Создан 23 мая ’17 в 7: 442017-05-23 07:44

Не тот ответ, который вы ищете? Просмотрите другие вопросы с тегами элементов или задайте свой вопрос.

Ваша конфиденциальность

Нажимая «Принять все файлы cookie», вы соглашаетесь, что Stack Exchange может хранить файлы cookie на вашем устройстве и раскрывать информацию в соответствии с нашей Политикой в ​​отношении файлов cookie.

Принимать все файлы cookie Настроить параметры

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Специальный выпуск: Медь в синтезе и катализе

Специальный выпуск журнала Molecules (ISSN 1420-3049).Этот специальный выпуск относится к разделу «Органическая химия».

Крайний срок приема рукописей: 30 сентября 2021 г. .

Редакторы специальных выпусков

Кафедра химии и биотехнологии Научного факультета Таллиннского технологического университета, Akadeemia tee 15, 12618 Таллинн, Эстония
Интересы: органическая химия; металлоорганическая химия; асимметричный синтез; катализ; хиральность; медицинская химия; синтез натуральных продуктов

Школа материаловедения и инженерии; Университет Сунь Ятсена, Гуанчжоу 510275, Китай
Интересы: устойчивый катализ; вычислительная химия; металлоорганические соединения; зеленый синтез; химическое топливо

Ключевая лаборатория исследований хиральных молекул и лекарств в Гуандуне, Школа фармацевтических наук, Университет Сунь Ятсена, Гуанчжоу 510006, Гуандун, Китай
Интересы: асимметричный катализ; разработка методологии; открытие ведущих соединений; металлический карбен; гетероциклы

Информация о специальном выпуске

Уважаемые коллеги,

Текущая потребность в устойчивом развитии стимулировала значительную исследовательскую деятельность в области химического синтеза и катализа с переходными металлами, распространенными на земле.

Медь и ее соединения легко доступны и представляют собой один из первых металлов, известных человечеству. История катализа переходных металлов в органической химии также началась с катализируемого медью гомосочетания алкинов, открытого Карлом Глейзером в 1869 году. С тех пор медьсодержащие материалы приобрели впечатляющий послужной список в качестве катализаторов в органическом синтезе, включая различные реакции кросс-сочетания углерод-углерод и углерод-гетероатом, аэробное окисление, трифторметилирование и т. д.Разработаны многочисленные асимметричные превращения, опосредованные хиральными комплексами меди. Кроме того, координационная химия меди важна для самосборки сложных супрамолекулярных структур и металлорганических каркасов (MOF).

Целью этого специального выпуска является сбор оригинальных исследовательских работ и обзорных статей, посвященных всем аспектам современной химии меди и ее использованию в органическом синтезе, катализе, химическом зондировании и инновационных методах разделения.Также приветствуется подача рукописей, описывающих подготовку новых медьсодержащих материалов с применением в различных областях химической науки и техники.

Д-р Дмитрий Кананович
Проф. Д-р Чжуофэн Ке
Проф. Д-р Синьфан Сю
Приглашенные редакторы

Информация для подачи рукописей

Рукописи должны быть представлены онлайн по адресу www.mdpi.com, зарегистрировавшись и войдя на этот сайт. После регистрации щелкните здесь, чтобы перейти к форме отправки.Рукописи можно подавать до указанного срока. Все статьи будут рецензироваться. Принятые статьи будут постоянно публиковаться в журнале (как только они будут приняты) и будут перечислены вместе на веб-сайте специального выпуска. Приглашаются исследовательские статьи, обзорные статьи, а также короткие сообщения. Для запланированных статей название и краткое резюме (около 100 слов) можно отправить в редакцию для объявления на этом сайте.

Представленные рукописи не должны были публиковаться ранее или рассматриваться для публикации в другом месте (за исключением трудов конференции).Все рукописи тщательно рецензируются в рамках процесса одинарного слепого рецензирования. Руководство для авторов и другая важная информация для подачи рукописей доступна на странице Инструкции для авторов. Molecules – это международный рецензируемый журнал с открытым доступом, выходящий один раз в месяц, издающийся MDPI.

Пожалуйста, посетите страницу Инструкции для авторов перед отправкой рукописи. Плата за обработку статьи (APC) для публикации в этом журнале с открытым доступом составляет 2000 швейцарских франков.Представленные статьи должны быть хорошо отформатированы и написаны на хорошем английском языке. Авторы могут использовать MDPI Услуги редактирования на английском языке перед публикацией или во время редактирования автора.

Ключевые слова

• Медь
• Переходные металлы
• Органический синтез
• Координационная химия
• Металлоорганические соединения
• Металлокомплексы
• Гомогенный катализ
• Гетерогенный катализ
• Новые синтетические методы
• Энантиоселективный синтез
• Хиральность
• Химические датчики
• Каркасы металлоорганические
• Механические исследования
• Зеленая химия
• Устойчивое развитие

Опубликованные статьи (1 статья)

Роль молекул железа и меди в уязвимости нейронов голубого пятна и черной субстанции при старении

Аннотация

В этом исследовании был проведен сравнительный анализ нейрональной уязвимости, связанной с металлами, в двух ядрах ствола мозга, голубом пятне (LC) и черном веществе (SN), известных мишенях этиологических токсинов при болезни Паркинсона и связанных с ней расстройствах.Нейроны LC и SN pars compacta дегенерируют при болезни Паркинсона и других паркинсонизмах; однако нейроны LC поражаются сравнительно меньше и с различной степенью поражения. В этом исследовании железо, медь и их основные молекулярные формы, такие как ферритины, церулоплазмин, нейромеланин (NM), марганец-супероксиддисмутаза (SOD) и медь / цинк-SOD, были измерены в LC и SN у здоровых людей в разном возрасте. Содержание железа в LC было намного ниже, чем в SN, а соотношение ферритин / железо тяжелой цепи в LC было выше, чем в SN.Концентрация ЯМ была одинаковой в ЖК и СН, но содержание железа в ЯМ ЖК было намного ниже, чем в СН. В обоих регионах ферритины тяжелой и легкой цепи присутствовали только в глии и не обнаруживались в нейронах. Эти данные предполагают, что в нейронах LC мобилизация и токсичность железа ниже, чем в нейронах SN, и эффективно буферизуется с помощью NM. Более серьезные повреждения SN могут быть связаны с более высоким содержанием железа. Ферритины выполняют ту же функцию буферизации железа в глиальных клетках.Уровни церулоплазмина были одинаковыми в LC и SN, но содержание меди было выше в LC. Однако содержание меди в НМ LC было выше, чем в SN, что указывает на более высокую мобилизацию меди в нейронах LC. Марганец-СОД и медь / цинк-СОД имели сходный возрастной тренд в LC и SN. Эти результаты могут объяснить по крайней мере одну из причин, лежащих в основе более низкой уязвимости ЦП по сравнению с СН при паркинсонических синдромах.

Locus coeruleus (LC) – это основная область мозга, содержащая нейроны норадреналина.Ростральные проекции этих нейронов, по-видимому, участвуют в модуляции нейрональной активности, метаболизма и памяти (1, 2), тогда как проекции спинного мозга, как известно, модулируют функцию спинномозговых мотонейронов (3, 4).

Потеря нейронов в ЦП происходит при таких состояниях, как болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера и синдром Дауна (5, 6) с различной потерей клеток в ростральной и каудальной частях ЦП. При болезни Альцгеймера и синдроме Дауна неясно, является ли потеря нейронов в LC первичным событием или следствием ретроградной дегенерации кортикально выступающих клеток из-за потери кортикальных синапсов.При идиопатической БП в большинстве исследований документально подтверждена более высокая степень потери нейронов в черной субстанции (ЧВ) по сравнению с ЦП (5-8). Однако недавнее исследование показало обширное повреждение нейронов LC при БП (9). SN и LC имеют анатомическое и биохимическое сходство, оба пигментированы из-за нейромеланина (NM), и оба состоят из катехоламинергических нейронов. Тем не менее, у субъектов, отравленных 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином, нейроны LC сохранены, тогда как в SN происходит значительное истощение нейронов (10, 11).Кроме того, при других типах паркинсонических синдромов, вызванных воздействием токсинов, нейроны LC кажутся менее поврежденными, чем нейроны SN (12, 13). Почему-то при интоксикации нейроны в LC кажутся менее уязвимыми, чем в SN.

В предыдущих исследованиях была проанализирована тенденция к старению таких факторов, как железо, ферритины и NM (14-18). Эти факторы могут влиять на жизнеспособность нейронов и претерпевать драматические изменения при БП. Старение также является важным фактором риска развития болезни Паркинсона. Таким образом, представляется актуальным установить возрастную тенденцию элементов, участвующих в окислительном стрессе, таких как железо, медь и родственные молекулы, все из которых считаются предполагаемыми патогенными факторами.

Из-за их роли в перекисном окислении в настоящем исследовании возрастные тенденции железа, меди, их основных запасных белков ферритина и церулоплазмина (Cp), вместе с ферментами супероксиддисмутазы марганца (SOD) и медью / цинком-SOD, были определены в SN и LC человека в разном возрасте. Будучи сильным хелатором железа и других токсичных металлов (18), НМ также исследовали с точки зрения его способности связывать органические токсины (19, 20), что сделало НМ сильным модулятором клеточных эффектов металлов и органических токсинов (21).

Материалы и методы

Коллекция областей мозга. Для этого исследования образцы среднего мозга были получены во время вскрытия трупов мужчин и женщин, умерших в разном возрасте (от 14 до 97 лет) без признаков нейропсихиатрических и дегенеративных расстройств. Вскрытие проводилось через 24 ч после смерти. Образцы LC и SN всегда тщательно анализировались одним и тем же человеком (L.Z.), а затем хранились при -80 ° C до использования.Ткани для гистологической и гистохимической оценки фиксировали в 10% формалине и обрабатывали соответствующим образом. Нормальные субъекты, включенные в это исследование при патологическом обследовании, не показали макроскопических изменений неврологического и сосудистого типа. При гистологическом исследовании телец Леви и других патологических маркеров не обнаружено. Подавляющее большинство использованных образцов LC и SN были получены от одних и тех же субъектов. Однако из-за меньшего размера LC по сравнению с SN, количество доступной LC ткани иногда было недостаточным для всех измерений, поэтому в этом исследовании также использовались образцы LC от других субъектов.

Изоляция ЯМ от ЖК. Объединенные образцы LC были обработаны, как описано для SN, чтобы выделить NM в ссылке. 18.

Определение концентрации ЯМ в образцах ЖХ. Уровни NM были измерены, как указано в исх. 18.

Изоляция НМ от СН. Объединенные образцы SN были обработаны для выделения ЯМ, как ранее описано в ссылках. 22-24.

Определение концентрации ЯМ в образцах СН. Содержание NM в образцах SN определяли, как описано в ссылке. 18.

Определение концентрации ферритина тяжелой (H-) и легкой (L-) цепи. Образцы LC и SN были обработаны для количественного определения ферритина, как описано в ссылке. 17.

Определение концентрации Cp. Образцы LC и SN гомогенизировали в буфере для лизиса, содержащем Трис (20 мМ, pH 7,4) и смесь ингибиторов протеаз (Sigma), и центрифугировали при 2240 × g в течение 10 минут при 4 ° C.Супернатанты собирали и хранили при -20 ° C до анализа. Содержание ЦП определяли иммунонефелометрическим анализом на автоматическом анализаторе BNA II (Behring) с использованием кроличьих поликлональных антител против ЦП.

Определение активности меди / Цинк-СОД и марганец-СОД. Активность медь / цинк-СОД и марганец-СОД измеряли в LC и SN в соответствии с методами, описанными в ссылке. 25.

Определение железа и меди. Концентрации металлов были измерены, как указано в исх. 17.

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса комплекса НМ-железо. Спектры тканей SN и LC были записаны и проанализированы, как описано в ссылке. 22.

Иммуногистохимия H- и L-ферритинов. Иммуноокрашивание проводили на фиксированных формалином, залитых парафином срезах ткани с использованием моноклональных антител, специфичных к H- (rH02) и L-ферритину (LF03), выработанных у мышей.Биотинилированный козий антимышиный IgM (Jackson ImmunoResearch) использовали в качестве вторичного антитела с комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена (Vector Laboratories). Слайды проявили с диаминобензидиновым субстратом с добавлением никеля (Vector Laboratories), закрепили и сфотографировали.

Гистохимия железа. Окрашивание железом (III) проводили на 6-мкм срезах тканей, залитых парафином. После депарафинизации и регидратации через градуированный этанол срезы инкубировали при температуре 37 ° C в 7% ферроцианиде калия в водной соляной кислоте (3%) по модифицированному методу Перлса (26).Контрастное окрашивание выполняли с помощью Carmalum Mayer.

Результаты

Возрастной тренд концентрации железа в SN и LC. На рис. 1 показаны концентрации железа в SN и LC субъектов во всем возрастном диапазоне, рассматриваемом в этом исследовании. Концентрация железа в ЖК оставалась постоянной при старении и была намного ниже, чем измеренная в SN. Концентрация железа в СН плавно увеличивалась в течение жизни согласно линейной модели.Особое внимание было уделено методическим вопросам. Образцы были проанализированы и собраны инструментами, изготовленными только из тефлона или титана. Этот вопрос был важным, учитывая низкое содержание железа в ЖК. Для подтверждения значений, измеренных нейтронно-активационным анализом, железо было также измерено электротермической атомно-абсорбционной спектроскопией, и были обнаружены очень похожие значения (данные не показаны).

Концентрация железа (нг / мг влажной ткани) в LC (○) и SN (•) нормальных людей в процессе старения. Значения даны как среднее ± стандартная ошибка среднего ( n = 2). В SN данные лучше всего соответствовали модели линейной регрессии ( Y = 0,668X + 134,494, R ² = 0,158, P = 0,040).

Возрастной тренд H-ферритина и L-ферритина в SN и LC. Возрастной тренд H-ферритина в SN и LC показан на рис. 2 A . Значения H-ферритина в ЖК были постоянными в течение жизни и ниже, чем в СН. Уровни H-ферритина в SN увеличиваются в течение жизни в соответствии с линейной функцией. Аналогичная ситуация наблюдалась для L-ферритина в SN и LC, как показано на рис. 2 B . То есть L-ферритин был постоянным в течение жизни в LC, тогда как он линейно увеличивался с возрастом в SN. Однако концентрация L-ферритина была ниже, чем концентрация H-ферритина в соответствующей области мозга.

Возрастной тренд ферритинов в SN и LC. ( A ) Концентрация H-ферритина (нг / мг влажной ткани) в LC (○) и в SN (•) нормальных людей в процессе старения. Значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего ( n = 6). В SN данные лучше всего соответствовали модели линейной регрессии ( Y = 1.151X + 159.455, R ² = 0,439, P = 0,002). ( B ) Концентрация L-ферритина (нг / мг влажной ткани) в LC (○) и в SN (•) нормальных людей в процессе старения. Значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего ( n = 6). В SN данные лучше всего соответствовали модели линейной регрессии ( Y = 0,886X + 33,830, R ² = 0,562, P = 0,0003).

Возрастной тренд NM в LC и SN. На рис. 3 показаны значения концентраций ЯМ в LC и SN. В обеих областях линейное увеличение концентрации ЯМ происходило в течение жизни. Однако наклон кривой накопления в SN был круче, чем в LC, как показывают соответствующие значения, приведенные в легенде. Также был больший разброс значений концентрации в LC по сравнению с SN и относительным R Сообщается ² значений.

Концентрация NM (нг / мг влажной ткани) в LC ( A ) и в SN ( B ) нормальных людей в процессе старения. Значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего ( n = 2). Данные лучше всего соответствовали модели линейной регрессии ( Y = 8,345X + 1587,954, R ² = 0,127, P = 0,028 в ЖК; Y = 40,648X + 10,108, R ² = 0,872, P = 0.0001 в SN).

Взаимодействие НМ с железом исследовано методом ЭПР-спектроскопии. На рис. 4 показаны типичные спектры ЭПР ЖК и СН. Сигнал на g4 соответствует высокоспиновому комплексу железа (Fe ³⁺ ) в октаэдрической конфигурации. Сигнал g2 исходит от стабильного свободного радикала, обычно присутствующего в обоих НМ. Отношение интенсивности сигнала железо / свободный радикал в SN составило 5,16, тогда как в ЖК – 0,31. Основываясь на наших ранее опубликованных калибровках (27), это означает, что содержание железа в НМ ЖК составляло 7.9% от найденного в НМ СН. Такие же сигналы присутствовали в ЯМ, изолированных от LC и SN, но отношение интенсивности сигнала железо / свободный радикал было выше в изолированных NM, чем в исходных LC и SN (данные не показаны). Более высокий сигнал железо / свободные радикалы, обнаруженный в изолированных НМ, обусловлен захватом железа НМ во время изоляции от ЖК и ЧН, когда клеточные компартменты разрушены и свободное железо поглощается НМ. НМ LC и SN образуют очень стабильный комплекс с железом, и только обработка в течение 48 часов сильными хелаторами, такими как десферал или ЭДТА, может удалить 30% связанного железа.

Спектры ЭПР комплекса НМ-железо в СН и ЖК.

Концентрация железа и меди в НМ, выделенных из ЖК и СН. Концентрация железа в НМ из ЖХ составила 1,777 ± 92 нг / мг НМ (среднее ± SEM; n = 3), что намного ниже ( t тест; P = 0.003), чем найденный в NM из SN, соответствующий 10 891 ± 1416 нг / мг NM (среднее значение ± SEM; n = 3). Это значение выше, чем полученное с помощью ЭПР, потому что во время выделения НМ накапливается дополнительное количество железа, как объяснено выше. В отличие от железа, концентрация меди в НМ из ЖХ составляла 605 ± 79 нг / мг НМ (среднее ± SEM; n = 3), что выше ( t тест; P = 0,007), чем измеренная. в НМ от SN, что составило 185 ± 24 нг / мг НМ (среднее ± SEM; n = 3).

Возрастная тенденция меди в LC и SN. На рис. 5 представлены концентрации меди в ЖК. Тенденция значений соответствует линейной модели с тенденцией к снижению во время старения. В SN значения концентрации меди не показали какой-либо значимой тенденции. Средняя концентрация в LC (возрастной диапазон, 28-96 лет) составляла 31 ± 3 нг / мг влажной ткани (среднее значение ± SEM; n = 32) и была выше ( t тест; P = 0,001) чем в SN (возрастной диапазон 17-88 лет), который составлял 16 ± 2 нг / мг влажной ткани (среднее значение ± SEM; n = 24).

Концентрация меди (нг / мг влажной ткани) в LC здоровых людей в процессе старения. Значения являются средними ± стандартная ошибка среднего ( n = 2). Данные лучше всего соответствовали модели линейной регрессии ( Y = -0,331X + 51,935, R ² = 0,157, P = 0.025).

Возрастной тренд Cp в LC и SN. Средние концентрации ЦП в LC (возрастной диапазон 18-95 лет) составляли 854 ± 66 нг / мг влажной ткани (среднее ± SEM; n = 25), а в SN (возрастной диапазон 16-95 лет) ) составляла 1,198 ± 108 нг / мг влажной ткани (среднее ± SEM; n = 19). Концентрация ЦП в ЖХ имела колоколообразный тренд с самыми низкими значениями в диапазоне от 50 до 80 лет. Концентрация Cp в SN не показывала какой-либо специфической тенденции.

Возрастная тенденция меди / Цинк-SOD и марганец-SOD в LC и SN. Значения активности медь / цинк-СОД в ЖК и SN не менялись во время старения. Значение медь / цинк-СОД в LC (возрастной диапазон 33-88 лет) составляло 693 ± 95 миллиединиц / мг белка (среднее ± SEM; n = 14), а значение в SN (возрастной диапазон 30 -88 лет) составлял 1,188 ± 153 миллиединиц / мг белка (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 14). Значения медь / цинк-СОД в LC были значительно ниже, чем в SN (тест t ; P = 0.01).

Значения активности марганца-СОД в ЖК уменьшались при старении в соответствии с моделью линейной регрессии ( Y = -55.121X + 6979.571, R ² = 0,441, P = 0,009), тогда как в SN значимой тенденции не наблюдалось. Активность марганцевой СОД в LC (возрастной диапазон 33-88 лет) составляла 3468 ± 322 миллиединиц / мг белка (среднее ± SEM; n = 14), а активность в SN (возрастной диапазон 30-88 лет) ) составляла 4421 ± 482 миллиединиц / мг белка (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 14).

Распределение H- и L-ферритина в клетках LC и SN. На фиг. 6 показано иммуноокрашивание моноклональными антителами против H-ферритина и L-ферритина в LC и SN. В SN окрашивание H-ферритина обнаруживается в основном в клетках олигодендроцитов, и только очень слабое окрашивание проявляется в нескольких нейронах, содержащих NM. В очень немногих непигментированных нейронах ЧС наблюдалось легкое окрашивание H-ферритина. В SN L-ферритин снова в значительной степени обнаруживается в олигодендроцитах и ​​не обнаруживается в нейронах NM.H и L-ферритин одинаково локализованы в клетках LC с высоким окрашиванием обоих в олигодендроцитах, но без окрашивания в нейронах NM. Лишь несколько непигментированных нейронов LC имели легкое окрашивание L-ферритином.

Клеточное распределение ферритинов в SN и LC. Иммуногистохимия H-ферритина в SN ( A ) и в LC ( B ).Иммуногистохимия L-ферритина в SN ( C ) и в LC ( D ). Ткани взяты у нормальной 83-летней женщины. НМ дофаминергических нейронов SN и норадреналиновые нейроны LC представляют собой коричневые гранулы. Продукты реакции H- и L-ферритина фиолетовые. (Масштабная шкала, 100 мкм.) В SN только несколько нейронов, содержащих NM, имеют очень легкое фиолетовое окрашивание; тогда нейроны показывают низкое содержание H-ферритина. При большем увеличении наблюдается светло-фиолетовое окрашивание непигментированного нейрона ( A ).Многие олигодендроциты, окрашенные в фиолетовый цвет, встречаются в SN ( A ) и LC ( B ) с H-ферритин-положительными реакциями в ядрах и цитоплазме. Окрашивание L-ферритина не обнаруживается ни в одном нейроне NM как SN ( C ), так и LC ( D ). При большем увеличении в двух непигментированных нейронах LC в цитоплазме присутствуют только несколько пятен, окрашенных L-ферритином ( D ). Опять же, большое количество L-ферритин-положительных олигодендроцитов наблюдается в SN ( C ) и LC ( D ).

Распределение нехелатированного железа в клетках LC и SN. На рис. 7 показаны срезы SN и LC, соответственно, окрашенные на железо модифицированным методом Перлса. Большое количество инородных отложений железа присутствует в SN, тогда как очень мало отложений железа наблюдается в ЖК. Железо присутствует в большом количестве клеток SN, особенно в олигодендроцитах, тогда как очень немногие клетки LC окрашиваются железом. Отложения железа не наблюдаются в НМ, содержащих нейроны как SN, так и LC.Отложения железа обнаружены в нескольких непигментированных нейронах SN.

Гистохимия железа с модифицированным окрашиванием Перлза SN человека ( A ) и LC ( B ) у нормального 88-летнего мужчины. НМ дофаминергических нейронов SN и норадреналиновые нейроны LC представляют собой коричневые гранулы, а отложения железа окрашены в синий цвет.(Масштабная шкала, 100 мкм.) NM-содержащие нейроны как в SN ( A ), так и в LC ( B ) не имеют синего окрашивания железа. В SN ( A ) имеется много железо-положительных клеток, которые чаще всего представляют собой олигодендроциты с цитоплазматическими отложениями железа, а в LC ( B ) очень мало олигодендроцитов с легким окрашиванием железа. Отложения железа присутствуют также в цитоплазме непигментированных нейронов SN ( A ), как показано при большем увеличении. Отложения железа можно наблюдать во всей паренхиме SN ( A ), за исключением пигментированных нейронов, но они полностью отсутствуют в паренхиме LC ( B ).

Обсуждение

Содержание железа в LC намного ниже, чем в SN, и стабильно при старении. Здесь указано содержание железа, меди, NM, ферритинов, Cp, меди / цинка-SOD и марганца-SOD в ЖК. Наиболее поразительным открытием является очень низкая концентрация железа, измеренная в LC, которая намного ниже, чем в SN и других областях мозга, таких как ядра базальных ганглиев (14, 15, 17, 22).Уровни железа в ЖК были постоянными на протяжении всей жизни, тогда как содержание железа в СН увеличивается с возрастом (17). Гистохимически обнаруживаемые отложения железа отсутствуют в нейронах NM SN, что согласуется с предыдущими исследованиями (22, 28), и обусловлено способностью NM поглощать железо с образованием комплекса NM-железо. Плотность отложений железа, наблюдаемая с помощью гистохимии в ЖК, также намного ниже, чем в SN, что соответствует разнице в общей концентрации железа между ЖК и SN, измеренной электротермической атомно-абсорбционной спектроскопией и нейтронно-активационным анализом.Важно отметить, что такая низкая плотность отложений железа в ЖК обнаруживается даже у пожилых людей (> 80 лет). Эти отложения содержат подвижное железо по сравнению с высокостабильным железом, присутствующим в ферритинах и НМ. Таким образом, риск мобилизации железа и последующий нейротоксический эффект при ЦП кажется ниже, чем при СН, даже у пожилых людей.

NM Накопление в LC при старении начинается раньше, чем в SN. Уровни NM, обнаруженные в LC, были аналогичны уровням, обнаруженным в SN (18).Однако наклон кривой накопления в SN был намного круче, чем в LC. Другими словами, в LC происходит более раннее накопление NM по отношению к SN. Экстраполяция кривой LC предполагает, что NM уже присутствует при рождении, что согласуется с данными гистологических исследований (29). Поскольку синтез НМ зависит от уровней цитозольного катехоламина (30), более раннее, но более медленное накопление НМ в ЖК может быть связано с низкой и постоянной экспрессией VMAT2 в течение жизни. NM LC происходит из окисления норэпинефрина, тогда как NM в SN происходит из окисления дофамина; однако эти две НМ имеют несколько общих структурных аспектов, как показано представленными здесь спектрами ЭПР, описанными ранее (22), а также спектрами УФ-ВИД, ИК и ЯМР (данные не показаны).

Низкое содержание железа в нейронах LC хелатируется NM. NM является сильным хелатором тяжелых металлов из-за наличия в его структуре катехоловых групп (31). Отношение NM / железо в ЖК намного выше, чем в SN. NM обладает сильной хелатирующей способностью к железу, что обеспечивает еще один важный механизм защиты от мобилизации железа и, как следствие, токсичности в LC и SN. Действительно, ферритины плохо экспрессируются как в нейронах LC, так и в SN, где основной буферной системой против токсичности железа и других металлов является NM.

Большее количество железа, связанного с NM, в SN по сравнению с LC указывает на то, что в нейронах SN присутствует больше свободного железа. Более низкая подверженность нейронов LC свободному железу является ключом к их меньшей уязвимости к окислительному стрессу по сравнению с SN. В этой связи актуально то, что НМ ингибирует образование гидроксильных радикалов, катализируемое железом (32).

Как показали измерения ЭПР, только небольшая часть хелатирующей способности НМ заполнена железом, оставляя достаточную доступность для блокирования большего количества железа и других токсичных металлов.Фактически, НМ могут образовывать стабильные комплексы с кадмием, ртутью и свинцом, что снижает их токсичность (33, 34).

ЯМ в ЖК происходит раньше, чем в СН в ранней фазе жизни (29). Как следствие, нейроны LC менее подвержены токсичности железа, чем нейроны SN, поскольку такое же содержание NM в SN достигается к шестому десятилетию жизни. Очень низкое содержание железа, обнаруженное в НМ LC по сравнению с НМ SN, предполагает более низкую мобилизацию железа в нейронах LC, и, следовательно, следует ожидать более низкую интранейрональную железо-опосредованную токсичность.Помимо хелатирования металлов, на защитную способность НМ влияют и другие факторы, такие как способность накапливать органические токсины (19, 20, 34). Кроме того, во время синтеза НМ избыточные катехолы удаляются из цитозоля, обеспечивая еще один антиоксидантный механизм (30).

Глиальное железо в ЖК имеет низкий уровень и эффективно хелатируется ферритинами. Концентрации H- и L-ферритинов в SN увеличивались в течение жизни и были намного выше, чем измеренные в LC.Поскольку ферритины являются основными запасающими молекулами железа, их содержание следует относить к содержанию железа, чтобы сделать вывод о влиянии свободного железа на риск. Отношение концентрации H-ферритина / железа в ЖК составляло 2,85, тогда как такое отношение в СН составляло только 1,33. H-ферритин связывает железо (Fe ²⁺ ) и превращает его в железо (Fe ³⁺ ), которое хранится как в H-, так и в L-ферритине. Из-за более высокого отношения H-ферритин / железо, присутствующего в ЖК по отношению к SN, существует более эффективная стабилизация железа, которая может сделать ЖК более защищенным от цитотоксического действия железа.Низкое содержание железа в глии и низкая нагрузка железа в ферритинах, вероятно, снижает реактивный глиоз и, как следствие, риск повреждения нейронов при LC по сравнению с SN. Увеличение H-ферритина, наблюдаемое во время старения, по-видимому, является компенсаторной реакцией на блокирование увеличения свободного железа в SN. Напротив, при постоянном содержании железа в ЖК H-ферритин также остается постоянным на протяжении всей жизни.

Поскольку окрашивание антител к H и L-ферритину, наблюдаемое в нейронах, намного ниже, чем в глии, и из-за большого количества комплекса NM-Fe, обнаруживаемого методом ЭПР, NM является основной молекулой для хранения железа в нейронах LC.Подобная ситуация была описана ранее в нейронах ЧС (17). С другой стороны, токсичность глиального железа в ЖК может быть эффективно снижена за счет соотношения H-ферритин / железо, которое намного выше, чем в СН. В исследованиях на животных было продемонстрировано, что снижение содержания реактивного железа за счет генетического или фармакологического хелатирования приводит к защите от токсичности 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина, и прилагаются усилия для разработки специфических хелаторов для снятия перегрузки железом в головном мозге (35-38).

Как показывает иммуногистохимия, содержание ферритина в нейронах LC и SN намного ниже, чем в глии. В то время как железо в нейронах эффективно блокируется комплексом NM-Fe, в глии основной молекулой хранения железа является ферритин.

Железо может участвовать в нейродегенеративных процессах различными путями (реакция Фентона, агрегация белков и т. Д.), Происходящими в нейронах и вызывающими их повреждение (39). Кроме того, железо может активировать микроглию, которая высвобождает токсичные молекулы, такие как цитокины и оксид азота.Несколько исследований продемонстрировали ключевую роль железа в нейродегенерации (обзор см. В ссылке 40). Было показано, что точечная мутация в L-цепи ферритина ответственна за первичное нарушение хранения железа с повышенными отложениями железа и ферритина в бледном шаре и других областях мозга. Эта нейроферритинопатия характеризуется хореей, очаговой дистонией и акинетически-ригидным паркинсонизмом (41).

Содержание меди в ЖК уменьшается с возрастом ЖК и увеличивается SN. Среднее содержание меди в LC было выше, чем в SN в рассматриваемом возрастном диапазоне; однако тенденции были совершенно иными. Фактически, концентрация меди в ЖК снижается у пожилых людей, в то время как в СН она не меняется. Это исследование показывает, что уровни меди в SN ниже, чем сообщалось ранее (42), но мы использовали более конкретный метод и сертифицированные стандарты, тогда как в предыдущем исследовании использовалась пламенная атомно-абсорбционная спектроскопия, а подробности о стандартах не приводились.

В нейронах LC с НМ связано больше меди, чем в СН. Интересно, что медь более концентрирована в НМ, выделенном из ЖК, чем в НМ, выделенном из СН. Таким образом, свободной меди больше в нейронах LC, чем в нейронах SN; Таким образом, медь может играть более важную роль, чем железо, в токсическом процессе внутри нейронов LC. Действительно, свободные металлы быстро хелатируются НМ в нейронах. Более высокое содержание меди в НМ ЖК по сравнению с НМ в СН, вероятно, связано с наличием дофамин-бета-гидроксилазы, медьсодержащей монооксигеназы, ответственной за превращение дофамина в норадреналин (43).

Cp в LC увеличивается с возрастом для компенсации снижения содержания меди и поддержания гомеостаза железа. Для Cp, который является основной транспортной молекулой меди, наблюдается, что средняя концентрация одинакова для LC и SN, но тенденции кажутся разными. В ЖК концентрация ЦП увеличивается после 80 лет, тогда как уровни меди снижаются в том же возрастном диапазоне. Корреляции между медью и Cp в SN не наблюдается. Наблюдаемое повышение Cp в LC у пожилых людей, вероятно, является компенсаторной реакцией на обеспечение снабжения клеток медью в ситуациях пониженной доступности меди, даже если на Cp приходится только 1% меди, присутствующей в ткани мозга.Не было обнаружено корреляции между содержанием меди и содержанием меди / цинка-SOD в LC и SN, хотя этот фермент содержит 25% от общего содержания меди в головном мозге. Условия снижения меди и повышения ЦП, обнаруженные при ЦП у пожилых людей, напоминают условия, описанные в СН пациентов с БП (15, 42, 44). Таким образом, в конечном итоге медь может принимать более активное участие, чем железо, в нейродегенеративных процессах ЦП. Однако ЦП также играет важную роль в поддержании гомеостаза железа в головном мозге, а его ферроксидазная активность защищает от токсичности железа (45).Измененный метаболизм меди является установленным причинным фактором у таких больных, как болезни Вильсона и Менке, с нейродегенеративными последствиями и при первичной дистонии (46). В любом случае медные пути в головном мозге довольно сложны из-за присутствия нескольких медных белков, роль которых до сих пор неясна. Таким образом, трудно делать выводы о нейропротекторной или нейротоксической роли меди, пока ее загадка не будет полностью разгадана.

Снижение активности марганца-СОД при старении в ЖК. В SN не наблюдалось изменений в активности медь / цинк-SOD и марганца-SOD, тогда как при LC уменьшение марганца-SOD, вероятно, указывает на более низкую степень окислительного стресса, имеющего место в этой области, и условия для выживания нейронов. лучше, чем у SN. В ЧС пациентов с БП картина изменений медь / цинк-СОД и марганец-СОД не ясна (47, 48), и описано снижение мРНК медь / цинк-СОД (49).

Выводы

В этом исследовании железо, медь и их основные молекулярные формы, ферритины, Cp, NM, марганец-SOD и медь / цинк-SOD были измерены в LC и SN у здоровых людей в разном возрасте.В LC уровни железа были намного ниже, чем в SN, а отношения H-ферритин / железо были намного выше, чем у SN. Концентрация НМ была одинаковой в двух ядрах, но содержание железа в НМ ЖК было намного ниже, чем в СН. В обоих регионах H- и L-ферритины присутствовали в основном в глии и только в очень низких количествах в нейронах. В целом эти данные предполагают, что в нейронах NM буферизует свободные металлы и, вероятно, их токсичность как в LC, так и в SN. В последней области мозга более серьезные повреждения, возникающие при БП, вероятно, являются следствием повышенного содержания железа.Ферритины выполняют ту же функцию в глиальных клетках. Уровни меди и Cp были одинаковыми в LC и SN. Однако содержание меди в НМ LC было выше, чем в SN, что указывает на более высокую мобилизацию меди в нейронах LC. Марганец-СОД и медь / цинк-СОД имели сходные возрастные тенденции в LC и SN. Эти результаты могут объяснить по крайней мере одну из причин, лежащих в основе избирательной уязвимости SN к noxae, включая железо-опосредованное окислительное повреждение. В тех патологических состояниях, когда железо-опосредованный окислительный стресс играет важную роль, нейроны SN более уязвимы.Другие патогенные механизмы должны работать для избирательной дегенерации нейронов LC. Преимущественное истощение одной из двух структур при различных нейродегенеративных расстройствах может зависеть от этой патогенной специфичности, связанной с железом.

Благодарности

Благодарим госпожу Кьяру Беллей за помощь. Эта работа была поддержана Фондом Майкла Дж. Фокса для исследований Паркинсона, Фондом борьбы с болезнью Паркинсона, Фондом Карипло и Грантом Национального научного фонда CHE01-10655 (N.Т.).

Сноски

• ↵ † Кому должна быть адресована корреспонденция. Электронная почта: luigi.zecca {at} itb.cnr.it.

• Сокращения: LC, locus coeruleus; БП – болезнь Паркинсона; SN, черная субстанция; НМ, нейромеланин; ЦП, церулоплазмин; СОД, супероксиддисмутаза; H-ферритин, ферритин тяжелой цепи; L-ферритин, ферритин легкой цепи.

• Авторское право © 2004, Национальная академия наук

Зона обучения: что такое минерал?

В мире около четырех тысяч различных минералов. Все они представляют собой неорганические твердые вещества природного происхождения. Каждый минерал отличается особым химическим составом и кристаллической структурой. Чтобы правильно объяснить, что такое минерал, мы должны немного познакомить вас с химией.

Минералы состоят из химических элементов.Химический элемент – это вещество, состоящее только из одного вида атомов. Вы слышали о кислороде, водороде, железе, алюминии, золоте и меди? Все это химические элементы.

Но что такое атом?

Атом – наименьшая единица любого химического элемента. Это строительные блоки, из которых состоит каждый химический элемент, и они слишком малы, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом. Представьте, например, небольшой кусок меди. Даже мельчайший кусок меди состоит из миллиардов и миллиардов атомов меди.

Есть 103 типа атомов, и поскольку каждый химический элемент состоит только из одного вида атомов, существует 103 химических элемента.

Миллиарды и миллиарды атомов меди складываются вместе, образуя кусок меди

Каждый минерал имеет фиксированный химический состав. Некоторые минералы состоят только из одного химического элемента – они содержат только один тип атомов. Самородная медь состоит только из атомов меди. Большинство минералов представляют собой химические соединения – они содержат атомы более чем одного химического элемента

Так что же такое химическое соединение?

Скажем так.Подобно тому, как химические элементы состоят из атомов, химическое соединение состоит из молекул. Каждая молекула химического соединения состоит из двух или более разных атомов, соединенных вместе.

Галит – химическое соединение. Его также называют хлоридом натрия, но вы, вероятно, лучше знаете галит как каменную соль – да, такую, которую вы добавляете в рыбу с жареным картофелем. Каждая молекула галита содержит один атом элемента, называемого натрием, соединенный с одним атомом элемента, называемого хлором. Галит всегда содержит столько же атомов натрия, сколько и атомов хлора: эта «формула» не меняется – галит, как и все другие минералы, имеет определенный химический состав.

Атомы хлора и натрия соединятся вместе, образуя молекулы галита

Атомы в минерале организованы в организованную «атомную структуру». Они соединяются вместе, образуя молекулы, и молекулы складываются в регулярный узор, образуя кристалл. Форма кристалла зависит от того, как молекулы расположены внутри него.

Существует определенный способ, которым атомы натрия «соединяются» с атомами хлора, образуя молекулу галита, и эти молекулы могут складываться вместе, образуя кристалл галита.

Молекулы галита складываются вместе, образуя кристаллы галита – это соль, которую мы едим каждый день

Все свойства минерала – его кристаллическая форма, твердость, цвет, блеск – зависят от того, из каких химических элементов он состоит и как атомы этих элементов расположены внутри него.

Теперь вы действительно должны знать, что такое минерал, так почему бы не попробовать нашу викторину, чтобы проверить себя.

Все еще не уверены? Если вы прочитаете эти страницы и пройдете тест, вы должны иметь довольно хорошее представление о том, что такое минерал.

Определение минерала
Почему минерал похож на лепешку?
Хитрые биты … атомы, молекулы и прочее
Что такое минерал? Загадка!

Предотвращение распространения рака с помощью молекул меди

Химики из Университета Билефельда разработали молекулу, содержащую медь, которая специфически связывается с ДНК и предотвращает распространение рака.Первые результаты показывают, что он убивает раковые клетки быстрее, чем цисплатин – широко используемый противораковый препарат, который часто назначают при химиотерапии. При разработке противоопухолевого агента профессор доктор Торстен Глейзер и его команда сотрудничали с биохимиками и физиками. Дизайн нового агента является фундаментальным исследованием. «Как и будет ли комплекс меди на самом деле вводиться онкологическим больным – это вопрос, который предстоит определить в ближайшие годы», – говорит химик.

С конца 1970-х врачи использовали цисплатин для лечения рака. При раке легких и раке яичек препарат способствует заживлению; однако он не работает при всех типах рака. Цисплатин также является одним из противораковых препаратов, которые чаще всего вызывают тошноту, рвоту и диарею. «Поэтому мы хотели разработать альтернативный агент, который работал бы иначе, имел бы меньше побочных эффектов и лечил бы также другие типы рака», – говорит Торстен Глейзер, профессор неорганической химии в Университете Билефельда.«Кроме того, мы хотели средство для лечения рака, который стал невосприимчивым к цисплатину в результате его использования в более ранних методах лечения». Глейзер и его команда используют химические методы для создания новых молекул, не встречающихся в природе, и для придания им определенных свойств.

Цисплатин атакует ДНК раковых клеток. ДНК состоит из азотистых оснований, фосфатов и сахара. В то время как цисплатин связывается с азотистыми основаниями, новая молекула, разработанная исследователями, атакует фосфат в ДНК.«Мы сделали это, интегрировав в нашу молекулу два металлических иона меди, которые преимущественно связываются с фосфатами». Как только ионы связываются с фосфатом, изменяется ДНК раковой клетки. Это нарушает клеточные процессы, препятствует размножению клетки и приводит к разрушению патологической клетки.

«Так же, как ключ работает только в одном конкретном замке, наша молекула подходит только для фосфатов и блокирует их», – говорит Глейзер. Немного похоже на конец подковы, из новой молекулы выступают два металлических иона меди.Зазор между двумя концами подковы точно соответствует промежутку между фосфатами в ДНК, так что они могут стыковаться друг с другом и образовывать идеальное совпадение. «Поскольку два фосфата связываются одновременно, сила связывания выше. И это увеличивает эффективность ».

Ученые из Университета Билефельда разработали процедуру производства новой молекулы. Они доказали, что их медный агент может связываться с ДНК и изменять ее. И они изучили, предотвращает ли и насколько хорошо их агент распространение ДНК и, следовательно, клеток.Репликация генома в клетках происходит аналогично полимеразной цепной реакции (ПЦР). Исследователи подтвердили, что комплекс меди останавливает эту цепную реакцию.

Наконец, ученые применили агент к раковым клеткам. Они вводили вещество в культуру клеток с раковыми клетками. В результате «медный комплекс более эффективен, чем цисплатин», – говорит Глейзер. «Наибольшее количество раковых клеток погибло при концентрации 10 микромоль. С цисплатином вам нужно 20 мкмоль.’

При проведении исследования нового агента профессор Глейзер и его команда сотрудничали с исследовательскими группами профессора доктора Дарио Ансельметти (биофизика и нанонаука) и профессора доктора Габриэле Фишер фон Моллар (биохимия) – оба они также из Университета Билефельда. Коллеги Дарио Ансельметти использовали атомно-силовую микроскопию, чтобы получить изображения, подтверждающие, что комплекс меди связывается с ДНК. Команда Габриэле Фишер фон Моллард проверила, как культура раковых клеток отреагировала на агент.

Ссылка : Предотвращение распространения рака с помощью молекул меди (2 марта 2015 г.) получено 14 сентября 2021 г. из https: // medicalxpress.ru / news / 2015-03-Cancer-Copper-Молекулы.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

Триплин, небольшая молекула, обнаруживает транспорт ионов меди в передаче сигналов этилена от ATX1 к RAN1

Abstract

Ионы меди играют важную роль в биогенезе этиленовых рецепторов и их правильном функционировании.Транспортер меди RESPONSIVE-TO-ANTAGONIST1 (RAN1) необходим для транспорта ионов меди в Arabidopsis thaliana . Однако до сих пор неясно, как ионы меди доставляются в RAN1 и как ионы меди влияют на рецепторы этилена. Не существует конкретного хелатора меди, который можно было бы использовать для изучения этих вопросов. Здесь с помощью химической генетики мы идентифицировали новую небольшую молекулу, триплин, которая может вызывать фенотип тройного ответа на проростках Arabidopsis , выращенных в темноте, через сигнальный путь этилена. ran1-1 и ran1-2 гиперчувствительны к триплину. Добавление ионов меди в питательную среду может частично восстановить фенотип растений, вызванный триплином. Масс-спектрометрический анализ показал, что триплин может связывать ион меди. По сравнению с известными хелатирующими агентами триплин более специфично действует на ионы меди и подавляет токсическое воздействие избытка ионов меди на рост корней растений. Мы также показали, что мутанты ANTIOXIDANT PROTEIN1 (ATX1) гиперчувствительны к типлину, но с меньшей чувствительностью по сравнению с мутантами ran1-1 и ran1-2 .Наше исследование впервые предоставило генетические доказательства того, что ионы меди, необходимые для биогенеза рецептора этилена и передачи сигналов, транспортируются от ATX1 к RAN1. Учитывая, что триплин может хелатировать ионы меди в Arabidopsis , а ионы меди необходимы для растений и животных, мы полагаем, что триплин может быть полезен не только для изучения транспорта ионов меди в растениях, но также может быть полезен для изучения метаболизма меди в животное и человек.

Сведения об авторе

Ионы меди являются кофакторами функций белков, и их нарушение тесно связано со многими заболеваниями человека, которые побуждают к разработке новых препаратов, связанных с хелаторами меди.В растениях ионы меди необходимы для рецепторов этилена, но многие детали неясны. Для изучения этих вопросов исследователям нужны новые специфические хелаторы меди. Здесь, используя химическую генетику растений, мы идентифицировали новый химический триплин, который может активировать этиленовый сигнальный путь путем хелатирования ионов меди, необходимых для рецепторов этилена. Мутанты устойчивости к этилену etr1-1 и ein2 были устойчивы к триплину, а мутанты переносчиков меди ran1-1 и ran1-2 были гиперчувствительны к триплину.Используя триплин в качестве инструмента молекулярной генетики, мы показали, что шаперон меди ATX1 действует выше RAN1, который переносит ионы меди к рецепторам этилена. Мы предлагаем образец того, что метаболизм можно изучить, объединив химическую генетику и известный сигнальный путь. Более того, триплин может эффективно хелатировать ионы меди, особенно в Arabidopsis , и может быть полезным инструментом для изучения транспорта ионов меди в растениях и ценным для разработки лекарственного средства, связанного с хелатором меди.

Образец цитирования: Li W, Lacey RF, Ye Y, Lu J, Yeh K-C, Xiao Y, et al.(2017) Триплин, небольшая молекула, обнаруживает транспорт ионов меди в передаче сигналов этилена от ATX1 к RAN1. PLoS Genet 13 (4): e1006703. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703

Редактор: Грегори П. Копенгейвер, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, США

Поступила: 25 октября 2016 г .; Одобрена: 20 марта 2017 г .; Опубликован: 7 апреля 2017 г.

Авторские права: © 2017 Li et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национального научного фонда США (IOS-1254423, MCB-1517032) для BMB; гранты Национального фонда естественных наук Китая (31630014) для LL; и гранты от Национального фонда естественных наук Китая (31171293 и 31371361) и программы ста талантов Китайской академии наук для YZ.Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Фитогормон этилен (C ₂ H ₄ ) играет важную роль в росте и развитии растений. При воздействии газообразного этилена в течение 3 дней выращенные в темноте проростки Arabidopsis демонстрируют типичный фенотип тройного ответа, включая короткий гипокотиль и корень, гипокотиль большего диаметра и увеличенный апикальный крючок [1,2].ETHYLENE RESPONSE1 (ETR1), ETHYLENE RESPONSE2 (ETR2), ETHYLENE RESPONSE SENSOR1 (ERS1), ETHYLENE RESPONSE SENSOR2 (ERS2) и ETHYLENE INSENSITIVE4 (ETHYLENE INSENSITIVE4 (ETHYLENE INSENSITIVE4) и EIN4), которые регулируют отрицательные реакции 9018 на этиленовые рецепторы 9018, которые являются отрицательными ответами 9018 на этиленовые рецепторы 9018. . Сигнал рецепторов передается нижестоящей Raf-подобной протеинкиназе CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1 (CTR1) [3,4]. CTR1 взаимодействует и фосфорилирует эндоплазматический ретикулум (ER), локализованный на мембране гомолог Nramp ETHYLENE IN SENSITIVE 2 (EIN2).Это предотвращает активацию EIN2 компонентов передачи сигналов этилена, включая ETHYLENE INSENSITIVE3 (EIN3) и EIN3-LIKE1 (EIL1). Когда этилен связывается с рецепторами, фосфорилирование EIN2 с помощью CTR1 снижается, что приводит к накоплению EIN2 и протеолитическому расщеплению цитозольного C-концевого домена EIN2, который входит в ядро, чтобы инициировать передачу сигналов этилена [5-10].

Ионы меди являются кофакторами, которые необходимы для связывания этилена с ETR1. Нечувствительный к этилену мутант etr1-1 устраняет как связывание этилена, так и взаимодействие иона меди с рецептором [11].В Arabidopsis ионы меди, необходимые для рецепторов этилена, транспортируются RAN1, также называемой АТФАЗА 7 ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (HMA7), которая представляет собой АТФазу P-типа, транспортирующую Cu. Два слабых мутантных аллеля, ran1-1 и ran1-2 , были идентифицированы в мутантном скрининге, где они ответили на антагонист рецептора этилена трансциклооктен (TCO) фенотипом тройного ответа, который можно частично подавить добавлением меди. ион в среду роста растений. Кроме того, ran1-1 и ran1-2 являются гиперчувствительными и демонстрируют аналогичный фенотип при лечении низкой концентрацией хелатора ионов меди неокупроина.Было показано, что RAN1 важен для биогенеза этиленовых рецепторов Arabidopsis [12–14].

Сходный белок, Ccc2a, был идентифицирован в Saccharomyces cerevisiae , где он функционирует, чтобы транспортировать ионы меди от шаперона меди, Atx1, к секреторному пути. Atx1 представляет собой небольшой фактор гомеостаза металла, который защищает клетки от реактивного кислородного отравления, вызванного избыточным или ненормальным распределением ионов меди [15–18]. Гомолог Atx1 обнаружен у человека.Этот металло-шаперон, HUMAN ATX1-LIKE HOMOLOG1 (HAh2), также переносит ионы меди и взаимодействует с белками Менкеса и болезни Вильсона [19–21].

В Arabidopsis есть два гомолога дрожжей Atx1, COPPER CHAPERONE (CCH) и ATX1 [22–24]. Мутант ATX1 со вставкой T-ДНК специфически сверхчувствителен к избытку иона меди, а также к дефициту меди, тогда как сверхэкспрессия ATX1 повышает устойчивость растений к избытку ионов меди и дефициту меди [25].Предыдущие двухгибридные тесты дрожжей показали, что ATX1 и CCH △ (без C-конца) взаимодействуют с RAN1 и HMA5 [24,26]. Было предсказано, что ионы меди, транспортируемые RAN1, которые необходимы для рецепторов этилена, могут происходить из ATX1 и CCH, но нет генетических доказательств, подтверждающих эту гипотезу [25,27].

На сегодняшний день установлено, что только хелатор неокупроин вызывает у растений фенотип тройного ответа, но неизвестно, может ли фенотип подавляться добавлением ионов меди [14].Неокупроин следует применять с осторожностью, поскольку он может усиливать цитотоксическое действие эндогенной меди на клетки [28]. Таким образом, нет сообщений о конкретном хелаторе ионов меди, который вызывает фенотип тройного ответа, в частности, за счет восстановления ионов меди. Мы полагаем, что хелатор ионов меди с таким свойством был бы полезен для исследования механизмов транспорта ионов меди к рецепторам этилена. Более того, подходы химической генетики эффективны в борьбе с избыточностью функций компонентов, участвующих в передаче сигналов фитогормонов, и помогли ученым идентифицировать рецепторы ABA и новые компоненты передачи сигналов, связанные с ауксином и другими фитогормонами [29–32].

Здесь мы использовали подход химической генетики для открытия нового синтетического триплина с небольшой молекулой. Мы обнаружили, что триплин может вызывать фенотип тройного ответа у проростков Arabidopsis , выращенных в темноте, в качестве хелатора меди. Путем тестирования чувствительности мутантов транспорта ионов меди к триплину мы показали, что ATX1 действует выше RAN1. Наши генетические и биохимические результаты подтверждают модель, в которой ATX1 транспортирует ионы меди к RAN1 для биогенеза рецептора этилена и передачи сигналов.Триплин не действует напрямую на связывание этилена с рецептором. Скорее, он нарушает транспорт ионов меди, участвующих во взаимодействии RAN1 и ATX1. Кроме того, триплин подавляет токсическое действие избыточного иона меди на рост корней растений. Таким образом, триплин может предоставить полезный инструмент химической генетики для изучения транспорта ионов меди в растениях и может стать ведущей структурой для разработки лекарств для лечения заболеваний, связанных с медными заболеваниями человека, в будущем.

Результаты

Идентификация и характеристика триплина

Чтобы идентифицировать новые небольшие молекулы, которые влияют на передачу сигналов этилена, мы использовали тот же метод скрининга химической генетики растений, описанный ранее [32–34]. Arabidopsis Columbia-0 дикого типа (Col-0) выращивали и проверяли против синтетической библиотеки малых молекул с 12000 соединений в темноте в течение 3 дней. Были отобраны те соединения, которые вызывали тройную реакцию у проростков, и повторно протестированы их химические генетические эффекты. В результате этого химического скрининга растений мы получили 14 соединений, которые вызывают тройную реакцию у выращенных в темноте проростков Arabidopsis . Среди этих совпадений были дополнительно проанализированы 5 самых сильных совпадений, представляющих различные структуры.Используя ингибитор восприятия этилена AgNO ₃ и нечувствительный к этилену мутант ein2-5 , мы обнаружили, что только соединение, которое мы назвали триплин (1- (1-морфолино-1- (тиофен-2-ил) пропан- 2-ил) -3- (2- (трифторметокси) фенил) тиомочевина) работает через этиленовый сигнальный путь (рис. 1 и S1). Мы также исследовали химическую генетическую активность 38 аналогов триплина, собранных из библиотеки. Наши результаты показали, что 5 аналогов могут вызывать фенотип тройного ответа при 100 мкМ, а 11 аналогов вызывают фенотип при более высокой концентрации 200 мкМ.Структурный анализ этих активных аналогов показывает, что морфолино- и тиомочевинные части молекул могут быть важны для усиления их химической генетической активности (таблица S1).

Рис. 1. Триплин действует через этиленовый сигнальный путь, вызывая фенотип тройного ответа у проростков Arabidopsis .

(A) Фенотипы 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 100 мкМ триплина, 50 мкМ ACC или 1% (об. / Об.) ДМСО в качестве контроля. Масштабная шкала соответствует 1 мм.(B) Химическая структура триплина. (C) Длина гипокотиля 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, etr1-1 , etr1-2 , ein2-5 и ein3 eil1 проростков, обработанных 100 мкМ триплина, 50 мкМ АСС или 1% (об. / об.) ДМСО в качестве контроля. Каждый эксперимент повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 сеянцев. Планки погрешностей представляют SEM. *** P <0,0001 (двусторонний t-критерий Стьюдента) указывает на значительную разницу в длине гипокотиля мутантов по сравнению с Col-0, обработанным 100 мкМ триплином.(D) qRT-PCR анализ экспрессии гена этиленового ответа ERF1 , обработанного 1% (об. / Об.) ДМСО, 100 мкМ триплина или 50 мкМ АСС. Каждый эксперимент повторяли три раза, и столбцы ошибок представляют собой SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.g001

Триплин действует через путь передачи сигнала этилена

Для изучения механизма действия триплина были использованы две стратегии. Во-первых, мы проверили мутагенизированные этилметансульфонатом (EMS) популяции Col-0 на предмет мутантов, устойчивых к триплину.Мы приобрели девять устойчивых к триплину мутантов, которые также показали устойчивость к применению предшественника биосинтеза этилена, 1-аминоцилопропан-1-карбоновой кислоты (АСС). Среди этих устойчивых мутантов два являются доминантными мутантами, которые имеют ту же мутацию, что и etr1-1 , что выявлено с помощью секвенирования ДНК [1]. Остальные семь мутантов являются рецессивными и были генетически определены как принадлежащие к локусу EIN2 путем исследования F1 , полученных от скрещиваний с ein2 (S2 фиг.).Мы также проанализировали влияние обработки триплином на известные мутанты передачи сигналов этилена. Устойчивый к этилену мутант etr1-1 , etr1-2 , ein2-5 и ein3 eil1 показал устойчивость к триплину (Фиг.1C и S3 Фиг). Кроме того, добавление 500 мкМ AgNO ₃ блокировало действие триплина на проростки (фиг. S6C). В соответствии с триплином, влияющим на передачу сигналов этилена, чувствительный к этилену ген, ERF1 , подвергался повышенной регуляции обработкой триплином (рис. 1D).Эти результаты показали, что триплин действует на передачу сигналов этилена. Возможно, что триплин также увеличивает биосинтез этилена, вызывая тройной ответ. Чтобы определить, происходит ли это, мы сначала исследовали, как изменения в биосинтезе этилена влияют на реакцию на триплин. Мы обнаружили, что триплин не увеличивает уровни экспрессии гена ACS s. Ни ингибитор АСС-синтазы (ACS), аминоэтоксивинилглицин (AVG), ни мутант биосинтеза этилена cin5 не влияют на триплиновые ответы.Кроме того, обработка триплином не усиливала биосинтез этилена и фактически вызывает снижение выработки этилена (S4, рис.). Вместе эти результаты показывают, что лечение триплином вызывает тройные ответы, воздействуя на передачу сигналов этилена, но не на биосинтез этилена.

Триплин генетически действует выше рецепторов этилена в этиленовой сигнальной сети

Чтобы отобразить, где триплин действует на сигнальную сеть этилена, мы проанализировали, как лечение триплином влияет на другие нечувствительные к этилену мутанты рецепторов этилена, включая ers1-1 , ers2-1 , etr2-1 и ein4 .Наши результаты показали, что все они были устойчивы к триплину (рис. S3B), что указывает на то, что триплин, вероятно, действует на рецепторы этилена в этиленовой сигнальной сети или перед ними. Предыдущие исследования показали, что переносчик ионов меди RAN1 участвует в биогенезе рецепторов этилена, а некоторые хелаторы ионов, такие как неокупроин, могут запускать тройную реакцию растений [14]. Как мы и ожидали, мутанты ran1-1, и ran1-2 были гиперчувствительны к лечению триплином, что сравнимо с опубликованными результатами для неокупроина [14] (S10B и S10C, фиг.).Низкие дозы триплина (например, менее 10 мкМ) не оказывали видимого воздействия на дикий тип, но вызывали тройной ответ у ran1-1 и ran1-2 (рис. 2A). Кроме того, введение RAN1 в мутанты спасало ответ дикого типа на триплин (рис. 2В). Однако двойные мутанты ran1-2 etr1-1 и ran1-2 ein2-5 были устойчивы к лечению триплином, как и одиночные мутанты etr1-1 и ein2-5 (рис. 2C). В совокупности наши результаты химической генетики показали, что триплин, вероятно, действует выше рецепторов этилена и может участвовать в изменении транспорта ионов меди к рецепторам.Наше простое предположение состоит в том, что триплин является хелатором ионов меди, который вызывает фенотип тройного ответа, хелатируя ионы меди, необходимые для биогенеза рецептора этилена.

Рис. 2. ran1-1 и ran1-2 обладают повышенной чувствительностью к триплину, а медь может частично обратить действие триплина.

(A) Фенотипы 3-дневных проростков, выращенных в темноте, Col-0, ran1-1 и ran1-2 , обработанных 10 мкМ триплином. (B) Дозовые ответы триплина трансгенных линий Col-0, ran1-1 , ran1-2 и двух 35S : RAN1-GFP (ran1-2) .Данные представляют собой среднюю длину гипокотиля при каждом условии. Каждый эксперимент повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 сеянцев. Планки погрешностей представляют SEM. (C) Фенотипы 3-дневных, выращенных в темноте проростков ran1-2 , ran1-2 etr1-1 и ran1-2 ein2-5 , обработанных 100 мкМ триплином. (D) Фенотипы 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 100 мкМ триплина в присутствии 20 мкМ ZnSO ₄ , 20 мкМ CuSO ₄ или H ₂ O в качестве контроль.(E) Длина гипокотиля проростков, как описано в (D). Каждый эксперимент повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 сеянцев. Планки погрешностей представляют SEM. ** p <0,01 указывает на разницу в длине гипокотиля между проростками, обработанными CuSO ₄ , по сравнению с H ₂ O и ZnSO ₄ в присутствии 100 мкМ триплина. Масштабные линейки соответствуют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.g002

Триплин хелатирует ионы меди

Чтобы определить, действует ли триплин как хелатор ионов меди и его специфичность, мы исследовали влияние ионов меди и других ионов, таких как Ag, Zn, Ca, Mg, Mn, Co, Ni, Na, K, Li и Mo на триплин. ответы у растений.Наши результаты показали, что добавление избытка Cu ²⁺ (CuSO ₄ ) частично обращает действие триплина на растения (рис. 2D и 2E). Из других протестированных ионов только Ag ⁺ (AgNO ₃ ) имел аналогичный эффект (S5 фиг. И S6C фиг.). Мы также исследовали известный хелатор ионов меди неокупроин и обнаружили, что его эффекты были отменены добавлением Zn ²⁺ (ZnSO ₄ ) в условиях нашего анализа (S10A, фиг.). Чтобы еще раз убедиться, что триплин действует путем хелатирования ионов меди, мы проверили, может ли лечение триплином облегчить токсическое воздействие высоких уровней ионов меди на рост растений.Наши результаты показали, что рост корней проростков Arabidopsis , обработанных 50 мкМ CuSO ₄ , сильно подавлялся; добавление 100 мкМ триплина в то же время частично обратило вспять это ингибирование роста корней (рис. 3A и 3B). Более высокая концентрация CuSO ₄ вызывает более сильное ингибирование роста, которое также можно частично обратить, добавив триплин (S6A и S6B, фиг.). Затем мы проверили, оказывает ли неокупроин эффект, аналогичный эффекту триплина, на растения, выращенные с высоким уровнем ионов меди.К нашему удивлению, неокупроин усиливал токсическое действие ионов меди на рост растений. Другое дело, что ZnSO ₄ смог восстановить фенотип, вызванный неокупроином. Это указывало на то, что специфичность неокупроина сомнительна (S10A и S10C фиг.).

Рис. 3. Триплин может хелатировать ионы меди in vitro .

(A) Фенотип 3-дневных выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 50 мкМ CuSO ₄ в присутствии 1% (об. / Об.) ДМСО или 100 мкМ триплина.Масштабная шкала соответствует 1 мм. (B) Длина корней саженцев, как описано в (A). Каждый эксперимент повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 сеянцев. Планки погрешностей представляют SEM. (C) Относительное содержание меди в 3-дневных, выращенных в темноте проростках Col-0 на среде для выращивания 0,5xMS с или без 100 мкМ триплина и / или 20 мкМ CuSO ₄ . D.W представляет собой сухой вес проростков. Каждый эксперимент повторяли трижды (планки погрешностей соответствуют SEM). (D) MALDI-TOF-MS анализ смеси равного объема 100 мкМ CuSO ₄ и 100 мкМ триплина.МР триплина составляет 446,0 г / моль. МР триплин + Cu составляет 510,0 г / моль. * P <0,05 и *** P <0,0001 (двусторонний t-критерий Стьюдента) указывают на значительную разницу между группами, получавшими разные методы лечения.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.g003

Чтобы лучше понять влияние триплина на растения, мы измерили относительное содержание ионов меди в проростках, выращенных с ионами меди и триплином. Когда проростки выращивали на нормальной ростовой среде 0,5xMS, добавление в среду 100 мкМ триплина немного снижало содержание ионов меди в проростках со 110 мкг / г до 80 мкг / г.При выращивании проростков на ростовой среде, содержащей 20 мкМ CuSO ₄ , относительное содержание ионов меди в проростках увеличивалось со 110 мкг / г до 1100 мкг / г. Добавление 100 мкМ триплина снизило содержание ионов с 1100 мкг / г до 560 мкг / г (рис. 3C). Мы пробовали смешивать триплин с ионами различных металлов, такими как Ag, Cu, Zn и Ca. Неожиданно мы обнаружили, что триплин образовывал желтовато-коричневую мутность с CuSO ₄ и черный осадок с AgNO ₃ (S7 Рис). Мы проанализировали продукты, образованные при смешивании 100 мкМ CuSO ₄ с 100 мкМ триплина, методом матричной лазерной десорбции / времяпролетной ионизации (MALDI-TOF-MS).При этом мы наблюдали пик m / z 509,9, который равен сумме молекулярных масс триплина (446,0 г / моль) и меди (рис. 3D). Ионы серебра также могут конъюгироваться с триплином, но требуется более высокая концентрация (например, 10 мМ) AgNO ₃ . Конъюгаты триплина с ионами других металлов, включая ZnSO ₄ и FeSO ₄ , не были обнаружены с помощью нашего масс-спектрографического анализа (S8 Рис.). В совокупности наши результаты показывают, что триплин является хелатором меди, который также в меньшей степени может хелатировать серебро.Это, возможно, объясняет, почему и Cu ²⁺ , и Ag ⁺ могут блокировать или частично блокировать эффекты триплина на рост растений.

Триплин вызывает фенотип тройного ответа, влияя на транспорт ионов меди в передаче сигналов этилена

Чтобы изучить, как триплин действует как хелатор ионов меди, нарушая передачу сигналов этилена и вызывая фенотип тройного ответа, мы сначала использовали питательную среду с дефицитом двух ионов меди для выращивания растений. Один из них включал все необходимые для роста растений элементы, кроме ионов меди, которые не добавлялись.Другой состоял из среды роста 0,5xMS с добавлением 500 мкМ хелатора ионов меди, батокупроиндисульфоновой кислоты (BCS). Эффекты 20 мкМ или 50 мкМ триплина на рост растений в темноте сравнивали на этой среде с контрольной средой. Проростки, выращенные на обеих питательных средах с дефицитом меди, показали более тяжелые тройные ответы в ответ на 20 мкМ триплина, чем проростки, выращенные на контрольной среде (рис. 4A и 4B). В тех же условиях роста с разной концентрацией триплина ein2-5 продемонстрировал очевидную устойчивость к триплину (S9, фиг.).Это указывает на то, что преувеличенный тройной отклик в отсутствие добавленной меди также зависит от передачи сигналов этилена.

Рис. 4. Триплин может влиять на транспорт ионов меди in vivo .

(A) Фенотип 3-дневных проростков Col-0, выращенных в темноте, на другой питательной среде с (+) или без (-) 20 мкМ триплина. -Cu представляет собой питательную среду, состоящую из всех основных элементов, необходимых для роста растений, за исключением иона меди. BCS представляет собой питательную среду, состоящую из 0.Соль 5xMS с 500 мкМ хелатора ионов меди BCS. Масштабная шкала соответствует 1 мм. (B) Длина гипокотиля 3-дневных проростков, как описано в (A). Разница в длине гипокотилей представляет собой сеянцы, выращенные на среде -Cu или BCS, по сравнению с сеянцами, выращенными на среде 0,5xMS. (C) Длина гипокотиля 3-дневных проростков линий Col-0 и 35S : RAN1-GFP , выращенных в темноте с различной дозой триплина. (D) Влияние триплина на связывание этилена с ETR1, экспрессируемым в дрожжах.Измеряли насыщаемое связывание этилена с интактными дрожжевыми клетками, экспрессирующими этилен-связывающий домен ETR1, и мембранами, выделенными из этих дрожжевых клеток. Связывание этилена указывается в количестве импульсов в минуту (CPM). Каждый эксперимент повторяли три раза, и столбцы ошибок представляют собой SEM. В (B) и (C) эксперименты повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 проростков. Планки погрешностей представляют SEM. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,0001 (двусторонний t-критерий Стьюдента) указывают на значительную разницу между группами, получавшими разные методы лечения.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.g004

Эти результаты согласуются с нашими более ранними результатами, показывающими, что триплин может хелатировать ионы меди. Однако мы также заметили, что простого снижения уровня меди в питательной среде недостаточно, чтобы вызвать тройную реакцию. Это заставило нас предположить, что триплин может дополнительно воздействовать на растения, вызывая тройной ответ. Одна из возможностей, которую мы рассмотрели, заключалась в том, что триплин проникает в клетки растений и влияет на транспорт ионов меди.Чтобы изучить эту возможность, мы использовали трансгенные линии RAN1 со сверхэкспрессией на фоне Col-0, чтобы проверить их чувствительность к лечению триплином. Наши результаты показали, что линии сверхэкспрессии устойчивы к лечению триплином (фиг. 4C и S14, фиг.). Одно из возможных объяснений состоит в том, что триплин действует как хелатор ионов меди, который конкурирует за медь с рецепторами этилена, что приводит к меньшему связыванию этилена с рецепторами. Чтобы проверить эту возможность, мы измерили связывание этилена с мембранами, выделенными из дрожжей, экспрессирующих этилен-связывающий домен ETR1 в присутствии и в отсутствие триплина [14].Триплин не оказывал заметного влияния на специфическое связывание этилена с рецепторами (рис. 4D). Напротив, связывание этилена с рецепторами снижалось примерно на 50%, когда триплин добавляли к растущим дрожжевым клеткам, экспрессирующим ETR1 (фиг. 4D). Эти результаты показывают, что триплин не влияет напрямую на связывание этилена, но может влиять на доставку ионов меди к рецепторам, влияя на другие белки доставки меди. Например, лечение триплином может снизить уровень ионов меди ниже оптимального уровня, необходимого для некоторых шаперонов с ионами меди.Недостаток ионов меди приведет к уменьшению количества функциональных рецепторов, что приведет к тройному ответу. Если это правда, мы должны найти некоторые мутанты, переносящие ионы меди, которые либо гиперчувствительны, либо устойчивы к лечению триплином.

ATX1 действует на транспорт ионов меди к рецепторам этилена

Предыдущие исследования показали, что RAN1 является ключевым переносчиком ионов меди, участвующим в биогенезе этиленовых рецепторов [12–14]. Однако механизмы того, как ионы меди доставляются в RAN1 и как RAN1 доставляют медь к рецепторам этилена, в настоящее время отсутствуют.Поэтому мы использовали триплин для поиска белков, которые доставляют медь к RAN1. Мы предположили, что мутации в таких белках должны быть сверхчувствительными к лечению триплином. Поэтому мы протестировали чувствительность к триплину мутантов Т-ДНК Arabidopsis , которые влияют на транспорт ионов меди, включая copt1 , copt2 , copt4 , copt5 , hma1 , hma5 , , hma ccs , zip2 , zip4 , cch и atx1 .Это выявило, что только мутанты-шапероны с ионами меди atx1-1 и atx1-2 являются гиперчувствительными к триплину (рис. 5A и 5B). ATX1 – шаперон ионов меди, играющий важную роль в гомеостазе ионов меди, который придает растениям устойчивость как к условиям избытка, так и недостатка меди у Arabidopsis [25]. atx1-1 (SALK_026221) – это нокаут-мутант, идентифицированный ранее [25], atx1-2 (SALK_041022) – другой нокаут-мутант, идентифицированный в этом исследовании (S11 Fig).Оба мутанта показали гиперчувствительность к лечению триплином. Нанесение 20 мкМ триплина на проростки atx1-1 и atx1-2 вызывало тройной ответ, как это видно на увеличенном апикальном крючке и более коротком гипокотиле. Напротив, 20 мкМ триплин не вызывал фенотипа тройного ответа у проростков дикого типа. Повторное введение гена ATX1 в мутанты atx1-1 восстановило ответ дикого типа на триплин (рис. 5B). Гиперчувствительность atx1-1 к триплину можно частично снизить путем добавления меди.Кроме того, двойные мутанты atx1-2 etr1-1 и atx1-1 ein2-5 были устойчивы к обработке триплином, сравнимые с одиночными мутантами etr1-1 и ein2-5 (фиг. S11C). Это указывает на то, что триплин действует, приводя к более низким уровням меди, доставляемой в RAN1, что, в свою очередь, снижает доставку меди к рецепторам этилена.

Рис. 5. Медный шаперон ATX1 взаимодействует с RAN1.

(A) atx1-1 и atx1-2 гиперчувствительны к триплину.Показаны фенотипы 3-дневных проростков Col-0, выращенных в темноте, atx1-1 и atx1-2 , обработанных 20 мкМ триплином. Масштабная шкала соответствует 1 мм. (B) Длина гипокотилей трехдневных проросших в темноте проростков Col-0, atx1-1 , atx1-2 , ran1-2 , atx1-1 ran1-2 и два 35S : ATX1-GFP (atx1-1) Показаны трансгенные линии, обработанные различными дозами триплина. Каждый эксперимент повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 сеянцев.Планки погрешностей представляют SEM. (C) Субклеточная совместная локализация ATX1 и RAN1. ATX1-RFP и RAN1-GFP временно экспрессировались в листьях N. benthamiana и наблюдались и отображались под конфокальным микроскопом. Масштабные полосы представляют 20 мкМ. (D) ATX1 взаимодействовал с RAN1 в дрожжевом двугибридном анализе. ATX1 был слит с ДНК-связывающим доменом (BD) GAL4, а RAN1-N (289 аминоконцевых аминокислот RAN1) был лигирован с доменом активации GAL4 (AD). Белковые взаимодействия исследовали на клетках, выращенных на синтетической выпадающей среде (-Leu / -Trp / -His / -Ade) плюс X-α-Gal (50 мг / л) в течение 3 дней.(E) Анализы комплементации бимолекулярной флуоресценции показали взаимодействие между ATX1 и RAN1 с использованием системы расщепленной люциферазы. Листья Nicotiana benthamiana были инфильтрированы агробактериями, содержащими различные комбинации конструкций, несущие как C-, так и N-конец люциферазы, слитой либо с ATX1 и RAN1-N, либо только с одним из них (контроль). (F) Анализы коиммунопреципитации показали взаимодействие между ATX1 и RAN1. Листья Nicotiana benthamiana были инфильтрированы агробактериями, содержащими ATX1-GFP / FLAG и RAN1-N-FLAG / GFP или только одним из них (контроль).Белковые экстракты подвергали иммуноблоттингу с антителом против FLAG или антителом против GFP.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.g005

ATX1 физически взаимодействует с RAN1

Предыдущая работа показала, что рецепторы этилена локализованы в мембранной сети ER [35]. Чтобы дополнительно изучить, как ATX1 участвует в опосредованном RAN1 транспорте ионов меди к рецепторам этилена, мы сравнили субклеточную локализацию ATX1 и RAN1. Сначала мы использовали 5-дневные световые трансгенные линии 35S : ATX1-GFP (atx1-1) и наблюдали нитчатые и мутные сигналы GFP в цитоплазме и вокруг ядра клеток зоны корневой меристемы.В клетках зоны удлинения корня более сильный сигнал GFP наблюдался в цитоплазме и ядре. Последующие наблюдения с использованием окрашивания 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) подтвердили ядерные сигналы, наблюдаемые в трансгенных линиях 35S : ATX1-GFP (atx1-1) [24, 25] (S12A и S12B Рис. ). Для трансгенных линий, выращенных в темноте, мы наблюдали сильные сигналы GFP в цитоплазме и ядре клеток гипокотиля, сравнимые с тем, что наблюдали в клетках зоны удлинения корня (S12C фиг.).Мы предполагаем, что в зрелых клетках экспрессия и сигнал ATX1-GFP сильнее, чем в более молодых клетках. Затем мы провели эксперименты по плазмолизу и показали, что эти сигналы GFP, наблюдаемые в интактных клетках, не локализуются на клеточной стенке. Затем мы сканировали тонкий слой клетки и наблюдали аналогичные нитевидные и мутные сигналы GFP, которые могут исходить от ATX1-GFP, прикрепленного к эндомембранной системе клетки (S12D фиг.). Используя трансгенную линию, экспрессирующую как ATX1-GFP, так и WAK2-mCherry, маркер ER, мы наблюдали, что сигналы ATX1-GFP были частично локализованы вместе с маркерами ER (S12E фиг.).

Чтобы подтвердить это наблюдение, мы также использовали временную систему экспрессии для экспрессии ATX1-GFP и WAK2-mCherry в эпидермальных клетках листьев табака ( Nicotiana benthamiana ), чтобы наблюдать субклеточное расположение ATX1. Наблюдения в этих экспериментах согласуются с нашими предыдущими наблюдениями, что ATX1 локализован в цитоплазме и ядре и может прикрепляться к мембранам ER (S13A фиг.). Используя эту временную систему экспрессии, мы наблюдали, что GmMAN1-mcherry (маркер Гольджи) демонстрирует отмеченный точечный сигнал и OsREM4.1-mCherry (маркер плазматической мембраны) не обнаруживал нитевидных сигналов, которые отличались бы от паттерна ATX1-GFP. Это подтвердило, что ATX1 не локализуется специфически на плазматической мембране и Гольджи. Только WAK2-mCherry показал ниточный сигнал (S13A фиг.). Затем мы исследовали субклеточное расположение RAN1, используя временную систему экспрессии для экспрессии RAN1-GFP и WAK2-mCherry, и мы обнаружили, что RAN1-GFP был локализован на эндомембране, а также был локализован совместно с маркером ER (S13B фиг.). Далее мы задавались вопросом, совмещены ли ATX1 и RAN1 в ячейке.Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали временную систему экспрессии для экспрессии RAN1-GFP и ATX1-RFP, и мы наблюдали, что оба белка были совместно локализованы на мембране ER (рис. 5C). Вместе наши субклеточные наблюдения показывают, что как ATX1, так и RAN1 могут прикрепляться к мембранам ER.

Чтобы изучить возможность взаимодействия ATX1 и RAN1 в planta , мы сначала провели эксперименты с двумя гибридами дрожжей. ATX1 был слит с ДНК-связывающим доменом (BD) GAL4, а RAN1-N (289 аминоконцевых аминокислот RAN1) был лигирован с доменом активации GAL4 (AD).Через три дня после того, как эти котрансформированные дрожжевые клетки были выращены на синтетической выпадающей среде (-Leu / -Trp / -His / -Ade) с X-α-Gal (50 мг / л), мы наблюдали, что клоны стали синими, что указывает на взаимодействие между ATX1 и RAN1-N в дрожжевых клетках (рис. 5D). Это было затем подтверждено с помощью анализов бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в листьях Nicotiana benthamiana . Для этого были созданы конструкции 35S: cLUC-ATX1 и 35S: nLUC-RAN-N, которые совместно трансформировали растения, и результаты показали, что эти белки взаимодействуют друг с другом (фиг. 5E).Анализы коиммунопреципитации (Co-IP) с использованием ATX1-GFP / FLAG и RAN1-N-FLAG / GFP также показали, что ATX1 взаимодействует с RAN1 (рис. 5F). Эти результаты показывают, что ATX1 физически взаимодействует с RAN1 in planta . Вместе вышеперечисленные данные подтверждают гипотезу о том, что ионы меди, необходимые для биогенеза рецептора этилена и передачи сигналов, транспортируются через ATX1 к RAN1 и, наконец, к рецепторам этилена.

Обсуждение

Функциональная характеристика генов растений с использованием генетических подходов зависит от наблюдаемых фенотипов при мутации изучаемого гена.Для передачи сигналов этилена этот мутационный подход уже давно исчерпал себя. Преодоление этой проблемы является важным и неотложным. Недавно разработанные подходы к химической генетике, использующие специфические активные малые молекулы, обеспечивают обратимые, контролируемые временем и силой генетические возмущения для генетических исследований и характеристики функций генов [36]. В этом исследовании мы применили высокопроизводительный скрининг на основе химической генетики растений и обнаружили триплин, новую небольшую молекулу, которая вызывает тройную реакцию у выращенных в темноте проростков Arabidopsis .Кроме того, мы продемонстрировали, что триплин – новый хелатор ионов меди, который снижает токсическое воздействие высоких уровней ионов меди на рост корней. Кроме того, фенотип тройного ответа, возникающий в результате обработки триплином, снижается путем добавления Cu ²⁺ и Ag ⁺ . Это сильно отличается от другого хелатора ионов неокупроина. Хотя неокупроин вызывает фенотип тройного ответа, этот эффект подавляется Zn ²⁺ , но не Cu ²⁺ . При смешивании Zn ²⁺ и неокупроина образуется белый осадок (S7 Рис).В то время как низкая концентрация ионов меди могла частично восстановить гиперчувствительность ran1-2 к неокупроину (S10B фиг.). Другая проблема с неокупроином заключается в том, что его добавление в среду для выращивания растений усиливает токсическое воздействие высоких уровней ионов меди на рост корней растений (S10C, рис.). Таким образом, мы предполагаем, что неокупроин может вызывать фенотип тройного ответа за счет хелатирования ионов меди, таких как триплин, но его специфичность и безопасность сомнительны. Другие хелаторы ионов меди, такие как BCS, не вызывают фенотип тройного ответа.Мы считаем, что триплин не только хелатирует ионы меди в среде роста растений, но также хелатирует ионы меди в растительных клетках, когда попадает в растительные клетки. Мы прогнозируем, что это ограничивает доступ ионов меди, необходимых для биогенеза рецептора этилена, и это состояние приводит к фенотипу тройного ответа. Наше исследование показывает, что триплин отличается от других охарактеризованных хелаторов меди и может нарушать транспорт ионов меди и расщеплять этиленовую сигнальную сеть.

Мы все еще мало знаем о химии триплина. Следует отметить, что триплин не влияет напрямую на связывание этилена с ETR1 (рис. 4D). Это может быть связано с его ограниченной растворимостью в воде, и мы заметили, что его осаждение усиливается при добавлении CuSO ₄ или AgNO ₃ (S11C, рис.). Одна из возможностей заключается в том, что его низкая растворимость препятствует прямому влиянию триплина на связывание этилена с ETR1. Однако триплин мог проникать в растущие дрожжевые клетки, экспрессирующие ETR1, когда его добавляли в среду для выращивания дрожжей, в которой триплин снижал уровень меди в дрожжевых клетках и влиял на биосинтез ETR1.Возможно, это привело к образованию аномальных рецепторов этилена, которые не могли должным образом связывать этилен (рис. 4D). В будущем важно охарактеризовать триплин с точки зрения его химического состава.

Транспорт ионов меди от переносчика меди RAN1 к рецепторам этилена для нормального биогенеза и функционирования рецепторов был предложен, но многие важные детали в этом процессе все еще отсутствуют [12–14]. Например, какой компонент поставляет ионы меди в RAN1 и где находится это реле ионов меди? Это некоторые важные вопросы, которые нам необходимо решить в биогенезе и функционировании этиленовых рецепторов, связанных с транспортом ионов меди.Наши результаты, изучающие эффекты триплина на известных связанных с этиленом мутантов, показывают, что триплин действует выше рецепторов, но не влияет на биосинтез этилена. Например, etr1-1 и ein2 оба устойчивы к триплину. Кроме того, скрининг сверхчувствительных мутантов к триплину выявил мутанты ran1 и atx1 , которые, как предполагается, функционируют выше рецепторов, доставляя медь для нормального биогенеза рецепторов. Гиперчувствительность обоих мутантов ran1 и axt1 была устранена мутациями в нижестоящих компонентах этиленовой сигнальной сети, таких как etr1-1 (Рис. 2C и S11C Fig).Мы заметили, что atx1-1 и atx1-2 менее чувствительны к триплину, чем ran1-1 и ran1-2 (рис. 5B), и аналогичные результаты наблюдались при лечении неокупроином (S10D, рис. ). Эти результаты предполагают, что ATX1 может располагаться в сети до RAN1. Наши анализы связывания этилена показывают, что триплин не влияет напрямую на рецепторы этилена, но, по-видимому, влияет на доставку ионов меди к рецепторам. Это подтверждает гипотезу о том, что триплин нацелен на транспорт ионов меди выше рецепторов.

Хотя предполагается, что RAN1 играет ключевую роль в транспорте ионов меди в биогенезе этиленовых рецепторов и передаче сигналов, субклеточное расположение RAN1 не определено [12, 27]. Функцию хорошо известного шаперона ионов меди ATX1 трудно изучить с помощью обычных генетических подходов, поскольку мутанты, такие как atx1-1 , не обнаруживают фенотипа, связанного с этиленом [25]. Воспользовавшись триплином, сигнальными мутантами этилена и манипулируя концентрацией ионов меди в среде для роста растений, мы впервые предоставили генетические доказательства взаимодействия между RAN1 и ATX1, которое способствует транспортировке ионов меди к рецепторам этилена.ATX1 широко локализуется в клетках, указывая на то, что он, вероятно, функционирует для транспортировки ионов меди к другим мишеням в дополнение к RAN1. Это согласуется с сообщением о том, что ATX1 необходим для гомеостаза меди. Например, он может действовать как медный буфер в растительных клетках [24, 25]. Другой шаперон меди в Arabidopsis – это CCH, но мутанты cch не имеют фенотипов, связанных с этиленом. Кроме того, мы обнаружили, что мутанты cch имели ответы дикого типа на триплин, что позволяет предположить, что CCH не важен для доставки ионов меди к RAN1 и, в конечном итоге, к рецепторам этилена.Субклеточная локализация RAN1 ранее не была идентифицирована, но, основываясь на фенотипах его мутантов, кажется вероятным, что RAN1 активен в компартменте эндомембранной системы, возможно, в ER [12, 27]. Наши микроскопические наблюдения с использованием ATX1, RAN1 и маркеров органелл, а также результаты анализов взаимодействия молекул in planta показывают, что RAN1 и ATX1 частично совместно локализованы и взаимодействуют на ER. Это подтверждает идею о том, что ATX1 и RAN1 взаимодействуют как часть транспорта меди к рецепторам этилена.

Ионы меди важны для здоровья человека, нарушение которого может привести к различным заболеваниям. Все больше и больше сообщений показывают, что заболевания, связанные с медью, тесно связаны с болезнью Альцгеймера и раком человека. Поэтому были идентифицированы и охарактеризованы различные хелаторы меди для лечения этих важных заболеваний человека [37-40]. Хотя в терапии использовалось несколько хелаторов с ионами меди, до сих пор механизмы их действия не ясны [41]. Одна из проблем использования этих хелаторов заключается в том, что они не очень специфичны для ионов меди [42], а некоторые хелаторы, такие как неокупроин, могут усиливать токсическое действие ионов меди на организм, подвергаемый лечению, как мы показали в этом исследовании роста растений.С этой целью триплин представляет собой уникальный хелатор ионов меди, который может обеспечить новую структуру свинца для хелаторов ионов меди, связанных с разработкой лекарства. Таким образом, модельное растение Arabidopsis могло бы стать еще одной полезной платформой для проведения исследований с целью раскрытия хелатора ионов меди и изучения механизма его действия in vivo .

Материалы и методы

Исследования химической генетики растений

Скрининг химической генетики растений с использованием проростков Arabidopsis , выращенных в темноте, против новой по структуре и разнообразной синтетической химической библиотеки из 12 000 малых молекул от Life Chemicals Inc., как сообщалось ранее [32, 33].Для всех скринингов поверхностно-стерилизованные семена Arabidopsis Col-0, суспендированные в 0,1% агаре, были равномерно распределены в 96-луночные планшеты, которые содержали 0,8% агара, 0,3xMS соли (Sigma-Aldrich), 100 мкМ индивидуального химического вещества на лунку и 1 % ДМСО (растворитель-носитель). Семена стратифицировали в течение 3 дней в холодильнике на 4 ° C, переносили на дневной свет на 1–4 часа, затем переносили в темноту для выращивания на 3 дня при 22 ° C в герметичном шкафу для выращивания. Фенотип проростков регистрировали и отображали с помощью препаровального микроскопа SZX16.Повторно тестировали химические вещества, которые вызывали тройную реакцию у проростков Col-0, выращенных в темноте, как фенотипы. Для каждого активного химического вещества его дозовое влияние на длину гипокотилей или корней исследуемых проростков измеряли с использованием изображения J (NIH).

Выделение и характеристика мутантов, устойчивых к триплину

Для получения мутанта, устойчивого к триплину, мы использовали стратегию скрининга мутантов, модифицированную из [30]. Вкратце, 20000 семян M2 от 5000 растений M1 Col-0, мутагенизированных этилметансульфонатом (EMS), подвергали поверхностной стерилизации и выращивали при тех же условиях роста и химической дозе, что и при скрининге химической генетики растений.Фенотипы проростков исследовали под микроскопом, и они с более длинным гипокотилем или без преувеличенных апикальных крючков считались предполагаемыми мутантами, устойчивыми к триплину, и все эти мутанты затем повторно тестировались на предмет их фенотипов химической генетики в следующем поколении.

Завод по измерению этилена

Измерения этилена на растениях проводили, как описано ранее [43, 44]. Семена Col-0 стерилизовали поверхность и высаживали на твердую среду 0,5xMS.После стратификации при 4 ° C в течение 3 дней чашки экспонировали на свету в течение 1–4 часов, а затем переносили в темноту для роста на 2 дня при 22 ° C. После прорастания семян каждые 22 сеянца в группе (n = 3) переносили в флакон для газовой хроматографии с половинным объемом 0,5xMS ростовой среды содержит 100 мкМ триплина, 50 мкМ АСС или 1% ДМСО и инкубируется в течение 3 дней в непрерывной темноте. Накопленный этилен измеряли с помощью газовой хроматографии (Agilent Technologies, 6890N Network GC System) [44]. Масса сеянцев – сырая.

Анализ содержания ионов меди в растении

Собрали трехдневные этиолированные проростки Col-0, выращенные на твердой среде 0,5xMS с 20 мкМ CuSO ₄ и / или 100 мкМ триплина. Затем определяли содержание ионов меди в растениях с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, как описано ранее [45].

Анализ MALDI-TOF-MS

Для этих анализов 100 мкл ионов металлов (100 мкМ или 10 мМ) и 100 мкл триплина (100 мкМ или 10 мМ) были смешаны для анализа MALDI-TOF-MS согласно [46].Использовали времяпролетный масс-спектрометр Axima Performance (Shimadzu, Япония). Все масс-спектры в этой работе были получены в режиме отражения положительных ионов. Данные контролировались программным приложением MALDI-MS. Матрица представляет собой 5 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA). Диапазон сканирования масс-спектра 400-1000 Да.

Анализы связывания этилена

Для этого мы экспрессировали первые 128 аминокислот ETR1, содержащих этилен-связывающий домен, в виде белка слияния с GST (глутатион S- трансфераза) (ETR1 [1–128] -GST) в Pichia pastoris , как описано ранее. [47].Затем были проведены анализы связывания либо на интактных дрожжевых клетках, либо на изолированных мембранах, как описано ранее, с использованием анализа связывания радиолигандов [48, 49]. Вкратце, чтобы проверить влияние триплина на связывание этилена с его рецепторами в интактных дрожжевых клетках, дрожжи инкубировали при 30 ° C в присутствии или в отсутствие 100 мкМ триплина в течение 3 дней. Затем собирали интактные дрожжевые клетки и анализировали их связывание. Для анализов связывания с мембранами клетки разрушали, мембраны выделяли, как описано ранее [11], и определяли связывание этилена в присутствии или в отсутствие 100 мкМ триплина.Связывание насыщаемого этилена указывается в виде импульсов в минуту (СРМ) и рассчитывается путем вычитания количества радиоактивности, связанной в присутствии избытка нерадиоактивного этилена, из количества, связанного в отсутствие немеченого этилена. Мы использовали вестерн-блоттинг с антителами против GST, чтобы гарантировать равные уровни ETR1 [1–128] -GST [11].

Конструкции и трансформация растений

Конструкции и трансформацию растений проводили, как описано ранее [32]. Кодирующую последовательность (CDS) ATX1 (AT1G66240) и RAN1 (AT5G44790) амплифицировали из кДНК Col-0 с помощью ПЦР с использованием праймеров, перечисленных в таблице S2.Затем фрагменты клонировали в вектор входа pDONR-zeocin с помощью реакций BP, следуя инструкциям производителя (Life Technology, США). Затем гены вводили в разные векторы pGWB с помощью LR-реакций. Затем векторы использовали для трансформации штамма Agrobacterium GV3101, трансформированные агробактерии, наконец, использовали для трансформации цветущих растений Arabidopsis методом окунания в цветы [50].

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

qRT-PCR проводили, как описано ранее [32].Для тестирования уровня экспрессии ERF1 семена стерилизовали поверхность и высаживали на питательную среду 0,5xMS, содержащую различные химические вещества, в чашки Петри, после стратификации при 4 ° C в течение 3 дней чашки подвергали воздействию света в течение 1–4 часов, затем переносили. до темноты в течение 3 дней (22 ° C) и собирали проростки. Для тестирования уровня экспрессии RAN1 в растениях дикого типа и трансгенных растениях собирали трехнедельные листья растений, экстрагировали общие РНК и использовали для синтеза кДНК путем обратной транскрипции.Праймеры для ERF1 изготавливали согласно [43]. Все использованные праймеры перечислены в таблице S2. Ген ACTIN амплифицировали и использовали в качестве внутреннего контроля.

Конфокальное наблюдение и визуализация

pDONR-ATX1 и pDONR-RAN1 вводили в векторы pGWB, как описано в [32]. Комбинации конструкций ATX1: PGWB5 / PGWB654 и RAN1: PGWB605 использовали для трансформации Agrobacterium GV3101; затем Agrobacterium проникли в листья N.benthamiana с P19 [32]. После 2-дневной инкубации листья трансформированных растений наблюдали и отображали под конфокальным микроскопом (Olympus FV1000). Для трансгенных растений 5-дневные выращенные на свету корни или 3-дневные темные гипокотили визуализировали под конфокальным микроскопом. Однако фотографии в S12C и S12D Fig были получены с помощью NIKON A1R. Используемые маркеры белка ER, Гольджи и плазматической мембраны – это AtWAK2, GmMAN1 и OsREM4.1 соответственно [51, 52]. Arabidopsis Трансгенные семена WAK2-mCherry или GmMAN1-mCherry являются подарками лаборатории Chi-Kuang Wen Шанхайского института физиологии и экологии растений Китайской академии наук.Для окрашивания DAPI проростки фиксировали в 5% метаноле, погружали в 2 мкг / мл DAPI в фосфатно-солевом буфере (PBS) и просматривали с помощью флуоресцентной микроскопии в УФ-свете.

Дрожжевой двугибридный анализ

Дрожжевые двугибридные эксперименты проводили, как описано ранее [32]. pGADT7 (N-конец RAN1) и pGBKT7 (ATX1) трансформировали одновременно в дрожжевой штамм Ah209, колонии переносили в твердую среду SD (-Leu / -Trp / -His-Ade) с X-α-gal в соответствии с протоколы производителя (Clontech) на 3 дня.Положительные клоны были идентифицированы, потому что они хорошо росли и стали синими.

BiFC и Co-IP в

BiFC и Co-IP проводили, как описано ранее [32, 52]. Использовали систему комплементации сплит-люциферазой. Комбинации конструкций cLuc-ATX1 / nLuc-RAN1-N использовали для трансформации Agrobacterium GV3101; затем Agrobacterium проникли в листья N . benthamiana с P19, как описано ранее.После 2-дневной инкубации 1 мМ люциферин (Sigma) был отфильтрован в листья, и изображения были записаны с использованием системы визуализации CCD (Berthold, https://www.berthold.com/). Для анализа Co-IP листья N. benthamiana трансфицировали Agrobacterium , содержащим ATX1-GFP / FLAG и RAN1-N-FLAG / GFP, и инкубировали в течение 2 дней. Общие белки экстрагировали буфером для экстракции [50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон X-100 и смесь ингибиторов протеазы 0,1% (Promega)] для 20 минут и центрифугировали при 4 ° C при 12000 об / мин в течение 20 минут.Супернатант инкубировали с предварительно обработанными агарозными гранулами, связанными с антителами против FLAG (Abmart), в течение 2 часов при 4 ° C. Гранулы трижды промывали промывочным буфером (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100). Связанные белки элюировали загрузочным буфером 2xSDS и кипятили при 100 ° C в течение 5 минут. Элюированные белки разделяли на SDS-PAGE и подвергали иммуноблоттингу с помощью антитела против FLAG (Abmart) и антитела против GFP (Abmart).

Регистрационный номер

ATX1 (AT1G66240), RAN1 (AT5G44790), CCH (AT3G56240), ETR1 (AT1G66340), EIN2 (AT5G03280), EIN3 (AT3G20770), Triplin (F0655-1171)

Дополнительная информация

S1 Рис.Другие химические вещества, вызывающие фенотип тройной реакции, были обнаружены в этом исследовании.

Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0 и ein2-5 , обработанных 100 мкМ F0617-0170, F0665-0601, F1806-0031 или F2001-0992. Для обработки AgNO ₃ использовали концентрацию 500 мкМ. Масштабные линейки соответствуют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s001

(TIF)

S2 Рис. Фенотипы устойчивых к триплину мутантов EMS, полученные в этом исследовании.

(A) Фенотип 3-дневных проростков, выращенных в темноте, из поколения M2 доминантных мутантов, устойчивых к триплину 45–1 и 45–2 , обработанных 100 мкМ триплина. (B) Необработанные данные секвенирования ДНК генома мутантов 45–1 и 45–2 , показывающие мутации замены G194A, идентичные мутации в etr1-1 . (C) Фенотипы 3-дневных выращенных в темноте рецессивных мутантов, устойчивых к триплину 39–1 , 39–2 , 41–1 , 41–2 , 42 , 43 и 44 и их F1 s с ein2 , обработанные 100 мкМ триплином.Для сравнения показаны фенотипы Col-0 и ein2 . Масштабные линейки соответствуют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s002

(TIF)

S3 Рис. Нечувствительные к этилену мутанты устойчивы к триплину.

Фенотип 3-дневных проростков, выращенных в темноте, без (-) или с (+) 100 мкМ триплина. Фенотипы (A) Col-0, ein2-5 и ein2-5 , комплементарные линии, com17-2 и com27-7 , и (B) устойчивые к этилену мутанты рецепторов этилена, ers1 -1 , ers2-1 , etr2-1 и ein4 .Масштабные линейки соответствуют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s003

(TIF)

S4 Рис. Триплин не усиливает биосинтез этилена.

(A) qRT-PCR анализ относительных уровней экспрессии ACS5 , ACS6 и ACS11 . Трехдневные проростки Col-0 в темноте обрабатывали ДМСО или 100 мкМ триплином. Каждый эксперимент повторяли три раза, и столбцы ошибок представляют собой SEM. (B) Длина гипокотиля 3-дневных выращенных в темноте проростков Col-0 и cin5-1 , обработанных ДМСО или 100 мкМ триплином.Каждый опыт повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 проростков. Планки погрешностей представляют SEM. По двустороннему t-критерию Стьюдента с пороговым значением 0,05 существенной разницы не наблюдалось. (C) Длина гипокотиля 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0 в присутствии триплина без или с 10 мкМ AVG. Эксперименты были повторены три раза с аналогичными результатами (n ≥ 30). Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, и по двустороннему t-критерию Стьюдента с использованием 0 значительных различий не наблюдалось.05 отсечка. (D) Газохроматографический анализ продукции этилена в Col-0, обработанном 100 мкМ триплином, 50 мкМ ACC или 1% (об. / Об.) ДМСО в качестве контроля. n = 3; планки погрешностей представляют SEM. Масштабные линейки представляют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s004

(TIF)

S5 Рис. Влияние различных ионов металлов на реакции триплина.

(A) Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 100 мкМ триплина в присутствии указанных солей металлов.Концентрация солей металлов составляла 200 мкМ, за исключением NiSO4, где использовали 100 мкМ. Масштабные линейки представляют 1 мм. (B) Длина гипокотиля проростков в (A). Эксперименты были повторены три раза с аналогичными результатами (n ≥ 30). Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, и при использовании двустороннего t-критерия Стьюдента с пороговым значением 0,05 не наблюдалось значительной разницы.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s005

(TIF)

S6 Рис. Триплин снижает токсическое действие ионов меди, а Ag

(A) Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 100 или 200 мкМ CuSO. ₄ с или без 100 или 200 мкМ триплина. (B) Длина гипокотиля проростков в (A). Каждый опыт повторяли трижды, каждый раз использовали более 30 проростков. Планки погрешностей представляют SEM. * P <0,05 (двусторонний t-критерий Стьюдента) указывает на значительную разницу между группами, получавшими разные методы лечения. (C) Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 100 мкМ триплина в присутствии 0, 100, 200 или 500 мкМ AgNO ₃ .(D) Длина гипокотиля проростков в (C). Все эксперименты были повторены трижды с аналогичными результатами. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (n> 30). В (A) и (C) масштабные линейки представляют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s006

(TIF)

S7 Рис. Реакция различных ионов металлов и хелаторов меди.

Появление 100 мкл 100 мМ солей металлов CaCl ₂ , ZnSO ₄ , CuSO ₄ или AgNO ₃ были смешаны со 100 мкл 10 мМ хелаторов ионов меди триплина, неокупроина или BCS в 1.Пробирки Эппендофа 5 мл. Масштабная линейка соответствует 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s007

(TIF)

S8 Рис. MALDI-TOF-MS анализ продуктов реакции ионов металлов и триплина.

Результаты анализа MALDI-TOF-MS продукта реакции 100 мкМ ZnSO ₄ и 100 мкМ триплина (A), продукта реакции 100 мкМ FeSO ₄ и 100 мкМ триплина (B) и продукта реакции 10 мМ AgNO ₃ и 10 мМ триплина (C).Соли металлов и триплин смешивали, как описано на рис. S7

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s008

(TIF)

S9 Рис. Гиперчувствительность проростков к обработке триплином, выращенных в среде роста без иона меди, зависит от сигнального пути этилена.

Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков ein2-5 , выращенных на другой питательной среде с 50 мкМ триплином или без него. -Cu означает, что среда для выращивания состоит из основных элементов растений, за исключением иона меди.BCS указывает на ростовую среду 0,5xMS с 500 мкМ BCS. Масштабная линейка соответствует 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s009

(TIF)

S10 Рис. Воздействие неокупроина на проростки, обработанные различными ионами.

(A) Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0, обработанных 100 мкМ неокупроина в отсутствие металла, 500 мкМ AgNO ₃ , 100 мкМ CuSO ₄ или 100 мкМ ZnSO ₄ . Для сравнения показаны фенотипы ein2-5 , выращенные только с 100 мкМ неокупроина.(B) Показаны фенотипы 3-дневных, выращенных в темноте проростков ran1-2 , выращенных на 5 мкМ неокупроина без или с 10 или 20 мкМ CuSO ₄ . (C) Показаны фенотипы 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0 без или с 5, 20, 50 или 100 мкМ неокупроина в сочетании с 0, 10 или 20 мкМ CuSO ₄ . (D) atx1-1 и ran1-2 являются гиперчувствительными к неокупроину. Фенотипы 3-дневных выращенных в темноте проростков Col-0, atx1-1 и ran1-2 обрабатывали 5, 10 или 20 мкМ неокупроином.На всех рисунках масштабные линейки представляют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s010

(TIF)

S11 Рис. Гиперчувствительность

(A) Диаграмма показывает расположение мутантов со вставкой Т-ДНК ATX1 , Salk_026221 ( atx1-1 ) и Salk_041022 ( atx1-2 ). (B) Экспрессию гена atx1-1 и atx1-2 исследовали с помощью RT-PCR. ACTIN использовался в качестве контроля загрузки. (C) Фенотипы 3-дневных выращенных в темноте проростков atx1-1 , atx1-1 etr1-1 и atx1-1 ein2-5 , обработанных 100 мкМ триплином. Масштабная линейка соответствует 1 мм. (D) Фенотип 3-дневных, выращенных в темноте проростков Col-0 и atx1-1 , обработанных 20 мкМ триплином с (+) или без (-) 10 мкМ CuSO ₄ . Масштабные линейки представляют 1 мм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s011

(TIF)

S12 Рис. ATX1 располагается в цитоплазме и ядре.

(A) Сканирующие изображения корней проростков 35S : ATX1-GFP (atx1-1) под конфокальным микроскопом (Olympus FV1000). (B) Сканирующие изображения корней проростков 35S : ATX1-GFP (atx1-1) после окрашивания DAPI под конфокальным микроскопом (Olympus FV1000). (C) Сканирующие изображения эпидермальных клеток гипокотиля 35S : ATX1-GFP (atx1-1) проростков с помощью конфокального микроскопа (NIKON A1R).(D) Сканирующее изображение дна клетки в гипокотиле проростков 35S : ATX1-GFP (atx1-1) с помощью конфокального микроскопа (NIKON A1R). (E) Сканирующие изображения гипокотилей F1 из 35S : ATX1-GFP (atx1-1) и линий трансгенных маркеров с WAK2-mCherry под конфокальным микроскопом (Olympus FV1000). (F) Сканирующие изображения гипокотилей F1 из 35S : ATX1-GFP (atx1-1) и линий трансгенных маркеров с GmMAN1-mCherry под конфокальным микроскопом (Olympus FV1000).Все масштабные линейки представляют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s012

(TIF)

S13 Рис. ATX1 и RAN1 совместно локализованы с маркером мембраны ER в листьях N. benthamiana.

(A) ATX1-GFP и WAK2 / GmMAN1 / OsREM4.1-mCherry временно экспрессировались в листьях N. benthamiana, и показана их совместная локализация. (B) RAN1-GFP и WAK2 / GmMAN1 / OsREM4.1-mCherry временно экспрессировались в листьях N. benthamiana, и была показана их совместная локализация.Все изображения были сделаны под конфокальным микроскопом (Olympus FV1000). Масштабные полосы соответствуют 20 мкМ.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s013

(TIF)

S14 Рис. Сверхэкспрессия

(A) Фенотип 3-дневных выращенных в темноте проростков Col-0 и двух трансгенных линий 35S : RAN1-GFP , обработанных триплином 0, 30, 50 или 100 мкМ. (B) qRT-PCR анализ относительных уровней экспрессии RAN1 в двух линиях 35S : RAN1-GFP .Каждый эксперимент повторяли три раза, и столбцы ошибок представляют собой SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006703.s014

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Suhong Liu (Шанхайский институт органической химии Китайской академии наук) за анализ MALDI-TOF-MS, Hongying Yi (Шанхайский институт физиологии и экологии растений Китайской академии наук) за анализ содержания меди в растениях, Xiaoshu Gao (Шанхайский институт физиологии и экологии растений Китайской академии наук) за помощь в создании конфокальных изображений, Вэй Чжан из лаборатории Вэнь за измерение этилена, Сюэлу Ван (Фуданский университет) за предоставление мутанта atx1 и Хун Цяо за предоставление ein2- 5 и дополнительные строки.Мы благодарим Tsuyoshi Nakagawa (Университет Симанэ) за предоставление векторов pGWB.

Вклад авторов

1. Концептуализация: YZ BMB.
2. Формальный анализ: WL RFL YZ BMB.
3. Расследование: WL RFL YY JL.
4. Ресурсы: KCY YX LL CKW.
5. Написание – первоначальный эскиз: WL YZ.
6. Написание – просмотр и редактирование: YX LL CKW.

Список литературы

1. 1.Bleecker AB, Estelle MA, Somerville C, Kende H. Нечувствительность к этилену, обусловленная доминирующей мутацией у Arabidopsis thaliana. Наука. 1988. 241 (4869): 1086–9. pmid: 17747490
2. 2. Роман Г., Любарский Б., Кибер Дж. Дж., Ротенберг М., Эккер Дж. Р. Генетический анализ передачи этиленового сигнала в Arabidopsis-Thaliana – 5 новых мутантных локусов, интегрированных в путь стресс-реакции. Генетика. 1995. 139 (3): 1393–409. pmid: 7768447
3. 3. Хуа Дж, Мейеровиц Э.М.Этиленовые ответы негативно регулируются семейством рецепторных генов Arabidopsis thaliana. Клетка. 1998. 94 (2): 261–71. pmid: 9695954
4. 4. Кибер Дж. Дж., Ротенберг М., Роман Г., Фельдманн К. А., Эккер Дж. Р. Ctr1, отрицательный регулятор пути этиленового ответа у Arabidopsis, кодирует член семейства протеинкиназ Raf. Клетка. 1993. 72 (3): 427–41. pmid: 8431946
5. 5. Ju CL, Yoon GM, Shemansky JM, Lin DY, Ying ZI, Chang JH и др. CTR1 фосфорилирует центральный регулятор EIN2, чтобы контролировать передачу сигналов гормона этилена от мембраны ER к ядру у Arabidopsis.P Natl Acad Sci USA. 2012; 109 (47): 19486–91.
6. 6. Цяо Х., Шен З., Хуанг С.С., Шмитц Р.Дж., Урих М.А., Бриггс С.П. и др. Обработка и субклеточный трафик ER-привязанного EIN2 контролируют реакцию на газообразный этилен. Наука. 2012. 338 (6105): 390–3. pmid: 22936567
7. 7. Чао К., Ротенберг М., Солано Р., Роман Г., Терзаги В., Эккер-младший. Активация пути ответа на газ этилен у Arabidopsis ядерным белком ETHYLENE-INSENSITIVE3 и родственными белками. Клетка.1997. 89 (7): 1133–44. pmid: 9215635
8. 8. Гуо Х.В., Эккер-младший. Ответы растений на газообразный этилен опосредуются SCF (EBF1 / EBF2) -зависимым протеолизом фактора транскрипции EIN3. Клетка. 2003. 115 (6): 667–77. pmid: 14675532
9. 9. Potuschak T, Lechner E, Parmentier Y, Yanagisawa S, Grava S, Koncz C, et al. EIN3-зависимая регуляция передачи сигналов растительного этиленового гормона двумя белками F-бокса арабидопсиса: EBF1 и EBF2. Клетка. 2003. 115 (6): 679–89. pmid: 14675533
10. 10.Gagne JM, Smalle J, Gingerich DJ, Walker JM, Yoo SD, Yanagisawa S и др. F-box 1 и 2, связывающиеся с EIN3 арабидопсиса, образуют убиквитин-протеиновые лигазы, которые подавляют действие этилена и способствуют росту, направляя деградацию EIN3. P Natl Acad Sci USA. 2004. 101 (17): 6803–8.
11. 11. Родригес Ф.И., Эш Дж.Дж., Холл А.Е., Биндер Б.М., Шаллер Г.Е., Бликкер А.Б. Кофактор меди для рецептора этилена ETR1 из Arabidopsis. Наука. 1999. 283 (5404): 996–8. pmid: 9974395
12. 12.Хираяма Т., Кибер Дж. Дж., Хираяма Н., Коган М., Гусман П., Нуризаде С. и др. Реагирующий на антагонист1, переносчик меди, связанный с болезнью Менкеса / Вильсона, необходим для передачи сигналов этилена у Arabidopsis. Клетка. 1999. 97 (3): 383–93. pmid: 10319818
13. 13. Woeste KE, Kieber JJ. Сильная мутация потери функции в RAN1 приводит к конститутивной активации пути этиленового ответа, а также к фенотипу летального розетки. Растительная клетка. 2000. 12 (3): 443–55. pmid: 10715329
14. 14.Биндер БМ, Родригес Ф.И., Бликер А.Б. Транспортер меди RAN1 необходим для биогенеза рецепторов этилена у Arabidopsis. J Biol Chem. 2010. 285 (48): 37263–70. pmid: 20876528
15. 15. Лин SJ, Culotta VC. Ген ATX1 Saccharomyces cerevisiae кодирует фактор гомеостаза малых металлов, который защищает клетки от токсичности реактивного кислорода. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1995; 92 (9): 3784–8. pmid: 7731983
16. 16. Хаффман Д.Л., О’Халлоран ТВ. Энергетика переноса меди между металло-шапероном Atx1 и внутриклеточным переносчиком меди, Ccc2.J Biol Chem. 2000. 275 (25): 18611–4. pmid: 10764731
17. 17. Fu DD, Beeler TJ, Dunn TM. Последовательность, картирование и нарушение Ccc2, гена, который перекрестно дополняет Ca ²⁺ -чувствительный фенотип мутантов Csg1 и кодирует атпазу P-типа, принадлежащую подсемейству Cu ²⁺ -Atpase. Дрожжи. 1995. 11 (3): 283–92. pmid: 7785328
18. 18. Банчи Л., Бертини И., Кантини Ф., Фелли И.К., Гоннелли Л., Хаджилиадис Н. и др. Комплекс Atx1-Ccc2 представляет собой опосредованное металлами белок-белковое взаимодействие.Природа Химическая биология. 2006. 2 (7): 367–8. pmid: 16732294
19. 19. Хамза I, Шефер М., Кломп LWJ, Гитлин JD. Взаимодействие шаперона меди HAh2 с белком болезни Вильсона необходимо для гомеостаза меди. P Natl Acad Sci USA. 1999. 96 (23): 13363–8.
20. 20. Анастассопулу И., Банчи Л., Бертини И., Кантини Ф., Кацари Э., Розато А. Структура раствора апо и медь (I) -нагруженного металло-шаперона человека HAh2. Биохимия-Ус. 2004. 43 (41): 13046–53.
21. 21. Сетти СРГ, Тенза Д., Свидерская Е.В., Беннетт Д.К., Рапосо Дж., Маркс М.С. Клеточно-специфический транспорт ATP7A поддерживает медьзависимую активность тирозиназы в меланосомах. Фасеб Дж. 2009; 23.
22. 22. Himelblau E, Mira H, Lin SJ, Culotta VC, Penarrubia L, Amasino RM. Идентификация функционального гомолога гена дрожжевого гомеостаза меди ATX1 из Arabidopsis. Plant Physiol. 1998. 117 (4): 1227–34. pmid: 9701579
23. 23. Мира Х., Мартинес-Гарсия Ф., Пеньяррубия Л.Доказательства специфического для растений межклеточного транспорта медного шаперона CCH Arabidopsis. Плант Дж. 2001; 25 (5): 521–8. pmid: 11309142
24. 24. Пуч С., Мира Х., Дорси Э., Сансенон В., Андрес-Колас Н., Гарсия-Молина А. и др. Высшие растения обладают двумя разными типами ATX1-подобных медных шаперонов. Biochem Biophys Res Commun. 2007. 354 (2): 385–90. pmid: 17223078
25. 25. Шин LJ, Lo JC, Yeh KC. Антиоксидантный белок-шаперон1 меди необходим для гомеостаза меди.Plant Physiol. 2012. 159 (3): 1099–110. pmid: 22555879
26. 26. Андрес-Колас Н., Сансенон В., Родригес-Наварро С., Майо С., Тиле Д. Д., Эккер Д. Р. и др. АТФаза HMA5 тяжелого металла P-типа Arabidopsis взаимодействует с металло-шаперонами и участвует в детоксикации меди в корнях. Плант Дж. 2006; 45 (2): 225–36. pmid: 16367966
27. 27. Беркхед Дж.Л., Рейнольдс К.А.Г., Абдель-Гани С.Е., Коху С.М., Пилон М. Гомеостаз меди. Новый Фитол. 2009. 182 (4): 799–816. pmid: 19402880
28. 28.Чен Ш., Линь Дж. К., Лю Ш., Лян Ю. К., Линь-Шиау С.Ю. Апоптоз культивируемых астроцитов, индуцированный комплексом меди и неокупроина в результате окислительного стресса и активации JNK. Toxicol Sci. 2008. 102 (1): 138–49. pmid: 18056745
29. 29. Zhang XY, Chen YT, Lin X, Hong XY, Zhu Y, Li WY и др. Аденинфосфорибозилтрансфераза 1 является ключевым ферментом, катализирующим превращение цитокининов из нуклеооснований в нуклеотиды у Arabidopsis. Завод Мол. 2013; 6 (5): 1661–72. pmid: 23658065
30. 30.Park SY, Fung P, Nishimura N, Jensen DR, Fujii H, Zhao Y, et al. Абсцизовая кислота ингибирует протеинфосфатазы типа 2C через семейство PYR / PYL белков START. Наука. 2009. 324 (5930): 1068–71. pmid: 19407142
31. 31. Савальди-Гольдштейн С., Байга Т.Дж., Пойер Ф., Даби Т., Баттерфилд С., Парри Дж. И др. Новые аналоги ауксина, стимулирующие рост интактных растений, раскрывают химическую стратегию улучшения доставки гормонов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2008; 105 (39): 15190–5. pmid: 18818305
32. 32.Е YJ, Gong ZY, Lu X, Miao DY, Shi JM, Lu J и др. Локус 1 устойчивости к гермостатину кодирует белок пальца PHD, участвующий в опосредованном ауксином состоянии покоя и прорастания семян. Завод Журнал. 2016; 85 (1): 3–15. pmid: 26611158
33. 33. Чжао Ю., Чоу Т.Ф., Пакрин Р.С., Альфред С.Е., Корир А.К., Ларив С.К. и др. Химико-генетический анализ естественной изменчивости обнаруживает гликоактивированную молекулу. Природа Химическая биология. 2007. 3 (11): 716–21. pmid: 178
34. 34. Чжао Ю.Метод химической генетики для раскрытия малых молекул для анализа механизма ответов АБК при прорастании семян арабидопсиса. Методы Мол биол. 2012; 876: 107–16. pmid: 22576089
35. 35. Dong CH, Rivarola M, Resnick JS, Maggin BD, Chang C. Субклеточная совместная локализация Arabidopsis RTE1 и ETR1 поддерживает регуляторную роль RTE1 в передаче сигналов этилена ETR1. Завод Журнал. 2008. 53 (2): 275–86. pmid: 17999643
36. 36. Тот Р., ван дер Хорн Р.А. Новые принципы химической генетики растений.Trends Plant Sci. 2010. 15 (2): 81–8. pmid: 20036182
37. 37. Арнал N, де Аланис MJT, Марра, Калифорния. Карнозин и неокупроин как нейтрализующие агенты для повреждений, вызванных перегрузкой медью, в культивируемых клетках человека. Хим-Биол Взаимодействие. 2011. 192 (3): 257–63. pmid: 21501601
38. 38. Кенче В.Б., Барнхэм К.Дж. Болезнь Альцгеймера и металлы: терапевтические возможности. Br J Pharmacol. 2011; 163 (2): 211–9. pmid: 21232050
39. 39. Черный Р.А., Этвуд С.С., Ксилинас М.Э., Грей Д.Н., Джонс В.Д., Маклин К.А. и др.Лечение хелатором медь-цинк заметно и быстро ингибирует накопление бета-амилоида у трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера. Нейрон. 2001. 30 (3): 665–76. pmid: 11430801
40. 40. Franz KJ. Применение неорганической химии для лечения рака. Далтон Т. 2012. 41 (21): 6333–4.
41. 41. Pushie MJ, Nienaber KH, Summers KL, Cotelesage JJH, Ponomarenko O, Nichol HK, et al. Структура раствора клиохинольного комплекса меди. J Inorg Biochem. 2014; 133: 50–6.pmid: 24503514
42. 42. Черный Р.А., Этвуд С.С., Ксилинас М.Э., Грей Д.Н., Джонс В.Д., Маклин К.А. и др. Лечение хелатором медь-цинк заметно и быстро ингибирует накопление бета-амилоида у трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера. Нейрон. 2001. 30 (3): 665–76. pmid: 11430801
43. 43. Tan ST, Xue HW. Казеинкиназа 1 регулирует синтез этилена, фосфорилируя и способствуя обороту ACS5. Cell Rep.2014; 9 (5): 1692–702. pmid: 25464840
44. 44. Чжан В, Вэнь СК.Приготовление газообразного этилена и сравнение ответов этилена, индуцированных этиленом, АСС и этиленом. Plant Physiol Bioch. 2010. 48 (1): 45–53.
45. 45. Ли JY, Fu YL, Pike SM, Bao J, Tian W, Zhang Y и др. Транспортер нитратов арабидопсиса NRT1.8 участвует в удалении нитратов из ксилемного сока и обеспечивает устойчивость к кадмию. Растительная клетка. 2010. 22 (5): 1633–46. pmid: 20501909
46. 46. Чжу Л., Чжан Дж., Го Ю.Л. Расширенный протокол обнаружения и обессоливания фосфопептидов, элюированных с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным Fe (III), в прямом анализе MALDI TOF.J Proteomics. 2014; 96: 360–5. pmid: 24334172
47. 47. МакДэниел Б.К., Биндер Б.М. Этиленовый рецептор 1 (ETR1) является достаточным и играет доминирующую роль в подавлении этиленового ответа серебром у Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 2012. 287 (31): 26094–103. pmid: 22692214
48. 48. Schaller GE, Bleecker AB. Этилен-связывающие сайты, созданные в дрожжах, экспрессирующие ген Etr1 Arabidopsis. Наука. 1995; 270 (5243): 1809–11. pmid: 8525372
49. 49.Sisler EC. Измерение связывания этилена в тканях растений. Физиология растений. 1979; 64 (4): 538–42. pmid: 16661005
50. 50. Клаф SJ, Бент AF. Цветочное погружение: упрощенный метод опосредованной Agrobacterium трансформации Arabidopsis thaliana. Завод Журнал. 1998. 16 (6): 735–43. pmid: 10069079
51. 51. Nelson BK, Cai X, Nebenfuhr A. Многоцветный набор маркеров органелл in vivo для исследований совместной локализации у Arabidopsis и других растений. Плант Дж. 2007; 51 (6): 1126–36.pmid: 17666025
52. 52. Gui J, Zheng S, Liu C, Shen J, Li J, Li L. OsREM4.1 взаимодействует с OsSERK1, чтобы координировать взаимосвязь между абсцизовой кислотой и передачей сигналов брассиностероида в рисе.