4. Выводы

Наночастицы ZnO были получены с использованием метода влажного химического синтеза и охарактеризованы методами XRD, SEM, SAED, УФ-видимой абсорбции и спектроскопии фотолюминесценции.Исследования XRD и SEM подтвердили наноструктуры полученных наночастиц ZnO. Рисунок SAED состоит из ярких однородных колец, подтверждающих преимущественную ориентацию нанокристаллов, а не случайную ориентацию. По спектру поглощения в УФ-видимой области рассчитанный средний размер полученных наночастиц ZnO составляет 2,2 нм для длины волны пикового поглощения. Полученные наночастицы ZnO демонстрируют (exc = 320 нм) резкую УФ-полосу, соответствующую ближней запрещенной зоне экситонного излучения, и широкую зеленую полосу излучения, обусловленную кислородной вакансией при комнатной температуре.Эти наночастицы ZnO могут использоваться в различных промышленных приложениях, а именно в люминесцентных материалах для люминесцентных ламп, активной среде для лазеров, сенсоров и так далее.

Благодарность

Авторы хотели бы поблагодарить руководство и директора инженерного колледжа Лакиредди Бали Редди за их постоянную поддержку и финансовую поддержку в выполнении этой работы.

Границы | Биогенный синтез и характеристика противомикробных и противопаразитарных наночастиц оксида цинка (ZnO) с использованием водных экстрактов гималайского колумбина (Aquilegia pubiflora)

Графическая аннотация. Схема процесса синтеза и биомедицинского применения ZnO-NP.

Введение

В последние годы разработка экологически безопасных методов синтеза наноразмерных материалов стала основным направлением деятельности ученых-материаловедов (Иревани, 2011). В связи с этим синтез НЧ на основе растений является растущей тенденцией в зеленой химии, которая считается простой, недорогой и нетоксичной (Bala et al., 2015; Duan et al., 2015). За последнее десятилетие обширные исследования наночастиц оксидов металлов были сосредоточены в связи с их многочисленными применениями в различных технологических секторах (Altavilla and Ciliberto, 2011).Среди металлических наночастиц наночастицы оксида цинка (ZnO-NP) являются перспективными неорганическими материалами с многогранными преимуществами. Превосходные оптические, полупроводниковые и пьезоэлектрические свойства, а также химическая чувствительность позволяют использовать ZnO-NP в различных отраслях промышленности, таких как композиты, косметика, катализ, накопление энергии, электроника, текстиль и здравоохранение (Hatamie et al., 2015; Kumar and Rao, 2015; Кумар и др., 2015; Аль-Наамани и др., 2016; Санкапал и др., 2016). НЧ нетоксичны, биосовместимы и недороги и имеют различные биомедицинские применения, включая их использование в качестве противомикробных и противопаразитарных агентов (Cai et al., 2016).

В настоящее время ZnO-NP обычно синтезируют физическими и химическими методами. Химические подходы включают золь-гель, гидротермальный, распылительный пиролиз, сонохимический, сольвотермический и электроосаждение, в то время как обычно используемые физические методы включают термическое испарение, импульсное лазерное осаждение, молекулярно-лучевую эпитаксию и химическое лазерное осаждение (Ameen et al., 2015; Fan et al., 2015; Mani, Rayappan, 2015; Sonker et al., 2015; Suntako, 2015; Wang et al., 2015).

Хотя химические и физические методы синтеза ZnO-NP имеют несколько преимуществ, они обладают значительными недостатками.Физические методы синтеза связаны с высокими энергозатратами, в то время как химический синтез предполагает использование вредных химикатов, что делает оба метода недружественными, дорогими и трудоемкими для окружающей среды (Diallo et al., 2015).

Для преодоления проблем, связанных с опасными отходами и энергией, был предложен зеленый синтез НЧ, который успешно используется для синтеза ZnO-НЧ; следовательно, можно наблюдать сдвиг парадигмы в сторону био-нано-интерфейса. Среди различных биологических ресурсов (растений, бактерий, водорослей и грибов) растения представляют собой идеальную платформу для биосинтеза НЧ (Thema et al., 2015). Биогенный синтез ZnO-NP уже был продемонстрирован; однако имеются ограниченные данные об их разнообразных биологических свойствах.

Здесь мы сообщаем о быстром синтезе ZnO-NP при комнатной температуре с помощью полной экологически чистой процедуры, которая включает использование водных экстрактов Aquilegia pubiflora в качестве эффективного окислителя / восстановителя, а также укупорочного агента. A. pubiflora – важное местное растение с хорошо документированным медицинским использованием.Традиционно растение используется при различных заболеваниях, включая гепатит, заживление ран, лечение ожогов кожи, желтуху, а также сердечно-сосудистые заболевания и сердечно-сосудистые заболевания (Hussain et al., 2011; Adnan et al., 2012; Ahmed and Murtaza, 2015; Thatoi et al. др., 2016). Из-за простоты доступности и лекарственного значения это растение использовалось для биосинтеза ZnO-NP в широком диапазоне терапевтических применений.

Насколько нам известно, это первый отчет о A.pubiflora -опосредованный синтез ZnO-NP. НЧ были хорошо охарактеризованы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR), дифракции рентгеновских лучей (XRD), сканирующей электронной микроскопии (SEM), спектроскопии комбинационного рассеяния и фотолюминесценции (PL). Затем хорошо охарактеризованные НЧ исследовали на их противомикробный и антилейшманиальный потенциал, а также ингибирующий потенциал протеинкиназы (ПК). Более того, чтобы гарантировать биосовместимость, также была исследована гемосовместимость NP со свежевыделенными эритроцитами человека (hRBCs).

Материалы и методы

Сбор и переработка растительного материала

Трава, о которой идет речь в данном исследовании, была собрана в районе Сват (Майн Дамм), Хайбер-Пахтунхва, Пакистан. Растение было таксономически идентифицировано как A. pubiflora на факультете ботаники Университета Бача Хан, Чарсадда, а затем подтверждено на факультете наук о растениях Университета Каид-и-Азам, Исламабад, Пакистан.

Свежие и тонкие листья растения разрезали на мелкие кусочки с помощью стерильного хирургического лезвия, хорошо промывали дистиллированной водой для удаления любых частиц пыли и загрязнений с последующей сушкой в ​​тени.Затем хорошо высушенные листья измельчали ​​в мелкий порошок на мельнице Willy и хранили при 25 ° C для водной экстракции.

Водный экстракт листьев растительного материала получали добавлением 30 г тонкого порошка в колбы (500 мл), содержащие 200 мл дистиллированной воды, непрерывно обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин и выдерживали в инкубаторе со встряхиванием при 200 об / мин в течение 2 дней при 37 ° С. Приготовленный экстракт сначала дважды фильтровали с помощью нейлоновой ткани для удаления твердых остатков, а полученный экстракт дополнительно фильтровали с использованием фильтровальной бумаги Whatman три раза для удаления любых оставшихся частиц.Затем свежий фильтрат обрабатывали для дальнейшего использования.

Анализ ВЭЖХ

Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ после водной экстракции, как описано выше. Система ВЭЖХ состояла из системы ВЭЖХ Varian с насосом Varian Prostar 230, дегазатора Metachem Degasit, автоматического пробоотборника Varian Prostar 410 и детектора на фотодиодной матрице Varian Prostar 335 (PAD). Система ВЭЖХ управлялась программным обеспечением Galaxie версии 1.9.3.2 (Varian, Le Plessis-Robinson, Франция). Стандарты для ВЭЖХ были получены от Sigma-Aldrich.Техника, используемая для разделения, адаптирована из Bourgeois et al. (2016). Здесь использовали Hypersil PEP 300 C18, 250 × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, оборудованный защитной колонкой Alltech, 10 × 4,1 мм, при 35 ° C. Обнаружение соединения достигалось при 280 нм. Подвижная фаза состояла из смеси растворителя A = HCOOH / H ₂ O, pH = 2,1 и растворителя B = CH ₃ OH (растворители для ВЭЖХ). Состав подвижной фазы менялся в течение 1 часа с нелинейным градиентом следующим образом: 8% B (0 мин), 12% B (11 мин), 30% B (17 мин), 33% B (28 мин). ), 100% B (30–35 мин) и 8% B (36 мин) при скорости потока 1 мл / мин.Между каждым запуском применяли 10-минутное повторное уравновешивание. Количественная оценка была основана на внешних калибровочных кривых по 5 точкам с R ² не менее 0,999 с использованием коммерческих эталонов (Sigma-Aldrich; Таблица 1). Все образцы анализировали трижды, и результаты выражали в мкг / мг DW образца.

Таблица 1. Количественные параметры используемого метода ВЭЖХ.

Биосинтез наночастиц ZnO

были синтезированы в соответствии с ранее описанным протоколом с небольшими изменениями (Thema et al., 2015). Вкратце, 6,0 грамма дигидрата ацетата цинка (Zn (CH ₃ COO) ₂ ⋅2H ₂ O (Sigma-Aldrich) добавляли к 100 мл экстракта и выдерживали на магнитной мешалке при 60 ° C в течение 2 часов. После завершения реакции смеси давали остыть при 25 ° C, центрифугировали (HERMLE Z326K) при 10000 об / мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли, а оставшийся осадок трижды промывали дистиллированной водой, выливали в чистый Чашку Петри и сушили в печи при 90 ° C.Затем высушенный материал измельчали ​​в мелкий порошок пестиком и ступкой и прокаливали в течение 2 часов при 500 ° C для удаления любых примесей.Отожженный порошок хранился в герметичном стеклянном сосуде, маркированном как ZnO-NP, и в дальнейшем использовался для физических характеристик и биологических применений.

Физико-химические и морфологические характеристики

Несколько методов характеризации, включая XRD, FTIR, PL, SEM, RAMAN-спектроскопию, динамическое рассеяние света (DLS) и исследования дисперсии, были выполнены для оценки структурных, химических, колебательных и морфологических свойств биосинтезированных ZnO-NP.Для определения кристаллической природы XRD (Model-D8 Advance, Германия) проводили в диапазоне 2 O (10–80 °) с шагом 0,55 с и размером шага сканирования 0,03 ° / с. Дифракционные данные были получены через Cu Kα-излучение (длина волны 1,5406 Å; напряжение генератора 40 кВ; ток трубки 30 мА). Для анализа использовали около 1 мг порошкообразных ZnO-NP. Для расчета размера кристаллитов использовалось следующее уравнение Шерера:

D = Kλ / βCosθ

, где D обозначает размер кристаллитов, k представляет коэффициент формы (0.94), λ обозначает длину волны рентгеновского излучения, равную 1,5421 Å, а β и θ относятся к полной ширине на полувысоте в радианах и углу Брэгга, соответственно. Для определения связанных функциональных групп на НЧ с блокирующими и восстанавливающими агентами в экстракте в результате были выполнены FTIR и HPLC. Стабильность дисперсии частиц исследовали визуально в дистиллированной воде с различным pH в зависимости от времени хранения. Морфологические признаки были исследованы с помощью SEM. DLS биогенных ZnO-NP проводили для определения дзета-потенциала и распределения по размерам.РАМАН-спектроскопия биогенных ZnO-NP была выполнена в спектральном диапазоне от 200 до 700 см ^–1 для обнаружения колебательных мод НЧ, а спектры ФЛ при комнатной температуре были определены в спектральном диапазоне от 500 до 900 нм.

Антибактериальный анализ

Метод диффузии в лунках агара, как описано в документации, ранее использовался с некоторыми модификациями для оценки in vitro бактерицидного потенциала ZnO-NP против различных бактериальных штаммов (Thatoi et al., 2016). Плотность посева (1 × 10 ⁶ КОЕ / мл) бактериальной культуры была оптимизирована. 50 мкл обновленных культур в питательном бульоне использовали для подготовки газона на чашках с питательным агаром. Каждую лунку осторожно заполняли 10 мкл исследуемого образца. Соответственно, засеянные чашки были помечены. Цефиксим и рокситромицин (стандартные антибиотики) и ДМСО действовали как положительный и отрицательный контроль соответственно. После инкубации в течение 24 ч при 37 ° C каждую лунку, загруженную тестируемыми образцами и положительно-отрицательным контролем, проверяли на наличие зоны ингибирования (ZOI).Диаметр зон измерялся в мм штангенциркулем Вернье.

Противогрибковый анализ

Метод диффузии в лунках агара (Ahmad et al., 2016) с небольшими модификациями использовался для оценки противогрибковой активности ZnO-NP. Вкратце, стерильную среду SDA разливали в автоклавированные планшеты и отбирали 100 мкл суспензии спор каждого штамма грибов и наносили мазок на затвердевшую среду в чашках Петри. Каждый тестируемый образец (10 мкл) вносили в стерилизованные лунки в чашках с агаром.Засеянные чашки были соответствующим образом промаркированы. ДМСО и клотримазол использовали в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно. Планшеты инкубировали при 28 ° C в течение 24–48 ч для визуализации роста грибов. После инкубации каждый загруженный диск с тестируемыми образцами и контролями проверяли на появление ZOI (зоны ингибирования). Диаметр ZOI измеряли штангенциркулем Вернье с точностью до миллиметра.

Анализ протеинкиназы

Анализ ингибирования фермента протеинкиназы был проведен для проверки способности ингибировать PK противораковых потенциалов биогенных ZnO-NP с небольшими модификациями протокола, разъясненными Fatima et al.(2015). Готовили среду (бульон TSB), автоклавировали при 121 ° C в течение 20 минут и инкубировали в течение 24 часов для подтверждения наличия каких-либо примесей. Оба штамма Streptomyces и автоклавированный бульон TSB хранили в инкубаторе с встряхиванием при 30 ° C в течение 24 часов. За исключением агара, крахмала и карбоната кальция, все остальные ингредиенты добавляли 300 мл дистиллированной воды и постоянно перемешивали мешалкой. Крахмал, карбонат кальция и агар растворяли в 200 мл дистиллированной воды в отдельной колбе. Оба раствора окончательно смешали до конечной концентрации 500 мл.Среду автоклавировали и выливали в автоклавированные чашки Петри в антисептических условиях, чтобы избежать контаминации. Среда сохранялась затвердевшей, и штамм Streptomyces в культуральной жидкости равномерно распределялся по поверхности среды автоклавированными ватными палочками. Для изготовления лунок использовали стерильный буровой станок, а на дно лунок добавляли расплавленную агарозу, чтобы избежать диффузии исследуемых образцов. После этого в каждую лунку добавляли 20 мкл серийно разведенного образца и оставляли неизменным в течение нескольких минут, чтобы избежать агрегации залитого образца в лунках.Сурфактин был оценен как положительный контроль. Чашки Петри были должным образом промаркированы и выдерживались для инкубации при 37 ° C в течение 24–48 часов. С помощью штангенциркуля Vernier зоны ингибирования измеряли в мм через 48 ч соответственно.

Антилейшманиозный анализ

Антилейшманиозный потенциал биогенных ZnO-NP оценивался в сравнении с культурами амастигот и промастигот L. tropica KWh33 (Департамент биотехнологии, BKUC, Пакистан; Ahmad et al., 2015). Среда M199, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки, помогла культивированию лейшманиозных паразитов.Для анализа использовали культуру Leishmania с плотностью 1 × 10 ⁶ клеток / мл. Активность выполняли в 96-луночном планшете с концентрациями от 400 до 25 мкг / мл. ДМСО использовали в качестве холостого опыта, а амфотерицин использовали в качестве положительного контроля. Засеянный 96-луночный планшет с тестируемыми разведениями инкубировали при комнатной температуре в течение 72 часов. OD регистрировали при 540 нм, в то время как все живые культуры подсчитывали с помощью инвертированного микроскопа, и их значения LC ₅₀ рассчитывали с применением программного обеспечения TableCurve.Процент ингибирования был измерен как

% Ингибирования = [1- {AbsorbanceofsampleAbsorbanceofcontrol}] × 100

Биосовместимость наночастиц ZnO с эритроцитами

Биосовместимость ZnO-NP была исследована против свежевыделенных hRBC для оценки биологической безопасности (Matinise et al., 2017). Около 1 мл крови было взято у здоровых людей с информированного согласия. Выделенную кровь перелили в пробирку с ЭДТА для предотвращения свертывания крови. Для выделения эритроцитов кровь центрифугировали при 12000 об / мин в течение 7 мин.После завершения центрифугирования супернатант удаляли, а оставшийся осадок трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). 200 мкл суспензии эритроцитов смешивали с 9,8 мл PBS (pH: 7,2) и осторожно встряхивали для приготовления суспензии PBS – эритроцитов. Различные концентрации НЧ вместе с приготовленной суспензией эритроцитов отбирали в пробирки Эппендорфа и инкубировали в течение 1 ч при 35 ° C. Все реакционные смеси центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 мин после инкубации.200 мкл супернатанта переносили из каждого тестируемого образца в 96-луночный планшет, и регистрировали поглощение для высвобождения гемоглобина при 540 нм (0,5%). Тритон Х-100 использовали в качестве положительного контроля, а ДМСО использовали в качестве отрицательного контроля. Процент гемолиза был рассчитан как

(%) Гемолиз = (образец-отрицательный контроль Положительный контроль-Отрицательный контроль) × 100

Результаты и обсуждение

Синтез и анализ ВЭЖХ зеленых ZnO-NP

В данном исследовании водный экстракт листьев A.pubiflora использовали в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента для синтеза многофункциональных ZnO-NP. Насколько нам известно, это первое исследование по синтезу металлических наночастиц, опосредованному A. publiflora . Род Aquilegia принадлежит к семейству Ranunculaceae, которое насчитывает более 60 видов растений, которые используются в нескольких лечебных целях по всему миру, в основном в Южной Азии. Виды богаты важными с медицинской точки зрения фитохимическими веществами, включая аквилегиолид, апигенин, β-ситостерин, берберин, кофейную кислоту, генкванин, глохидионолактон А, феруловую кислоту, магнофлор, p -куаровую кислоту и резорциловую кислоту (Bylka et al., 2002; Ю. и др., 2007; Mushtaq et al., 2016). Эти фитохимические вещества, включая фенолы и флавоноиды, могли сыграть важную роль в синтезе стабильных наночастиц. Для определения и количественной оценки конкретных фитохимических веществ, ответственных за уменьшение и успешное укупоривание, была проведена ВЭЖХ. В общей сложности восемь соединений, включая четыре флавоноида (витексин, изовитексин, ориентин и изоориентин) и четыре производных гидроксикоричной кислоты (синаповая кислота, хлорогеновая кислота, феруловая кислота и p -куаровая кислота), были обнаружены и количественно определены для обоих водных экстрактов листьев. и синтезировали ZnO-NP, как показано на рисунке 1.Флавоноиды и гидроксикоричные кислоты – это фенольные соединения, вырабатываемые по пути шикимовой кислоты и отвечающие за выполнение различных биологических функций растений (Nazir et al., 2019; Santos-Sánchez et al., 2019; Usman et al., 2020). Результаты ВЭЖХ (таблица 1) указывают на присутствие более высоких концентраций как флавоноидов, так и производных гидроксикоричной кислоты в экстракте листьев по сравнению с ZnO-NP (таблица 2). Среди обнаруженных флавоноидов оритинн присутствует в более высоких концентрациях как для экстракта листьев, так и для ZnO-NP (707.56 мкг / г DW и 45,59 мкг / г DW соответственно), в то время как хлорогеновая кислота оказалась в большом количестве гидроксикоричной кислотой как для экстракта листьев (1,70 мкг / г DW), так и для ZnO-NP (0,129 мкг / г DW) по сравнению с другими производные гидроксикоричной кислоты. Ориентин и хлорогеновая кислота защищают растение от стрессовых условий и выполняют различные биологические действия, такие как антиоксидантное, противовоспалительное, противодиабетическое, противогрибковое, антибактериальное, гепатопротекторное и противоопухолевое действие (Lam et al., 2016; Naveed et al., 2018). Присутствие флавоноидов и производных гидроксикоричной кислоты на поверхности наночастиц подтверждается результатами наших предыдущих отчетов (Jan et al., 2020; Shah et al., 2020). Считается, что эти активные соединения растений участвуют в блокировании ZnO-NP, как показано на рисунке 2. После последующих стадий промывки, сушки, измельчения и прокаливания был получен белый порошок ZnO-NP. Собранный мелкодисперсный порошок хранили в герметичном стеклянном сосуде, маркированном как ZnO-NP, и хранили при комнатной температуре для физико-химических, морфологических характеристик и биологических применений.

Рисунок 1. Биоактивные соединения с успешным кэппированием ZnO-NP по данным ВЭЖХ.

Таблица 2. Анализ методом ВЭЖХ экстракта листьев A. publiflora и биосинтезированных ZnO-NP.

Рисунок 2. Механический подход к синтезу ZnO-NP через активные соединения растений.

Физико-химические и морфологические характеристики

XRD (рентгеноструктурный) анализ

Идентификация фаз, структура и чистота биосинтезированных ZnO-NP были исследованы с помощью XRD.Рентгенограмма (рис. 3А) подтвердила чистую и кристаллическую природу наночастиц с сильными дифракционными пиками, наблюдаемыми при разных значениях 2, т.е. 31,74, 34,34, 36,36, 47,39, 56,31, 62,68, 66,83, 68,23 и 69,47 °, соответствующих разным миллерам. индексы (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (212) и (201) соответственно. Индексация подтверждает стандартную гексагональную структуру вюрцита (файл JCPDF № 00-036-1451) ZnO-NP, о чем ранее сообщалось в других исследованиях (Arakha et al., 2015; Janaki et al., 2015; Виджаякумар и др., 2016; Matinise et al., 2017). Более того, средний размер кристаллитов, рассчитанный по уравнению Шерера, составил 19,58 нм.

Рис. 3. (A) Типичная рентгенограмма ZnO-NP. (B) Типичные FTIR-спектры ZnO-NP.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье была использована для исследования поверхностной адсорбции функциональных групп на биосинтезированных наночастицах.На рисунке 3B показаны типичные FTIR-спектры в спектральном диапазоне 400–4000 см ^–1 . Основные пики поглощения наблюдались в области меньших волновых чисел. Широкая полоса, наблюдаемая при 3100 см ^–1 , соответствует моде валентных колебаний O – H гидроксильных групп (Vijayalakshmi et al., 2016). Интенсивность пика при 1459 см ^-1 показывает растяжение колебаний аминов (–NH) в амидных связях белков (Jamdagni et al., 2018). Интенсивные полосы, наблюдаемые при 1028 см ^–1 и 1384 см ^–1 , представляют собой спирты, фенольные группы и валентные колебания C – N ароматических аминов биомолекул (Huang et al., 2007). Характерная полоса, наблюдаемая при 863 см ^–1 , соответствует валентной связи Zn – O (Taş et al., 2000; Sangeetha et al., 2011). Спектры FTIR подтверждают успешное блокирование биомолекул на поверхности НЧ и, таким образом, обеспечивают стабильность и способность диспергирования ZnO-НЧ в водной среде.

Анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии

Морфологию поверхности и размер частиц зеленого синтезированного ZnO-NP определяли с помощью SEM. На рисунках 4A, B показаны типичные НЧ, полученные с помощью сканирующей электронной микрофотографии.Как видно из микрофотографий, частицы имеют морфологию сферической формы со степенью агрегации. О таких морфологиях сообщалось и в предыдущих исследованиях (Davar et al., 2015; Suresh et al., 2015; Khan et al., 2018). Например, в исследовании о сферических наночастицах сообщалось с использованием водного экстракта листьев трех растений, а именно: Abutilon indicum , Clerodendrum infortunatum и Clerodendrum inerme. Более того, средний размер частиц наночастиц, рассчитанный с помощью программного обеспечения ImageJ, оказался равным 34.23 нм.

Рис. 4. Типичная СЭМ-микрофотография ZnO-NP (A), при 1 мкм и (B), при 200 нм. (C) Наглядное представление исследований дисперсии ZnO-NP при различных значениях pH в зависимости от времени хранения.

Исследования дисперсии

Дисперсия играет жизненно важную роль в определении функциональной активности созданных наночастиц в любой биологической системе (Bihari et al., 2008). Некоторые параметры влияют на диспергирующую способность наночастиц, например, наличие заряженных или незаряженных молекул, адсорбируемых на поверхности частиц, и ионная сила растворителя (Modena et al., 2019). Для исследования диспергирующей способности наночастиц ZnO использовали дистиллированную воду при различных значениях pH. Фиг. 4C иллюстрирует диспергирующую способность ZnO-NP при pH: 2, pH: 7 и pH: 12. Было замечено, что ZnO ​​демонстрирует превосходную диспергируемость при нейтральном pH даже после 24 часов обработки ультразвуком. Позже результаты были дополнены сильно отрицательным значением дзета-потенциала при нейтральном pH, которое количественно определяет стабильную диспергирующую способность наночастиц.

Динамическое рассеяние света

Дзета-потенциал и распределение частиц по размерам исследовали с использованием дзета-классификатора Malvern.Дзета-потенциал ( ζ ) является типичным измерением поверхностного заряда и определяет коллоидную стабильность частиц. Подвески с особенностями | ζ | ≥ 15 мВ обычно относятся к стабильным коллоидам (Modena et al., 2019). Дзета-потенциал синтезированных ZnO-NP в дистиллированной воде был зарегистрирован как -18,4 мВ и, таким образом, может рассматриваться как стабильный коллоидный раствор на рисунках 5A, B. Измерение увеличивает и подтверждает стабильную диспергирующую способность биогенных наночастиц ZnO в дистиллированной воде с pH 7.Отрицательный поверхностный заряд на частицах обусловлен высоким сродством связывания соединений экстракта с ионами металлов, что обеспечивает стабильность дисперсии частиц и предотвращает агрегацию (Vimala et al., 2014). Кроме того, измерения распределения по размерам показали, что средний размер частиц составляет 131 нм с индексом полидисперсности (PDI) 0,340. Как видно из графика, размер частиц полидисперсен и больше по сравнению с измерениями, полученными с помощью SEM. Более крупный размер ZnO-NP, наблюдаемый с помощью DLS, обусловлен склонностью метода к измерению более крупных частиц (даже агрегатов; Modena et al., 2019).

Рисунок 5. (A) Распределение по размерам ZnO-NP и (B) дзета-потенциал ZnO-NP, (C) Типичные спектры комбинационного рассеяния ZnO-NP и (D) и комната температура PL.

Фотолюминесценция и спектры комбинационного рассеяния света

Исследование фотолюминесценции инженерных наноматериалов (ЭНМ) важно, поскольку оно дает важную информацию о качестве синтезированных материалов. На рис. 5D показаны спектры ФЛ ZnO-NP при комнатной температуре.Измерение ФЛ проводилось при длине волны возбуждения от 500 до 900 нм. Характерные пики наблюдались при 510, 552 и 690 нм, что называется эмиссией в состоянии ловушки или глубоким состоянием (Uthirakumar and Hong, 2009). Предполагается, что кислородные вакансии в ZnO существуют в трех зарядовых состояниях: нейтральном, однократно ионизованном и дважды ионизованном. Зеленая эмиссия ZnO-NP связана с наличием кислорода (Raoufi, 2013), связанным с увеличением кислородных вакансий и, следовательно, увеличением эмиссии PL. На рис. 5C показаны спектры комбинационного рассеяния биосинтезированных наночастиц, которые демонстрируют характерные пики при 435 и 572 см ^–1 .О похожих комбинациях комбинационного рассеяния также сообщалось в некоторых предыдущих исследованиях (Diallo et al., 2015).

Биологические приложения

Антибактериальная активность

Патогенные бактерии и грибки вызывают широкий спектр заболеваний как у людей, так и у животных. Обширные исследования и сложный научный подход стали неизбежными для установления новых терапевтических ценностей для преодоления микробной устойчивости и неселективного и бессистемного использования антибиотиков. В ходе исследования была определена антибактериальная активность фито-изготовленных ZnO-NP в отношении пяти патогенных бактерий, включая два грамположительных ( Bacillus subtilis и Staphylococcus epidermidis ) и трех грамотрицательных ( Klebsiella pneumonia , Escherichia coli ). и Pseudomonas aeruginosa ) с использованием метода диффузии в лунке агара, как показано в таблице 3.Пример активности ZnO-NP против S. epidermidis показан на Фигуре 6А. Пять различных концентраций (5, 4, 2, 1 и 0,5 мг / мл) использовали для исследования бактерицидного потенциала составов NP. В целом, все испытанные штаммы показали дозозависимую чувствительность к ZnO-NP, причем наиболее восприимчивыми оказались P. aeruginosa и B. subtilis . Зоны ингибирования, измеренные при 5 мг / мл, составили 10,3 ± 0,19 для P. aeruginosa , 9,5 ± 0,31 для Bacillus subtilis ,8.7 ± 0,18 и 8,7 ± 0,23 для K. pneumonia и E. coli и 7,1 ± 0,24 для S. epidermidis. Большинство механистических моделей антибактериальной активности ZnO-NP основаны на соотношении поверхности к объему, размере и физико-химических свойствах. Хотя антимикробные механизмы металлических наночастиц являются предметом текущих исследований, в литературе было продемонстрировано несколько моделей, объясняющих механизм ингибирования НЧ. Согласно исследованиям, эффект ингибирования роста ZnO-NP является результатом одного или комбинации следующих механизмов: (1) электростатическое взаимодействие между микробной клеточной стенкой и ZnO-NP, приводящее к разрушению клеточной стенки и, таким образом, к нарушению целостности клетки. ; (ii) накопление ZnO-NP и последующее высвобождение Zn ⁺² внутри бактериальной клетки; и (iii) образование активных форм кислорода (ROS; Sirelkhatim et al., 2015; Król et al., 2017). Многочисленные исследования предполагают, что генерация АФК является ключевым механизмом, ответственным за антимикробный потенциал ZnO-NP. АФК приводит к повреждению ДНК, разрушению клеточных мембран и белков и, в конечном итоге, к гибели клеток (Raghupathi et al., 2011). Гидроксильный радикал (ОН-), пероксид водорода (H ₂ O ₂ ) и супероксид-анион (O ^–2 ) являются наиболее распространенными реактивными формами кислорода, обнаруженными в водной суспензии ZnO-NP. Среди них -ОН является наиболее реактивным веществом и реагирует с любым типом биомолекул в живых клетках.Такие биохимические реакции могут привести к рекомбинации двух ионов -ОН с образованием H ₂ O ₂ . Перекись водорода является относительно слабым окислителем, но также может вызывать повреждение клеток. В отличие от -OH и H ₂ O ₂ , супероксид-анион-радикал (O ^–2 ) имеет слабый потенциал проникновения и менее токсичен (Hameed et al., 2015). Эти активные формы кислорода образуются на поверхности ZnO-NP в водной среде. На последующих этапах электроны и дырки на поверхности ZnO-NP взаимодействуют с молекулами воды (H ₂ O) в окружающей среде и образуют OH и H ⁺ .В отдельных реакциях молекулы O ₂ образуют супероксид-анион (O- ² ), который дополнительно дает HO ₂ ⋅ в результате реакции с H ⁺ . Кроме того, реакция между генерированием электронов (HO ₂ ) и H ⁺ дает (H ₂ O ₂ ) молекулы, которые обладают способностью проникать через клеточные мембраны и в конечном итоге повредить или убить клетки бактерий (Xie et al., 2011; Sirelkhatim et al., 2015).

Таблица 3. Антибактериальная активность ZnO-NP в отношении патогенных бактериальных штаммов.

Фигура 6. (A) Пример антибактериальной активности ZnO-NP против S. epidermidis . (B) Пример противогрибковой активности ZnO-NP против A. niger .

Противогрибковая активность

Противогрибковый потенциал наночастиц, опосредованных A. pubiflora , измеряли методом диффузии в лунках агара. Результаты суммированы в Таблице 4, хотя биосинтезированные ZnO-NP были тщательно изучены для антибактериальных операций, однако имеются ограниченные данные относительно его эффективности против спорообразующих грибов.В текущем исследовании ZnO-NP оценивали в отношении пяти штаммов мицелиальных грибов с исходными концентрациями в диапазоне 5000–500 мкг / мл. Пример активности ZnO-NP против A. niger показан на Фигуре 6B. Амфотерицин В и ДМСО применяли в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. В целом все образцы показали дозозависимую противогрибковую активность. Среди протестированных штаммов F. solani , M. racemosus и A. niger показали максимальный ZOI при 5 мг / мл, который был измерен как 13 ± 0.44, 12,7 ± 0,39 и 12,2 ± 0,44 мм соответственно, а самый низкий ZOI был зарегистрирован 5,4 ± 0,24 мм для M. racemosus и 6,1 ± 0,29 мм для A. niger при 500 мкг / мл. Исследования показывают, что разрушение мембраны и образование свободных радикалов считаются наиболее распространенными методами клеточной токсичности, вызванной НЧ. Генерация АФК и взаимодействие наночастиц с гифами и спорами грибов приводят к ингибированию роста грибов (He et al., 2011). О значительной и дозозависимой фунгицидной активности также сообщалось в предыдущих исследованиях (Sharma et al., 2010; Lipovsky et al., 2011), что согласуется с нашим исследованием. Основываясь на значительной антибактериальной и противогрибковой активности, ZnO-NP могут использоваться в качестве эффективного противомикробного материала либо в первозданной форме, либо в комбинации или носителе для антибиотиков.

Таблица 4. Противогрибковая активность CeO ₂ -НЧ против патогенных грибов.

Активность ингибирования протеинкиназы

Протеинкиназа, фермент киназы, играет важную роль в противоопухолевой терапии.Ферменты играют ключевую роль в фосфорилировании серин-треониновых и тирозиновых остатков; эти остатки полезны в определенных регуляторных и контролирующих процессах метаболизма, апоптоза клеток и клеточной пролиферации / дифференцировки. Неконтролируемое фосфорилирование может вызывать и вызывать генетические аномалии, приводящие к онкогенезу. Следовательно, все те продукты, которые обладают способностью сдерживать ферменты PK, могут иметь важное значение в исследованиях рака (Yao et al., 2011). Фосфорилирование PK также играет жизненно важную роль в образовании гиф грибковых штаммов Streptomyces , и тот же принцип применяется для определения активности ингибирования PK.Штамм Streptomyces 85E использовали для исследования лекарственных соединений для исследования ингибирования PK (Waters et al., 2002). Для предварительного противоопухолевого скрининга ZnO-NP в различных концентрациях оценивали на ингибирование PK. ДМСО и сурфактин использовали в качестве отрицательного и положительного контролей соответственно. Подобно антимикробной активности, ZnO-NP также проявляли дозозависимый потенциал в отношении PK, и самый высокий ZOI наблюдался при 5 мг / мл как 17 ± 1,22 мм, тогда как самый низкий ZOI был зарегистрирован как 6.3 ± 1,72 мм при концентрациях 500 мкг / мл, соответственно, как показано на рисунке 7. Такая превосходная активность ZnO-NP является предварительным показателем его противоракового потенциала и может быть рассмотрена для подробных in vitro, и in vivo. противоопухолевое исследование.

Фигура 7. (A) Анализ ингибирования протеинкиназы ZnO-NP. (B) Количественное ингибирование протеинкиназы (в мм) ZnO-NP.

Антилейшманиозный анализ

Лейшманиоз – тропическое и субтропическое заболевание с ежегодной заболеваемостью 1.От 5 до 2 миллионов случаев во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), болезнь эндемична в 89 странах и приводит к 70 000 смертей ежегодно. Заболевание вызывается внутриклеточным паразитом и передается человеку при укусе песчаной мухи (флеботомия и луцомия). Из-за неподходящего переносчика и неэффективных и доступных лекарств болезнь подвержена высокому риску неконтролируемого распространения. В последнее время методы лечения на основе наночастиц оксидов металлов (оксидов цинка, серебра, титана и магния) приобрели популярность из-за их значительного цитотоксического потенциала против Leishmania (Jebali and Kazemi, 2013).Однако биосинтезированные ZnO-NP редко исследовались на предмет их цитотоксичности в отношении паразита Leishmania tropica (KWh33). В текущем исследовании ZnO-NP в диапазоне 12,5–400 мкг / мл были исследованы с помощью цитотоксического анализа МТТ в отношении аксенических культур промастигот и амастигот L. tropica (рис. 8). Было обнаружено, что составы ZnO-NP обладают дозозависимой летальностью со значительной смертностью 85% ± 2,7 и 81% ± 3,1 при 400 мкг / мл против паразита в форме промастигот и амастигот, причем его морфологическая форма имеет округлую форму у человека-хозяина.Наименьшая наблюдаемая смертность составила 26,43% ± 2,4 и 29,07% ± 2,9 при испытанной концентрации 12,5 мкг / мл. Значения IC ₅₀ были рассчитаны как 48 мкг / мл для промастиготы и 51 мкг / мл для амастиготы. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями и, таким образом, подчеркивают футуристические возможности ZnO-NP в антилейшманиозной терапии.

Рис. 8. Anti-leishmanial assay: Смертность (в%) паразитов амастигот и промастигот.

Исследования биосовместимости ZnO-NP

Биосовместимость ENM является ключевым требованием для их многогранных биомедицинских приложений.Чтобы оценить биобезопасность, ZnO-NP исследовали на их совместимость с hRBC. В эксперименте свежевыделенные препараты hRBC и NP совместно инкубировали в PBS, имитирующем внеклеточную среду (Evans et al., 2013). Анализ основан на высвобождении гемоглобина из красных кровяных телец (эритроцитов), которое может быть вызвано исследуемым образцом, если он способен разрушать эритроциты. Затем лизис эритроцитов определяют количественно путем измерения высвобождения гемоглобина в среде спектрофотометрическим методом (405 нм; Amin and Dannenfelser, 2006).НЧ проверяли на гемолитическую активность при концентрации 400 мкг / мл, как показано в таблице 5. Как правило, любой гемолиз ≥ 25% считается гемолитическим, а гемолиз ≤ 10% считается негемолитическим. В текущем исследовании ZnO-NP продемонстрировали замечательную гемосовместимость даже при наивысшей протестированной концентрации. Таким образом, в исследовании делается вывод, что ZnO-NP A. pubiflora обладают высокой биосовместимостью и могут использоваться для различных биомедицинских приложений.

Таблица 5. % Гемолитический анализ A.pubiflora синтезировали ZnO-NP.

Заключение

Недавняя исследовательская работа сосредоточена на биоаугментном синтезе ZnO-NP с использованием водного экстракта важного с медицинской точки зрения A. pubiflora . Кристаллическая природа синтезированных НЧ подтверждена рентгеноструктурным анализом. ВЭЖХ и FTIR-анализ подтвердили присутствие фитохимических веществ, участвующих во время преобразования металлических ионов в наночастицы. Морфология и колебательные моды определялись с помощью SEM и RAMAN-спектров, а поверхностный заряд и стабильность определялись с помощью DLS.Синтезированные ZnO-NP проявили эффективную антимикробную (антибактериальную и противогрибковую) и противопаразитарную (антилейшманиозную) активность. Биоинженерные ZnO-NP также продемонстрировали эффективный ингибирующий потенциал против микробных ПК. Также было обнаружено, что синтезированные ZnO-NP биосовместимы с hRBC. Наша экспериментальная работа пришла к выводу, что вышеупомянутые ZnO-NP имеют большой потенциал для различных косметических или медицинских применений в качестве биосовместимых противомикробных и противопаразитарных агентов. Однако необходимо провести дальнейшие исследования ZnO-NP для использования его биомедицинского потенциала на уровнях in vitro, и in vivo, .