычайно высокие числа, вероятно, связаны с проблемами, связанными с использованием операций чтения с высоким коэффициентом ошибок, а также операций чтения, возникающих из-за шума транскрипции. Польский конвейер произвел наименьшее количество генов и моделей транскриптов (Таблица 1), в то время как конвейер TAMA High – более 1.В 5 раз больше предсказанных генов, но с таким же количеством предсказанных транскриптов.

Таблица 1 Сравнение конвейеров

Оценка точности обнаружения генной модели

Хотя достоверной информации о человеческом транскриптоме нет, мы использовали справочную аннотацию генома человека Ensembl v94 (выпуск 94, октябрь 2018 г.) [18] в качестве справочного материала для понимания как наши результаты сравниваются с текущими аннотациями. Мы определили количество локусов генов и моделей транскриптов из аннотации Ensembl с представлением из каждого конвейера.У конвейеров TAMA Low и Lordec было наибольшее количество совпадений как для локусов генов, так и для моделей транскриптов, что указывает на высокую чувствительность. Однако, учитывая большое общее количество генов и транскриптов, аннотации этих конвейеров, вероятно, содержат много ошибочных моделей генов и транскриптов. В конвейере TAMA High было больше совпадений локусов генов, но немного меньше совпадений транскриптов по сравнению с польским конвейером. Это означает, что в аннотации к польскому конвейеру (4.9: 1) по сравнению с аннотацией TAMA High (3,5: 1). Более высокое соотношение транскриптов к генам в польском конвейере по сравнению с конвейером TAMA High предполагает, что либо TAMA High отфильтровывает множество реальных альтернативных транскриптов, либо Cluster / Polish каким-то образом предсказывает более ошибочные альтернативные модели транскриптов.

Когда мы исследовали причину большего количества совпадений моделей транскрипции в польской аннотации, мы обнаружили, что в некоторых случаях польские модели транскриптов совпадали с моделями в аннотации Ensembl из-за удаления чтений (с помощью этапа кластера / польского языка) которые поддерживали модели транскриптов на 5 ′ длиннее (рис.3б). В этих случаях картированные чтения показали модели 5′-расширенного транскрипта с дополнительными 5′-экзонами вместе с 5′-более короткими моделями, которые могли происходить из 5′-деградированных молекул РНК. Однако, поскольку более длинные модели имели меньшее покрытие для чтения, польский конвейер удалил их из сборки транскриптома, оставив только более короткие модели, которые иногда совпадали с моделями в аннотации Ensembl. Эта тенденция к созданию усеченных моделей транскрипции может объяснить расширение альтернативных предсказаний транскрипции в польском конвейере.Хотя можно утверждать, что эти более короткие модели реальны, поскольку они представлены в аннотации Ensembl, также возможно, что эти РНК обычно быстро деградируют, и поэтому полноразмерные представления не были идентифицированы в аннотации Ensembl из-за недостаточного охвата. из вспомогательных данных, используемых конвейерами Ensembl.

Оценка деградации РНК по данным Iso-Seq

Чтобы лучше понять влияние, которое деградация РНК может иметь на аннотации, основанные на длинном чтении, мы проанализировали модели транскриптов, которые имели совпадающую структуру 3′-экзон-интрон между TAMA High ( 135 218 транскриптов), польских (126 288 транскриптов) и Ensembl v94 (206 601 транскриптов), чтобы увидеть, какая аннотация имеет более длинное 5′-представление (таблица 2).При сравнении аннотации TAMA High с аннотацией на польском языке было обнаружено 67 480 моделей транскриптов с соответствующей 3′-экзон-интронной структурой. Из этих 3′-совпадающих моделей транскриптов 56 198 (83,2%) показали, что модели TAMA High имеют более длинное 5′-представление с 3357 моделями (5%), имеющими дополнительные 5′-экзоны. Это указывает на то, что польский трубопровод может производить большое количество моделей неполной расшифровки 5 ‘. В то время как аннотации TAMA High и Polish имели одинаковое количество моделей транскрипции, примерно половина этих моделей в каждой аннотации не имела совпадений между аннотациями.Это может быть связано с различиями в вызовах стыковочных соединений между двумя конвейерами, которые в этом тексте называются колебаниями стыковочных узлов.

Таблица 2 Сравнение 5′-полноты моделей транскриптов между аннотациями

Когда мы сравнили аннотацию TAMA High с аннотацией Ensembl с использованием того же метода, мы обнаружили 23 542 модели транскриптов, совпадающих с 3′-экзонной структурой интрона. Из этих совпадающих моделей 15230 (64,7%) показали, что модели TAMA High имеют более длинное 5′-представление, а 3521 модель (15%) имеет дополнительные 5′-экзоны.Сравнивая аннотацию польского конвейера с аннотацией Ensembl с использованием того же метода, мы обнаружили 26 186 моделей транскрипта соответствия 3′-экзон-интронной структуры. Из этих подходящих моделей 15496 (59,2%) показали, что польские модели имеют более длинное 5′-представление. Это может указывать на то, что более трех тысяч моделей транскриптов Ensembl имеют неполные 5′-концы с отсутствующими 5′-экзонами или что, по крайней мере, они представляют новые альтернативные транскрипты для этих генов. Несмотря на то, что примерно половина моделей расшифровки (67 480) из конвейеров TAMA High и Polish имели совпадения между двумя конвейерами, менее половины (23 542 для TAMA High и 26 186 для польского) этих моделей расшифровки также соответствовали аннотации Ensembl.Это предполагает, что модели, совпадающие между конвейерами TAMA High и Polish, но не найденные в аннотации Ensembl, могут представлять новые альтернативные модели транскрипции. В качестве альтернативы они могут указывать на тип системной ошибки в конвейерах прогнозирования модели транскрипции.

Затем мы сравнили пересечение между всеми тремя аннотациями и идентифицировали 19 413 транскриптов с общими 3′-областями. Из этих расшифровок стенограммы TAMA High были самыми длинными в 65,3% матчей, Ensembl – в 22.4%, польский – 12,3% (рис. 4а). Хотя в аннотации польского трубопровода было больше 3 ‘совпадающих моделей транскриптов с аннотацией Ensembl при двухстороннем сравнении, количество 5′ длинных транскриптов было аналогично аннотации TAMA High, предполагая, что увеличение совпадений произошло из польских моделей трубопроводов, которые были короче. на 5’-конце по сравнению с соответствующими моделями транскриптов Ensembl. Хотя 5-дюймовые более короткие модели расшифровки из польского конвейера могут быть точными, эти результаты демонстрируют, что использование сопоставления расшифрованных моделей для оценки производительности конвейера (как используется в GffCompare) может зависеть от ложных срабатываний от 5-дюймовых неполных моделей, где эти модели совпадают с аннотацией ссылки.Таким образом, мы предлагаем углубленную оценку моделей транскрипции для более точного понимания производительности конвейера.

Рис. 4

Анализ сигнатуры деградации. – круговая диаграмма пересечения 3 ‘уровня транскрипции между аннотациями TAMA High, Ensembl и Polish с секциями, представляющими количество 5’ расширенных моделей транскрипции из каждой аннотации. b Диаграмма представления деградированной РНК по отношению к сборке генома. Уменьшение 5 ‘покрытия приводит к 5’ изменчивости отображаемых считываний. c Сигнатура деградации по хромосомам в каждом прогоне ячейки SMRT

Метод оценки деградации РНК по данным Iso-Seq

Для измерения относительного количества считываний, происходящих от 5′-деградированной РНК, мы разработали метрику, называемую «Сигнатура деградации» (DegSig), который оценивает степень вариабельности 5′-экзона в моделях транскриптов (рис. 4b). Метрика DegSig рассчитывается с использованием выходных данных прогонов TAMA Collapse и ввода их в инструмент TAMA Degradation Signature.Значение DegSig дано в процентах, которое представляет собой долю считываний, полученных из 5′-деградированной РНК (см. Методы для формулы). Важно отметить, что DegSig обеспечивает только оценку 5′-деградации с оговоркой, что истинные альтернативные стартовые сайты транскрипции и неполный синтез первой цепи при получении библиотеки кДНК также могут вызывать вариабельность 5′-экзона, которая может имитировать 5′-деградацию. . Чтобы проверить нашу метрику DegSig, мы применили ее к двум наборам данных Iso-Seq из РНК мозга курицы.Один набор данных был получен из РНК, выбранной по 5′-кэпу TeloPrime [19], а другой был получен без отбора по 5′-кэпу. Библиотека TeloPrime должна содержать меньший процент деградированных последовательностей транскриптов, поскольку она выбирает полные кэпированные РНК. Отобранные данные без кэпа имели DegSig 56,3%, в то время как DegSig для данных библиотеки TeloPrime составляло 23,6%, что свидетельствует о большой разнице в доле деградированных последовательностей РНК, захваченных в виде кДНК двумя разными методами. Однако ни у одного вида нет основополагающей истины для фактического количества 5′-более коротких моделей с той же 3′-экзон-интронной структурой, что и у более длинных моделей, поэтому DegSig является лишь приблизительной оценкой доли моделей, которые могут быть из деградированной РНК. .

Мы запускали DegSig в наборе данных UHRR Iso-Seq индивидуально по ячейке SMRT и хромосоме. Почти все хромосомы имели DegSig от 32 до 41% (рис. 4c). Однако Y-хромосома имела DegSig 26,7 и 27,2% для SMRT Cell 1 и 2 соответственно. Одно из объяснений гораздо более низкого DegSig на Y-хромосоме может быть связано с недостаточной глубиной считывания для Y-хромосомы (только 629 и 588 считываний из SMRT-клеток 1 и 2, соответственно). Более низкая глубина считывания может снизить значения DegSig из-за отсутствия покрытия для каждого гена.Диапазон DegSig для данных о человеке выше, чем для данных по выбранной 5′-шапке РНК цыпленка, что позволяет предположить, что может иметь место значительное количество считываний с деградированной РНК и, таким образом, сниженное представление полноразмерных транскриптов.

Сравнение точности идентификации сращивания стыков

Чтобы понять точность каждого трубопровода для прогнозирования сращивания стыков, мы рассмотрели как частоту несоответствия сопоставления, так и колебание стыка сращивания. Колебание относится к неправильному картированию сплайсинговых стыков, вызывающему небольшие различия в геномных локусах картированных функций, таких как границы экзонов и донорные / акцепторные сайты сплайсинговых стыков (рис.1c) (более подробное объяснение колебания см. В разделе «Методы»). Хотя процент несоответствия отображенных чтений часто используется для оценки улучшения данных длительного чтения из различных конвейеров исправления ошибок [20], этот показатель на самом деле не так полезен для понимания общего улучшения аннотации транскриптома. В аннотациях транскриптомов на основе генома обычно наиболее важными признаками для идентификации являются сайты начала транскрипции (TSS), сайты конца транскрипции (TES), сплайсинговые соединения и сцепление экзонов.Эти особенности позволяют предсказывать кодирующие и промоторные области, которые часто имеют решающее значение для последующего анализа. Таким образом, для идентификации структуры транскрипта ошибки около стыков сращивания имеют большую вероятность изменения результирующей модели транскрипта, чем ошибки, возникающие дальше от стыков сращивания. Это означает, что процент ошибок при чтении может быть не таким значительным, как их распределение. Таким образом, еще одним показателем эффективности методов исправления ошибок является оценка степени колебания сплайс-соединения между предсказанными транскриптами и известными транскриптами.

Чтобы продемонстрировать эту концепцию, мы рассмотрели профили несоответствия сопоставления для каждого сопоставленного чтения для конвейеров исправления ошибок между считыванием (Polish и Lordec) и конвейеров, использующих сопоставленные чтения FLNC (TAMA High и TAMA Low). Обратите внимание, что отображенные чтения FLNC одинаковы для конвейеров TAMA High и TAMA Low.

Используя выходные данные TAMA Collapse, мы рассмотрели длину отображаемого покрытия чтения, идентификацию отображения, отсечение, вставки, удаления и ошибки подстановки. Эти значения представляют собой сравнение сопоставленных считываний со сборкой генома и, таким образом, служат только в качестве оценки истинного уровня ошибок, поскольку разница между считываниями и эталонной сборкой генома может быть вызвана реальным полиморфизмом.Мы рассчитали среднюю частоту несоответствия, подсчитав количество пар оснований, которые не совпадали между отображенным считыванием и последовательностью генома, и разделив это число на длину отображенного считывания. Оцениваемые несоответствия включают несоответствия мягкого отсечения, вставки, удаления и замены, но не включают жесткое отсечение.

Отображенные чтения FLNC (используемые в конвейерах TAMA High / Low) имели наивысшую среднюю прогнозируемую частоту несоответствия (2,83%) и наибольшее количество каждого типа несоответствия, в то время как чтения кластера / польского имели самые низкие коэффициенты несоответствия (0.52%) с наименьшим количеством несовпадений каждого типа. Считывания с исправленными ошибками LoRDEC (средний уровень несоответствия 1,38%) имели такое же количество несоответствий отсечения, как и сопоставленные чтения FLNC (рис. 5a). Это указывает на то, что исправление LoRDEC может иметь некоторые проблемы с исправлением концов чтения, которые могут быть из-за меньшего покрытия короткого чтения на концах транскриптов.

Рис. 5

Оценка частоты ошибок и колебания трубопроводов. a Средний процент несоответствия выравнивания по типу несоответствия по трубопроводам. b Среднее колебание стыковочного соединения для всех моделей транскрипции, которое соответствует аннотации Ensembl во всех четырех конвейерах. Пороговое значение колебания стыка сращивания 30 п.н. на каждой стороне стыка было разрешено для сопоставления для этих графиков. Обратите внимание, что колебание более 30 п.н. возможно из-за ходьбы с колебательным движением. c Диаграммы разброса, чтобы проиллюстрировать величину колебания во всех трубопроводах, оцененных на моделях транскрипции, используемых на графике среднего колебания стыка стыка

Затем мы рассмотрели точность модели расшифровки путем измерения колебания на стыках стыков по отношению к моделям расшифровки, аннотированным в Ансамбль человеческих аннотаций для четырех различных трубопроводов (рис.5б-в). Колебание обычно возникает из-за большого количества ошибок чтения, сразу фланкирующих сплайсинговые соединения, что приводит к небольшим сдвигам в картировании концов каждого экзона [21]. Общее колебание для стыка в сгруппированных считываниях может быть больше указанного порога колебания из-за явления, которое мы называем ходьбой с колебаниями. Колебание происходит, когда предсказанные начала / концы экзонов представлены в шахматном порядке, так что разница между каждой ближайшей парой все еще находится в пределах порога колебания, но разница между самой далекой парой больше порога (рис.1в). Величина колебания между моделями транскрипции каждого конвейера по сравнению с эталонной аннотацией обеспечивает показатель точности моделей транскрипции, создаваемых каждым конвейером. Например, ожидается, что если модель транскрипции из аннотации, основанной на длинном чтении, содержит идентичные стыковые соединения (нулевое колебание стыковочного соединения) по сравнению с эталонной аннотацией, то модель транскрипции на основе длинного чтения будет иметь правильные спрогнозированные стыковые соединения. Мы проигнорировали колебание в стартовых и конечных сайтах транскрипта из-за высокой вариабельности этих свойств в естественной РНК [22, 23].Мы также оценивали только модели транскрипции Ensembl, которые охватывали все оцениваемые конвейеры, чтобы учесть различия в чувствительности между конвейерами.

Трубопровод TAMA High со строгой фильтрацией LDE имел самые низкие средние значения колебания на стык, в то время как трубопровод TAMA Low давал самое высокое среднее колебание (рис. 5b-c). Таким образом, несмотря на более низкую общую частоту ошибок в отображенных чтениях из польского конвейера, конвейер TAMA High имел больше стыков, соответствующих аннотации Ensembl.Это говорит о том, что LDE-фильтрация в трубопроводе TAMA High привела к более точной идентификации стыковых соединений.

Ошибочная кластеризация с исправлением ошибок между считыванием может привести к ошибочным моделям генов

Одной из основных проблем при использовании методов исправления ошибок между считыванием, таких как Cluster / Polish и LoRDEC, является возможность комбинирования последовательностей считывания из разных транскриптов, что может привести к в ошибочных моделях расшифровки. Различные транскрипты могут происходить из разных генов (путаница на уровне генов) или из комбинации альтернативных транскриптов в пределах одного и того же гена (мешанина на уровне транскриптов).Путаница на уровне генов обычно возникает из-за сходства последовательностей паралогов внутри семейств генов [23]. Как на уровне генов, так и на уровне транскриптов, более вероятно, что наиболее экспрессируемый ген или транскрипт в кластерах считывания будет маскировать менее экспрессированные гены. Это связано с тем, что окончательная последовательность кластера определяется охватом последовательности. Однако в случаях, когда охват чтения в кластере беспорядка одинаков для уникальных транскриптов, более вероятно, что результирующее чтение кластера будет иметь смесь последовательностей из каждого уникального транскрипта в кластере.

Чтобы исследовать, как часто возникают эти беспорядочные события, мы сравнили сопоставления чтения из сопоставленных чтений FLNC (TAMA Low) с чтениями с исправленными ошибками чтения (Polish и Lordec), чтобы найти чтения, которые сопоставлены с разными генами и транскриптами в каждом из них. сравнение. Хотя возможно, что сопоставления чтения FLNC ошибочны, они представляют последовательности чтения без какой-либо чрезмерной коррекции. Также считывание этой карты в разные локусы после исправления ошибок между считыванием указывает на то, что существует достаточно неоднозначности последовательности, чтобы поставить под сомнение эффект исправления ошибок между считыванием.

Сравнивая сопоставленные чтения FLNC с сопоставленными считываниями кластера / поляка, мы обнаружили 34 637 прочтений (0,6% картированных считываний), которые переключились с одного локуса гена на другой после кластерной / польской коррекции (рис. 6a). В этом переключении локусов гена участвовало 6774 гена, 3230 из которых были обнаружены только с конвейером TAMA Low, а 104 гена были обнаружены только с польским конвейером. Асимметрия количества уникальных генов между конвейерами предполагает, что Cluster / Polish может уменьшить обнаружение генов путем комбинирования считываний из генов с низкой экспрессией с генами с высокой экспрессией.

Рис. 6

Обмен считывания генов и транскриптов при исправлении ошибок. – график Circos, показывающий сопоставление считываний с различными локусами после использования Cluster / Polish для исправления длительных ошибок между считыванием. Каждая линия представляет одно считывание, а ширина каждого бункера хромосомы представляет количество считываний (общая толщина каждой линии). Концы строки с отступом показывают местоположение чтения FLNC, а концы без отступа показывают распределение чтения после исправления ошибок между чтениями. Этот график показывает 34 637 чтений из 4799 генов, перемещающихся в 2793 гена после кластера / полировки.Считывания организованы по хромосомам, однако обмен происходит внутри хромосомы и между хромосомами. b Circos график, как указано выше, но после гибридной коррекции между считыванием с помощью LoRDEC. Каждая линия представляет собой одно чтение, перемещающееся от одного гена к другому, при этом 19 064 чтения из 2292 генов перемещаются в 2319 генов после исправления ошибок LoRDEC. c Ген PRAMEF8 имеет покрытие из 9 картированных считываний FLNC (TAMA Low). Пять из этих чтений были сгруппированы и объединены с другими чтениями в один кластер, прочитанный Cluster / Polish, в результате чего получилось беспорядочное сопоставление чтения кластера с геном PRAMEF15 (польский конвейер).Это предполагает ложноотрицательный результат для PRAMEF8 и ложноположительный результат для PRAMEF15 в польском трубопроводе из-за использования Cluster / Polish

. отображенные исправленные чтения LoRDEC. Было 19 064 чтения (0,3% картированных считываний), которые переключались с одного генного локуса на другой (рис. 6b), с участием в общей сложности 3476 генов, 775 из которых были обнаружены только с конвейером TAMA Low, в то время как 675 генов были обнаружены только с трубопровод Lordec.

Чтобы получить более подробное представление о том, что происходит во время события чтения, мы исследовали преимущественно экспрессируемый антиген семейства генов MElanoma (PRAME). Семейство генов PRAME тесно связано с развитием рака [24] и используется в качестве биомаркера для идентификации различных форм рака. В семействе генов PRAME 24 аннотированных паралога [25]. В этом примере польский конвейер не может обнаружить один из паралогов PRAME (PRAMEF8), ошибочно прогнозируя выражение другого паралога (PRAMEF15), который не имеет поддержки чтения с отображением FLNC.Конвейер TAMA Low (использующий сопоставленные чтения FLNC) обнаруживает, что 9 операций чтения отображаются в PRAMEF8 (рис. 6c), в то время как польский конвейер (с использованием сопоставленных считываний кластера / поляка) не показывает сопоставления считываний с PRAMEF8. Из 9 чтений PRAMEF8 из конвейера TAMA Low, 5 из этих чтений были кластеризованы и объединены с другими чтениями (3 из PRAMEF11, 4 из PRAMEF4, 2 из PRAMEF7 и 3 из PRAMEF27 в соответствии с сопоставлением FLNC) в 1 кластер, прочитанный кластером / Польский, в результате чего получено беспорядочное сопоставление чтения кластера с геном PRAMEF15 (польский конвейер).Мы проанализировали сходство последовательностей между двумя паралогами путем выравнивания последовательностей транскриптов PRAMEF8 и PRAMEF15 с Muscle [26] и обнаружили, что они имеют 76% идентичности. Хотя два гена имеют сходные экзонные последовательности, идентичность картирования генома для считываний была выше, чем сходство последовательностей между двумя паралогами. Считывание FLNC PRAMEF8 с самым низким показателем идентичности картирования генома имело идентичность картирования 89%, а 6 считываний FLNC PRAMEF8 имели идентичность картирования более 98%. Таким образом, есть веские доказательства того, что чтения правильно отображены в конвейере TAMA Low и были изменены до точки неправильного сопоставления в польском конвейере.Этот конкретный тип ошибки может иметь серьезные последствия для исследований, направленных на определение экспрессии генных биомаркеров.

Мы также исследовали, как ошибочное исправление ошибок между считыванием может привести к путанице на уровне транскрипции. В этом случае, когда считывания из разных транскриптов одного и того же гена сгруппированы для исправления ошибок, результирующая последовательность в лучшем случае будет представлять только транскрипт с более высокой степенью экспрессии и, в худшем случае, представляет собой ошибочно перемешанную последовательность. Сравнивая конвейер TAMA Low с польским конвейером, мы обнаружили 477 351 считывание, отображаемое в разных моделях транскриптов в одном и том же гене.Было обнаружено 112 891 транскрипт, затронутый путаницей на уровне транскриптов, 44 852 из которых были обнаружены только в аннотации TAMA Low, а 1372 транскрипта были найдены только в польской аннотации. Сравнивая конвейер TAMA Low с конвейером Lordec, мы обнаружили 187 829 операций чтения, которые сопоставлены с различными моделями транскрипции. Это включало 142 704 транскрипта, при этом 7117 транскриптов были обнаружены только в аннотации TAMA Low, и 11732 транскрипта были найдены только в аннотации Lordec. Важно отметить, что эта оценка расшифровки стенограмм является лишь приблизительным признаком, поскольку без достоверной информации о реальных стенограммах невозможно узнать, какая модель стенограммы является точной.

Подводя итог, можно сказать, что как в длинном, так и в коротком конвейере исправления ошибок между считыванием мы наблюдали значительное количество несовпадений при чтении на уровне генов и транскриптов, что может привести к не биологически точным предсказаниям моделей генов и транскриптов. Следовательно, чтобы избежать проблем при чтении, мы предлагаем отказаться от исправления ошибок между чтениями и вместо этого сосредоточиться на методах, таких как алгоритм TAMA Collapse LDE, для удаления чтений с профилями ошибок, которые могут привести к ошибочным предсказаниям модели транскрипции.

Анализ предсказанных экспрессированных локусов, не найденных в аннотации Ensembl для человека

Учитывая, что конвейер TAMA High имел самые высокие показатели чувствительности и точности для неуправляемой аннотации в наборах данных сравнительного анализа, мы использовали локусы генов, предсказанные конвейером TAMA High для исследования потенциально новых генов в наборе данных UHRR. Чтобы получить представление о 23302 прогнозируемых генных моделях TAMA High, не обнаруженных в Ensembl (модели специфических генов TAMA High), мы рассмотрели несколько функций, которые обеспечивают поддержку реальных генных моделей или опровергают их: потенциал кодирования, количество экзонов, перекрытие интронов с другими генами. , перекрываются с регуляторными особенностями и присутствием непосредственно расположенных ниже геномных участков поли-А.Комбинация кодирующего потенциала и сплайсинговых соединений часто используется в качестве доказательства функционального гена. Напротив, перекрытие с интронами (от других генов), геномный поли-А простирается непосредственно ниже генной модели, а отсутствие сплайсинговых соединений (одиночных экзонных транскриптов) свидетельствует о том, что источником модели может быть любой нефункциональный транскрибируемый продукты или геномное заражение.

Кодирующий потенциал оценивался с использованием трех дополнительных методов. Во-первых, мы использовали инструмент анализа последовательности открытой рамки считывания, CPAT [27], для определения кодирующего потенциала.Этот метод работает только в том случае, если модели транскриптов не содержат сдвигов кадра, вызванных ошибочным вызовом соединения сращивания. Во-вторых, мы использовали слияние TAMA для идентификации моделей генов, которые перекрывают геномные локусы (на одной цепи) генов, кодирующих белок, в аннотации Ensembl. В-третьих, мы использовали конвейер TAMA ORF / NMD, который представляет собой устойчивый к сдвигу рамки метод сопоставления последовательностей транскриптов с пептидными последовательностями из базы данных UniProt [28]. Мы объединили эти три метода, чтобы учесть различные ошибки, которые могут вызывать ложноотрицательные результаты при прогнозировании генов, кодирующих белок.

Лишь небольшое количество генных моделей, предсказанных TAMA High, которые не были найдены в аннотации Ensembl v94 (18 из 23 302), поддерживались всеми функциями, которые считаются свидетельством функциональности (мультиэкзонная, кодирующая, межгенная и обработанная). поли-А) (рис.7). Это ожидается, учитывая, что эти функции используются конвейерами короткого чтения аннотаций RNA-seq для проверки. Следовательно, многие модели генов с этими характеристиками, вероятно, уже были идентифицированы в аннотации Ensembl.

Рис. 7

Предполагаемый распад новых генов. Разбивка нового гена по признакам. Комбинации признаков подтверждают, что каждый ген либо реален и принадлежит к определенному биотипу, либо не является реальным, и является результатом ошибочных прогнозов модели. Фракция с наибольшим набором функций указывает на ненастоящие модели. Однако все еще существуют тысячи локусов с наборами признаков, которые совместимы с реальными генами.

Было 1059 моделей высокоспецифичных генов TAMA, которые были межгенными, единственными экзонными и имели геномный поли-А.Эти особенности обычно приписывают загрязнению геномной ДНК. Однако точный механизм того, как эти последовательности попадают в конечную библиотеку секвенирования, недостаточно хорошо изучен.

Двумя наиболее распространенными наборами характеристик для моделей специфичных генов TAMA High являются «один экзонный, некодирующий, перекрывающийся интронный ген и геномный поли-А» при 24% (5679) и «единственный экзонный, кодирующий, интронный ген. перекрываются, а геномный поли-А »составляет 19% (4440). Эти наборы функций обычно используются в качестве индикаторов для нереальных моделей, поскольку они могут быть получены из внутреннего прайминга необработанной РНК.Однако это потребует дальнейшего усечения матрицы, чтобы полученная модель не перекрывалась с транскриптами из гена происхождения. Теоретически подмножество локусов с первым набором признаков может состоять из днРНК, тогда как подмножество локусов со вторым набором признаков может состоять из обработанных псевдогенов. Вместе они составляют более 43% моделей специфичных генов TAMA High.

Было предсказано 2566 генных моделей (11% высокоспецифичных генных моделей TAMA), которые не кодируют процессированные хвосты поли-А.Из них 461 были мультиэкзонными, а 2105 – одиночными экзонными генами (рис. 7). Учитывая, что эти модели не перекрывают какие-либо экзонные области моделей генов в аннотации Ensembl, это будет представлять собой значительное увеличение количества предсказанных днРНК для генома человека.

Было обнаружено 1557 (7%) высокоспецифичных генных моделей TAMA с характеристиками (мультиэкзонными, кодирующими, перекрывающимися интронами и процессированным поли-A), которые указывают на настоящие гены, кодирующие белок, которые существуют в интронах более крупных генов.Однако возможно, что это альтернативные транскрипты из окружающих генов, но из-за отсутствия 5′-полноты перекрывающиеся 5′-экзоны не были представлены в моделях транскриптов. Если эти генные модели получены из альтернативных транскриптов окружающих их генов, эти модели будут представлять новые транскрипты.

Эти анализы были основаны на человеческой аннотации Ensembl v94, с тех пор была выпущена аннотация Ensembl v100. Эта новая версия Ensembl содержит более тысячи новых моделей генов днРНК по сравнению с v94.Мы сравнили аннотацию TAMA High с v100 и обнаружили 144 совпадающих гена lncRNA, которые не присутствовали в v94. Это вызывает вопросы относительно того, что именно присутствует в наших данных секвенирования и каков наилучший способ дальнейшего анализа этой информации для получения биологически значимых результатов.

Поскольку UHRR является одним из наиболее тщательно подготовленных образцов РНК, это указывает на то, что исследователям потребуются более совершенные методы либо подготовки РНК, либо секвенирования анализа для уверенной идентификации новых генов.

Сворачивание зарождающегося транскрипта играет основную роль в определении скорости элонгации РНК-полимеразы

Основные моменты

•

Структуры возникающей РНК коррелируют с быстрым удлинением РНК с помощью RNAPI 1 in vivo

ограничение обратного отслеживания RNAPI

in vitro

•

Содержание GC в пузыре транскрипции настраивает скорость элонгации транскрипции

•

Образующийся сворачивание транскрипта модулирует динамику всех трех RNAP in vivo

Скорости элонгации транскрипции влияют на процессинг РНК, но регуляция, специфичная для последовательности, плохо изучена.Мы обратились к этому in vivo , проанализировав RNAPI в S. cerevisiae . Картирование RNAPI с помощью распространения хроматина Миллера или УФ-сшивания выявило 5′-обогащение и поразительно неравномерное размещение локальной полимеразы вдоль рДНК, что указывает на существенные различия в скорости транскрипции. Две особенности зарождающегося транскрипта коррелировали с распределением RNAPI: энергия сворачивания и содержание GC в пузыре транскрипции. In vitro эксперименты подтвердили, что сильные структуры РНК, близкие к полимеразе, способствуют прямой транслокации и ограничивают обратный ход, тогда как высокий GC в пузыре транскрипции замедляет элонгацию.Математическая модель удлинения RNAPI подтвердила важность складывания растущей РНК в транскрипции. RNAPI из S. pombe был так же чувствителен к укладке транскриптов, как и RNAPII и RNAPIII S. cerevisiae . Для RNAPII неструктурированная РНК, которая способствует замедлению элонгации, была связана с более быстрым котранскрипционным сплайсингом и использованием проксимального сайта сплайсинга, что указывает на регуляторную значимость для укладки транскриптов.

Ключевые слова

элонгация транскрипции

РНК-полимераза 1

Сворачивание РНК

дрожжи

математическое моделирование

рДНК

котранскрипционные события

Обработка РНК

возникающие РНК

Топология ДНК

© 2021 Авторы.Опубликовано Elsevier Inc.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Стенограмма пресс-конференции Кевина Хубера

КЕВИН ХУБЕР (при посещении стадиона Пола Брауна)

В: Что ты думаешь о том, чтобы тебя взяли в армию «Бенгалы»? KH: Это круто. Я вырос в Цинциннати. Я родился и вырос. Никогда бы не подумал, что буду играть за команду своего родного города. Это похоже на сбывшуюся мечту. Я остаюсь дома, остаюсь рядом со своей семьей – моим вспомогательным персоналом. Так что будет здорово иметь возможность играть перед ними во всех этих играх.Я действительно с нетерпением жду этого.

В: Когда ты увлекся пантинг-аспектом футбола? KH: Я занимался этим почти всю свою жизнь. Я начал играть в футбол еще в начальной школе, детском саду. Я всегда был вратарём, потому что не был самым быстрым, но мог ударить по мячу дальше всех. В семье есть некоторые проблемы. Мой отец был крутым игроком в Ксавье, когда у них была команда. Мой брат немного поиграл в Mt. Святой Джо. Моя сестра играла в футбол в колледже Дэвидсон.Другая моя сестра играла в футбол в старшей школе. И я должен держать там свою маму. В начальной школе она была чемпионкой по кикболу. Моя бабушка хотела, чтобы я это сказал. Она была чемпионкой по кикболу. Так что я полагаю, что в семье есть проблемы.

Вопрос: Насколько игра за бывших и нынешних главных тренеров UC Марка Дантонио и Брайана Келли помогла вам подготовиться к тому, чтобы стать игроком НФЛ? KH: Это очень помогло. Они держали наши головы заземленными. Они позаботились о том, чтобы мы сосредоточились только на том, чтобы стать лучше, вместо того, чтобы пытаться ускорить процесс, попав в НФЛ, что бы ни привело будущее.Они действительно помогли нам сосредоточиться и психологически подготовиться к любой ситуации, которая может произойти. Когда рядом были все эти тренеры, тренер Дантонио из штата Огайо и отличная программа там, было просто здорово, что он был тренером. Тренер Келли пришел с совершенно другим стилем обучения, но в то же время он хотел для нас лучшего и подготовил нас наилучшим образом. Это очень помогло.

В: Помогло ли вам тренироваться с Марвином Льюисом и Даррином Симмонсом в игре Senior Bowl, познакомиться с тренерским штабом? KH: Я думаю, это очень помогло.Я их вижу почти раз в месяц. Я видел их в Senior Bowl. Я видел их на комбинате. Я видел их в местный день. Я чувствую, что вижу их все время. Наверное, я им уже надоел. Теперь они застряли со мной. Но очень помогло увидеть, какой тренерский стиль у тренера Симмонса, увидеть, чего он от меня ожидает. У него самого опыт работы на лодке. Он играл в Канзасе. Это очень поможет. Он сможет научить меня всему, что знает.

В: Что делает условия для ударов ногами в Цинциннати уникальными? KH: Вы не хуже меня знаете, что сегодня может быть 60 градусов, а завтра 25 градусов.У вас может быть ветер со скоростью 60 миль в час. Я был на игре (Bengals) в прошлом году, когда у нас дул ураганный ветер. Я был на верхней палубе и думал, что верхняя палуба оторвется. Я спустился на нижнюю палубу и просто наблюдал. Когда я учился в Университете Цинциннати, у нас было несколько тренировок на полях (Bengals). Я видел эффект озера от реки, и я думаю, что это очень поможет, большой бонус для меня, живущего в Цинциннати.

В: Есть ли в НФЛ кто-нибудь, кому вы бы хотели подражать своим ударам? KH: Я просто люблю наблюдать за всеми.Я не собираюсь смотреть на одного человека и говорить: «Ну, вот кем я буду», потому что все разные. Если вы можете брать мелочи от всех остальных, от множества людей и складывать их вместе – это то, что я пытаюсь делать. Возьмем, к примеру, Джеффа Фиглза. Ему за сорок, и он все еще здоров. Я узнал, что он собирается использовать свои сильные стороны. Возможно, у него не самые сильные ноги, но он лучше всех позиционирует мяч по направлению. Так что, если я могу выбрать его направление и силу ног Шейна Лехлера, у него огромная нога, и он может вести мяч на 70 ярдов.Так что, если я могу выбирать что-то у всех, я бы хотел это сделать. Мне нравится смотреть на как можно больше людей.

В: Вы рассчитывали пройти определенный раунд драфта? KH: Я надеялся поехать рано утром, но знал, что это продлится долго. Если вы посмотрите прошлые драфты, вы посмотрите на взятых игроков и кикеров, я знал, что меня даже не драфтируют. В прошлом году был взят один игрок, а годом ранее – три. Никогда не знаешь, что произойдет.Надейся на лучшее, приготовься к худшему. Вот что я сделал. Я был готов стать свободным агентом. Я составил список команд, из которых, как мне казалось, мог бы выбрать. Я просто надеялся, что меня примут в армию и мне не придется выбирать.

В: Вы подобрали и поехали прямо с поля для гольфа? KH: Я остановился, потому что мой отец был примерно в двух лунках назад. Они ушли навсегда. У них, должно быть, была ужасная дыра. Им потребовалась целая вечность, чтобы добраться туда. Я немного поговорил с ними, потом они отвезли меня домой, чтобы я мог взять машину и поехать сюда.

В: Когда вы разработали направленный удар ногой? KH: Я действительно думаю, что это началось с этого нового состава. Когда я встретился с тренером Элстоном (координатором специальных команд Калифорнийского университета Майком Элстоном), он действительно упорно настаивал на том, чтобы направлять и удерживать парней на боковой линии. Это была одна из самых важных вещей, которые мне нужно было сделать, чтобы начать там. Я действительно много работал над этим. Я впервые встретился со своим тренером по пантингу пару лет назад, и он мне в этом очень помог. Только когда я поступил в колледж, я начал понимать все детали того, как стать лучшим игроком.

В: Насколько приятно было сыграть в больших играх в прошлом году? KH: Приятно получить хорошее внимание. Обычно к игрокам просто не обращают внимания. Когда у тебя плохой пант, тебя замечают. Чтобы получить хорошее признание, это довольно хорошее чувство. Если выйти за пределы поля, и у тебя будет вся команда – даже главный тренер дает тебе пятерку, это прекрасное чувство. Это дает вам большую уверенность и большой импульс. Это поможет вам со следующей игрой и следующей игрой.

BRCA1 – неважно, как вы его склеите

% PDF-1.4 % 123 0 объект > эндобдж 122 0 объект > поток doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-18-3190application / pdf

BRCA1 – неважно, как вы его соедините

10.1158 / 0008-5472.CAN-18-3190 http://dx.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-319-4-16false10.1158/0008-5472.CAN-18-3190

психокерамика. org

Societyofpsychoceramics.org

10.1158 / 0008-5472.CAN-18-319-4-16false

психокерамика.labs.crossref.org

Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.406 / W Unicode2021-07-20T10: 22: 02-07: 002019-04-16T08: 03: 38 + 05: 302021-07-20T10: 22: 02-07: 00 Acrobat Distiller 8.1.0 (Windows) uuid: 016261c1-1dd2-11b2-0a00-5308275d6100uuid: 016261c4-1dd2-11b2-0a00-aa0000000000 конечный поток эндобдж 121 0 объект > эндобдж 116 0 объект > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 2 0 obj > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 44 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 45 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >> эндобдж 46 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >> эндобдж 47 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >> эндобдж 48 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >> эндобдж 49 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >> эндобдж 50 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Type / Page >> эндобдж 125 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 155 0 объект [162 0 R 163 0 R 164 0 R 165 0 R 166 0 R] эндобдж 156 0 объект > поток q 540.0594177 0 0 68.6011963 21.9702911 665.3988037 см / Im0 Do Q BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 85,56998 584,99988 тм (Опубликовано в Интернете, впервые 16 апреля 2019 г.) Tj / T1_1 1 Тс -5.557 0 Тд (Рак Res \ 240) Tj / T1_0 1 Тс 0 1 ТД (\ 240) Tj 0 1.00001 TD (Дэн Ли, Лиза М. Харлан-Уильямс, Ишвари Кумарасвами и др.) Tj / T1_2 1 Тс 0 1 ТД (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс 18 0 0 18 111.7558 625 тм (Независимо от того, как вы это соедините) Tj / T1_4 1 Тс -1,09799 0 тд (-) Tj / T1_3 1 Тс -3,444 0 Тд (BRCA1) Tj ET 30 530 524 35 рэ 0 0 мес. S BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120.94202 537.99997 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -7,55696 1 тд (Обновленная версия) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 141 529,99994 тм (\ 240) Tj / T1_0 1 Тс 16.67598 1 тд () Tj 0 0 1 рг -15.06398 0 Тд (10.1158 / 0008-5472.CAN-18-3190) Tj 0 г -1,612 0 Тд (DOI 🙂 Tj 0 1.00001 TD (См. Самую последнюю версию этой статьи по адресу:) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 509,99997 тм (\ 240) Tj 0 1 ТД (\ 240) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 489,99997 тм (\ 240) Tj Т * (\ 240) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 469,99997 тм (\ 240) Tj Т * (\ 240) Tj ET 30 345 524 125 рэ 0 0 мес. S BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120.94202 437,99997 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -5.66901 1 тд (Оповещения по электронной почте) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 295,49963 450 тм (относится к этой статье или журналу.) Tj 0 0 1 рг -15.44996 0 Тд (Зарегистрируйтесь, чтобы получать бесплатные уведомления по электронной почте) Tj ET BT 0 г / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120,94202 404,99994 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -6.38997 1 тд (Подписки) Tj 0,556 1,00001 тд (Отпечатки и) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 141 407,99994 тм (\ 240) Tj 13,46496 1 тд (.) Tj 0 0 1 рг -6.85098 0 Тд ([email protected]) Tj 0 г -6.61398 0 Тд (Отделение) Tj 0 1.00001 TD (Чтобы заказать перепечатку статьи или подписаться на журнал, свяжитесь с нами \ t Публикации AACR) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120.94202 382.99997 тм (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс -5.66901 1 тд (Разрешения) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 141 344,99985 тм (\ 240) Tj 0 1 ТД (Сайт Rightlink.) Tj 0 1.00001 TD (\ (CCC \)) Tj 0 1 ТД (Нажмите «Запросить разрешения», чтобы перейти на страницу защиты авторских прав \ Рэнс Центр) Tj 37. \ q

Наглость vs.Наглость | Подкаст «Ревизионистская история» с Малкольмом Гладуэллом E9 / S4 (стенограмма) | Саймон Сэйс

Эпизод 9 | 4 сезон | Ревизионистская история
Продолжительность: 39 мин | Выпущено: 15 августа 2019 г.

Чтобы увидеть полную стенограмму, перейдите сюда.

ПРИМЕЧАНИЕ: Эпизоды 3-11 содержатся в одном интерактивном проекте. Щелкните стрелку вниз справа от названия серии, чтобы выбрать ее.

Малькольм Гладуэлл: Внимание: в этом эпизоде ​​я беру интервью у парня старой закалки из Нью-Йорка, который сбрасывает много F-бомб, просто чтобы вы знали.

Малькольм Гладуэлл: Назовите свое имя так, как сказал бы израильтянин.

Милли Авитал: Милли Авитал

Малькольм Гладуэлл: И скажите: «Меня зовут Милли Авитал» на иврите.

Милли Авиталь: [?] Милли Авиталь.

Малькольм Гладуэлл: Меня зовут Малькольм Гладуэлл. Вы слушаете «Историю ревизионистов», мой подкаст о вещах, которые упускают из виду и неправильно понимают. До сих пор в 4 сезоне я говорил о великих темах, огромных проблемах.Этот эпизод о чем-то очень конкретном: о слове.

Малькольм Гладуэлл: Слово, которое меня интересует, – наглость.

Милли Авитал: Хорошо.

Малькольм Гладуэлл: Я решил, что хочу исследовать феномен наглости.

Малькольм Гладуэлл: Поскольку Миллия – моя соседка и израильтянин, она согласилась помочь.

Малькольм Гладуэлл: Давай научим гоя Малькольма правильно произносить это слово.Во-первых, делаем ли мы такие штуки в горле, что так много…

Милли Авиталь: Горло…

Малькольм Гладуэлл: Кх. Я должен освоить кх?

Милли Авиталь: Мягковато, ха. Думаю, у нас он ближе к арабскому, кх, кх. Он глубже в горле и гораздо больше контакта с мягким небом, хх. Это действительно глубже.

Малькольм Гладуэлл: Да, да. Итак, более мягкий – не хо, а хо, ЧУТЗпа, хуцПА?

Милли Авиталь: Нет, ху… Хорошо, звук правильный, кх, кх, он глубокий, но гласный не хо; это ху.

Малькольм Гладуэлл: Кху?

Милли Авитал: ChutzPAH.

Малькольм Гладуэлл: ChutzPAH?

Милли Авиталь: Ага. На иврите есть только a, e, o, u. Нет ни дифтонгов, ни оо … Нет книги и книги, да, есть только бу. Так ты понимаешь или я говорю сам с собой? Для меня это очень ясно, потому что, к сожалению, я так много над этим работал, но хорошо. Так что это не ЧУТЦпа.

Малькольм Гладуэлл: Да, да.

Милли Авиталь: Как будто это не Милли; это Милли.

Малькольм Гладуэлл: Милли.

Милли Авитал: E, o, u. Итак, это khoo-tz, T.

Малкольм Гладуэлл: Угу?

Милли Авиталь: Не ого.

Малькольм Гладуэлл: Кху?

Милли Авиталь: Да, так лучше, Малькольм.

Малькольм Гладуэлл: Мне кажется, что сейчас в мире много наглости, и что, возможно, было бы полезно узнать об этом что-нибудь побольше, поэтому я начал с Милли и первого, что она мне сказала. в том, что нет ни одной наглости; на самом деле их две, американская версия и израильская версия.Я знал наглость, но не эту другую.

Малькольм Гладуэлл: ЧУТЗпа?

Милли Авиталь: Неплохо, но не лапа, тьфу.

Малькольм Гладуэлл: Тьфу?

Милли Авитал: Па. На самом деле этого гласного не существует в английском языке.

Малькольм Гладуэлл: ЧУТЗпа.

Милли Авитал: ChutzPAH.

Малькольм Гладуэлл: Хорошо.

Milli Avital: Теперь вам нужно иметь chutzPAH.