Решетки на окна из профильной трубы фото: Металлические решетки на окна из трубы: цены, фото наших работ

alexxlab | 16.08.1974 | 0 | Разное

Содержание

Металлические решетки на окна из трубы: цены, фото наших работ

Как правило, решетки для окон изготавливаются из металлических прутьев или пластинок. Но есть и другие варианты для создания защитных ограждений. Например, в качестве основы применяется профильная металлическая труба с квадратным сечением. Пустотелый металлопрокат прекрасно подходит для изготовления оконных решеток.

Профильная металлическая труба прочная, не деформируется, надежная и долговечная – это те характеристики, которые требуются для создания надежного защитного барьера. Благодаря квадратному сечению труба прекрасно справляется с поперечными нагрузками. При этом размер сечения может варьироваться. Обычно рама имеет большее сечение, чем остальные элементы. Что касается функционала, то решетки также могут быть распашными глухими, раздвижными, выпуклыми.

Преимущества решеток из профильной трубы

  • Надежность. Конструкции из профильной трубы практически невозможно взломать. Они имеют огромный запас прочности и способны выдержать применяемую к ним силу. Сломать или перепилить невероятно сложно. Для еще больше прочности используются ребра жесткости.
  • Стильный дизайн и большой ассортимент. Профтруба прекрасно гнется, поэтому можно создать даже сложный дизайн, сделать интересную необычную форму. Подберите вариант, который подчеркнет красоту окна и фасада. Создать решетку можно в любом стиле от классики до хайтека.
  • Легкость конструкции. Решетка из профильной трубы менее громоздкая и тяжелая. Не утяжеляет перекрытие или проем.
  • Долговечность. Профильной трубе не страшны погодные аномалии, уф-лучи. Решетка из профильной трубы не заржавеет и прослужит вплоть до 50 лет. Особенно хорошо, если она окрашена порошковым способом.
  • Легкость установки. Решетка устанавливается быстро и просто. Однако для гарантии защиты это должен делать опытный монтажник.

Чтобы узнать подробнее, получить ответы на вопросы, выбрать решетку на окно и вызывать замерщика, свяжитесь с нашим менеджером.

Решетки на окна металлические. Изготовление и установка кованых решеток на окна

Решетки на окна - это всегда очень надежно и красиво. При выборе изделий большее внимание уделяют женщины. Казалось бы, техническая деталь должна интересовать больше мужчин. Но ничего странного в этом нет, просто женщины больше внимания уделяют уюту. Согласитесь, приятней, когда решетки на окнах имеют художественный облик. А так же немаловажно, чтобы решетки для окон были крепкими, сохраняя ваше жилище в неприступности. Но не меньше они должны и украшать дом.

Всем приятен дворцовый стиль в архитектуре, когда колонны поддерживают балкон, огражденный художественными перилами, где между прутьями выглядывают живые цветы. Тот же стиль переходит и на решетки на окна.

Технические характеристики металлических решеток

Характеристики решеток на окна одинаковы для всей нашей продукции, с которыми вы можете ознакомиться в разделах ворота распашные металлические и заборы для дачи металлические.

Металлические решетки для окон

Металлические решетки для окон производятся из профильной трубы сечением 15 мм, а так же с применением кованой фурнитуры производства Италии. Все модели железных решеток на окна и их чертежи стандартные, но возможно производство по вашим индивидуальным размерам. В данном случае вам всего лишь необходимо оформить заявку в форме, расположенной в разделе контакты с указанием точного размера металлической решетки на окна. Или связаться с нами по одному из указанных телефонов. Наши менеджеры в кратчайший срок просчитают заказ вашей решетки на окно и согласуют время доставки.

Установка решеток на окна

Установка решеток на окна производится квалифицированными специалистами, но вы можете осуществить ее самостоятельно. Для этого необходимо лишь иметь соответствующий инструмент. Остается лишь добавить, что вес квадратного метра готовых конструкций при установке решеткив средних моделях составляет в среднем от 8 до 15 кг.

Изготовление решеток для окон

Изготовление решеток на окна на заказ по вашим размерам осуществляется в течении 7 дней. Если вы желаете приобрести стандартную модель, имеющуюся на складе, то доставка будет осуществлена в течение нескольких дней. Если вы желаете приобрести изделие неокрашенное, время его изготовления сократиться на два дня.

Кованые решетки на окна

Решетки на окна кованные, как и вся наша продукция, производятся так называемым методом холодной ковки. Профильная труба – это основной материал. Свою художественную форму она получает в процессе холодного сгибания на специальном оборудовании. Так же в производстве кованых решеток на окна применяется фурнитура итальянских мастеров кузнечного дела, произведенная в Италии.

Декоративные решетки на окна

Решетки на окна своими руками: технология изготовления в домашних условиях

Решетки на окна своими руками: заготовки
Железные решетки на окна своими руками: сборка

Вы когда-нибудь задумывались над вопросом, как изготавливаются кованые решетки для окон? Большинство людей даже не предполагают, что заказывая изготовление данных изделий, они просто оплачивают их сборку по индивидуальным размерам – наивно будет полагать, что решетки данного типа куют на предприятии.

Их просто собирают из отдельных элементов, которые можно приобрести практически в любом крупном строительном магазине. А что мешает вам сделать это изделие своими руками? Технология довольно простая, и если вы умеете пользоваться сварочным аппаратом (что совсем не сложно), то эта работа покажется вам довольно увлекательной.

Именно об этом мы и поговорим в данной статье, в которой вместе с сайтом stroisovety.org подробно разберемся с технологией решения вопроса, как сделать решетки на окна своими руками?

Как изготовить решетки на окна фото

Решетки на окна своими руками: заготовки

Приступая к самостоятельному решению вопроса, как изготовить решетки на окна, первое, что нужно сделать, это тщательно продумать их рисунок – от этого зависит то, какие кованые элементы и в каком количестве нужно будет приобрести. Кстати, о кованых элементах – они обойдутся гораздо дешевле, если вы закажите их в сети интернет.

Разница в стоимости раза в три или даже четыре. Кроме кованых элементов, также понадобится металлический прут квадратного сечения – подойдет 10мм или 12. Все зависит от того, насколько вы хотите обезопасить свое жилище и, естественно, размеров решеток – если площадь оконных проемов большая, то лучше использовать прут сечением 12 на 12 мм.

Это что касается материалов.

Теперь непосредственно о самой заготовке. Нужен прут, который для придания красивых и ажурных форм решетке нужно будет гнуть и даже скручивать в спираль.

Для этого придется изготовить некоторое подобие примитивного станка – для него понадобится труба диаметром 100 или более миллиметров и трубка квадратного сечения, внутренний размер которой должен совпадать с размером квадратного прутка.

В целом, этот станок представляет собой вертикально закрепленную на бетонной поверхности трубу, к которой приварена трубка и на которой сделан зацеп для изгибания прута. В общем, система очень простая, на фото все видно, и грамотному человеку понять принцип ее работы не составит никакого труда.

Решетки на пластиковые окна своими руками фото

Сгибать прут полукругом достаточно просто – вы вставляете его в зацеп и просто гнете руками до определенного момента (пока не получите плавный угол, составляющий 90 градусов). Здесь имеется один нюанс – для себя нужно заметить установочное положение прута в станке. Именно от этого положения зависит четкость размера изогнутого конца. В принципе, его можно потому обрезать, но зачем это делать, если одинаковую заготовку можно сделать и без лишних телодвижений?

Как самому сделать решетки на окна фото

Следующий момент, который нужно понять, решая вопрос, как самому сделать решетки на окна, это изготовление спирали, в которую скручивают прут для придания решеткам интересного вида. Скручивается он довольно легко – для этого нужен будет вороток длиной около метра – по его центру также приваривается тонкая трубка, в которую вставляется прут.

Техника свинчивания тоже, можно сказать, элементарная – вставляете прут в трубку на станке (вставляете так, чтобы оставшегося не скрученным куска хватило на загиб полукруга), на другой край надеваете вороток и просто крутите его. Прут будет немного гнуться, так что после свинчивания его нужно будет слегка выровнять.

Длину скручиваемой части можно регулировать, передвигая вороток по нему и вставляя глубже или меньше в трубку на станке.

Монтаж решеток на окна своими руками фото

В принципе, это все нюансы подготовительных работ. С порезкой прутка в нужный размер, думаю, вы разберетесь самостоятельно.

Железные решетки на окна своими руками: сборка

С подготовительными работами вроде разобрались, теперь дело за сборкой, так сказать, непосредственным решением вопроса изготовления решеток на окна своими руками. Весь этот процесс можно представить в виде следующей последовательности работ.

  1. Рамка. Здесь все достаточно просто, и тонкостей не много. Во-первых, сваривая рамку решетки, особое внимание нужно уделить ее размерам – решетка должна в аккурат войти в проем, оставляя между собой и откосами расстояние не более 10мм. Этот момент придется рассчитать. Во-вторых, четкость углов – для начальной сборки можно использовать стандартный строительный угольник, но перед тем как рамку капитально обваривать, нужно будет дополнительно проверить диагонали. Они должны быть равными – если нет, то раму придется немного подправить руками и добиться того, чтобы две ее диагонали равнялись друг другу. В принципе, все.

    Решетки на окна своими руками фото

  2. Установка вертикальных прутков. Здесь тоже все достаточно просто. Для начала устанавливаются и привариваются на небольших прихватках крайние прутья, вслед за ними монтируется средний прут, потом обе части делятся на равные промежутки и монтируются все остальные прутья. В принципе, расстояние между соседними элементами решетки можно рассчитать и разметить сразу – возможно, кому-то такое решение вопроса, как изготавливается металлическая решетка на окно своими руками, покажется проще.
  3. Дальше кидаем пару горизонталей – они нужны для того, чтобы воспрепятствовать раздвиганию прутьев решетки. Если изделие будет изобиловать коваными декорами, то их можно и не делать – в такой ситуации следует грамотно распределить эти самые декоры так, чтобы решетку невозможно было разогнуть.

    Металлическая решетка на окно своими руками фото

  4. Теперь декор. Его можно выбрать на свое усмотрение – неважно, какие завитки или листики вы будете приваривать в качестве украшения оконной решетки, принцип их установки остается одинаковым во всех случаях. Лучшим вашим помощником в этот момент станет рулетка – никаких уровней и тем более ниток использовать не нужно. Установили один элемент, засекли его местоположение рулеткой от верха решетки и точно так же приварили все остальные. В общем, работа творческая и подойти к ней нужно соответственно. На счет корзинок (скрученных в спираль изделий), они смотрятся великолепно, но врезать их нужно уже по месту, когда пруткам задано окончательное положение и направление – вы просто вырезаете кусок прутка в соответствии с длиной корзинки и ввариваете туда декор.
  5. В завершение сварочных работ нужно будет произвести некоторое усиление решетки – в частности, соединить небольшими перемычками раму с крайними вертикальными прутками. И еще нужно будет наварить элементы крепления – в принципе, можно обойтись и без них, но у меня откосы пенопластовые, и я решил не рисковать со сваркой, а привинтить решетки анкерами. Поэтому дополнительно пришлось приобрести мощные шайбы и приварить их в семи местах – по три штуки слева и справа и одну сверху.

    Железные решетки на окна фото

  6. Перед тем как приступать к покраске и декорированию решетки, все сварочные соединения нужно зачистить болгаркой, оборудованной специальным зачистным кругом – так сказать, окультурить стыки и придать им человеческий вид.

Предпоследний этап работ, без которого не обойтись в процессе изготовления решетки на металлопластиковые окна своими руками, это покраска. В большинстве случаев для этой цели используется обычная грунтовка по ржавчине черного цвета – как говорится, дешево и сердито, но, тем не менее, весьма эстетично.

Красить прутики – работа нудная, но выполнить ее придется пару раз, не меньше. Дело в том, что некоторые места, особенно зачищенные болгаркой, с первого раза не закрашиваются.

После того как грунтовка высохнет, кованые элементы можно дополнительно декорировать патиной под золото, бронзу или серебро – здесь уже кому как нравится.

Изготовление решеток на окна своими руками фото

И самый последний этап работ, который так или иначе вам придется преодолеть, это монтаж решеток на окна своими руками. В принципе, можно справиться и в одиночку, особенно если вы пойдете моим путем, используя для крепления анкерные болты. В такой ситуации вам просто нужно будет четко разметить точки их установки, просверлить в них отверстия, поставить решетку на место и закрепить анкерами.

В принципе, все! Вот так и делаются решетки на окна своими руками. Кому-то этот процесс может показаться сложным, но лично для меня он был увлекательным занятием.

Автор статьи Александр Куликов

Источник: https://stroisovety.org/reshetki-na-okna-svoimi-rukami/

Решетки на окна своими руками: технология и инструкция :

Каждый, кто заботится о безопасности собственного жилья, скорее всего, задумывается об установке решеток на окна. На сегодняшний день они стали востребованными не только среди жителей первых этажей, но и у тех, кто живет выше.

Ворам под силу проникнуть через окно практически в любую квартиру. Проще всего обратиться за услугами к профессионалам, но это обойдется достаточно дорого, тем более что всегда можно поставить решетки на окна своими руками.

Это на самом деле не так трудно, как может показаться на первый взгляд.

Технология

В данном сегменте рынка представлено огромное количество моделей, которые придутся по вкусу даже самым капризным потребителям. Различные подвиды в основном зависят от стоимости и методов производства.

1. Сваренные решетки являются самым бюджетным вариантом защиты помещения. Раньше такие модели были однотипными и практически не отличались друг от друга. Со временем их ассортимент расширился. Благодаря этой технике можно изготовить изделие любого дизайна, которое будет способно поддержать общий стиль здания. Подобные конструкции отличаются сочетанием правильных форм и полной симметрией.

2. Ковка отличается от предыдущего метода степенью надежности и прочностью конструкции. Такую решетку на окно сделать своими руками сложнее, но все же, при наличии необходимых инструментов, это возможно.

Кованые решетки гарантируют, что такая защита не будет повреждена влиянием погодных условий, и достаточно долго прослужит своим хозяевам. Их ассортимент очень разнообразен, и каждый может выбрать подходящий вариант для себя.

Подобные модели станут изюминкой и украшением для фасада здания, которое не только защищает его, но и придает некоторую изысканность и шарм.

Виды

Эстетическая красота, конечно же, важна, но также весомое значение имеет монтаж изделия. Ведь от того, как именно будет расположена решетка на окна своими руками, зависит безопасность дома и его жителей.

1. Съемные — при их установке используются различного диаметра болты. Такие крепления нельзя назвать сильно надежными, они часто начинают деформироваться практически сразу после монтажа. Чаще всего подобные варианты применяют для обеспечения безопасности магазинов. Это очень удобно, так как днем их можно вообще снять, чтобы они не мешали, а после закрытия снова поставить для сохранности имущества.

2. Стационарные — такие устройства считаются очень надежными и долговечными, а вероятность того, что они деформируются, минимальна, так как они меньше подвержены механическому воздействию.

Конструкция

При установке решеток на окна своими руками, фото которых возможно увидеть далее, требуется определиться со способом их открывания.

1. Распашные — основными элементами тут являются створка и рама, которая крепится в оконный проем, а затем, при помощи специальных петель, в нее устанавливаются дверцы. Благодаря такой системе решетки можно открывать в любое время при необходимости. Защиту от проникновения извне обеспечивает врезной или навесной замок, который монтируется на две створки либо только на раму.

2. Раздвижные решетки на окна своими руками, фото которых представлено в статье, работают по принципу смещения створок в стороны. Для их установки понадобиться закрепленная в проеме рама. Для фиксации чаще всего используется закрывающийся механизм или встроенный замок.

3. Глухие — для их монтажа каркасная рама прочно устанавливается в оконный проем. В такой модели отсутствуют створки, поэтому нет никакой возможности как-либо открыть их. Они считаются небезопасными при возникновении пожарной тревоги, так как в случае аварийной ситуации, воспользоваться таким выходом не получится.

Решетки для детской безопасности

Для сохранности жизни малышей, живущих в квартирах, расположенных в многоэтажных домах, профессионалы рекомендуют устанавливать решетки на пластиковые окна, своими руками сделанные или при содействии фирм-производителей. По составу такая защита похожа на материал профиля данной оконной конструкции.

Отличительными чертами таких сооружений являются следующие характеристики:

  • прутья должны быть с округленными краями без декоративных и острых элементов, которые часто можно увидеть на кованых конструкциях;
  • максимальное расстояние, которое может присутствовать между прутьями, составляет 10 см, так как эта дистанция позволяет обеспечить защиту от проникновения головы ребенка между элементами решетки;
  • такими предохранителями ограждается все пространство оконного проема без исключения.

Еще одним немаловажным преимуществом решеток на окна от детей (своими руками такие конструкции можно собрать без особого труда) считается возможность беспроблемного демонтажа всей конструкции. После того как ребятишки подрастут, защиту можно снять, а место крепления декорируется заглушками из пластика.

Инструменты

Для того чтобы установить решетку на окна своими руками, необходимы следующие приспособления:

  • электросварка;
  • электроболгарка;
  • обычный молоток;
  • дрель, в которой присутствует функция отбоя и набор сверл для работы по камню и металлу.

Материалы

Для дальнейшей работы чаще всего используются следующие профили:

  • прут;
  • квадрат;
  • полосы;
  • комбинированный профиль.

Самой экономически выгодной и легкой в работе считается полоса, ведь она очень просто режется, гнется и закручивается. Но такие решетки на окна своими руками имеют менее прочную конструкцию и нечасто отличаются высокохудожественным и оригинальным оформлением.

Благодаря использованию прутка и металлического квадрата есть возможность изготовить более жесткую решетку. Причем немало умельцев формируют из них настоящие произведения искусства, которые украшают многие здания.

Рамы для решеток монтируются из уголка 35*35-50*50 мм, изредка выполняются с использованием труб или широких полос.

Для более эстетичного вида решетки на окна преимущественно не изготавливают из одного и того же материала, а подбирают несколько различных профилей, что позволяет проявить мастеру творчество и фантазию.

Критерии выбора

Безопасность и удобство эксплуатации защиты зависят от ее конструкции и типа. Оттого к моменту их выбора необходимо отнестись достаточно ответственно. Для того чтобы точно принять правильное решение, можно воспользоваться следующими рекомендациями.

1. Фасад здания должен остаться по-прежнему эстетичным, поэтому установленные решетки на окна своими руками обязаны в него вписаться гармонично и логично.

2. Вес конструкции не должен превышать несущие способности стен, так как может произойти их разрушение или обвал.

3. Толщина арматуры подбирается таким образом, чтобы она не стала серьезным препятствием для поступающего в помещение света, одновременно она должна быть достаточно прочной.

4. Решетки не могут мешать функционалу окон.

5. Монтаж конструкции должен быть относительно простым, при этом система его крепежей требует к себе особого внимания.

Замеры

Для того чтобы установить решетки на окно своими руками без сварки и с ней, необходимо провести подготовительные работы и определиться с размерами защиты. Для этого полностью вымеряется окно, а полученные данные фиксируются на бумаге. Также необходимо учитывать расположение будущей конструкции, ее глубину относительно окна. Решетка может находиться как внутри оконного проема, так и снаружи.

Инструкция для выполнения работы

1. Выбранный материал нарезается по заготовленному эскизу. Когда есть необходимость создать замысловатый рисунок, пруток изгибается, поэтому рекомендуется заранее подготовить шаблон. Для закругленных элементов можно использовать трубу подходящего диаметра.

2. Для сварки также требуется эскиз. Выполнять конструкцию удобнее на ровной плоскости, к примеру, на бетонной площадке или верстаке. Изначально изготавливается каркас и крайние элементы, после чего все прихватывается точечной сваркой.

3. Если для изготовления решеток на окна своими руками не используется каркас, то в месте монтажа замка и петель к прутку необходимо установить металлические уголки или ленты.

4. В откосах окна требуется закрепить штифты. Для этого подготовленные конструкции прикладываются к окну, выравниваются, и далее размечаются места для установки штифтов, учитывая расстояние для монтажа навесных петель.

5. Используя перфоратор, формируются дыры глубиной 10-15 см. В них вбивают из рифленого прутка штифты, так чтобы на поверхности осталось видно лишь несколько сантиметров. При необходимости лишнее можно отрезать болгаркой. Далее на него наваривается уголок либо металлическая лента в виде каркаса будущей защиты.

6. Петли привариваются таким образом, чтобы они направлялись встречно, благодаря этому решетку можно сделать несъемной. Затем в них вставляется подготовленная часть, прикладывается конструкция и приваривается к петлям.

7. Все элементы из металла зачищаются от окалины, покрываются грунтовкой, а после ее полного высыхания — краской, подходящей для изделий из металла.

Методы крепления

Как сварить решетку на окно своими руками, стало понятно, необходимо разобраться, какие существуют способы их монтажа.

1. При помощи сварки — тогда все работы выполняются с использованием отрезков арматуры. Чаще всего достаточно подготовить 6 штырей на одну раму. Если оконный проем высокий, то это число можно увеличить до 8. В откосах формируются отверстия с диаметром 100-103 мм. В раме просверливаются дыры такого же диаметра.

Далее она устанавливается в проем и через подготовленные отверстия в стену вбиваются штифты таким образом, чтобы они выходили за рамки конструкции на несколько сантиметров. Затем все узлы качественно провариваются, а выступающие концы отрезаются болгаркой.

После завершения работ вся конструкция очищается от окалины, грунтуется и смазывается лакокрасочным составом, предусмотренным для работы с металлом.

2. Крепление метизами также не обходится без сварки. Для этого берутся металлические ушки (полосы из 4 мм стали размером 40*50 мм), и в них формируются отверстия. Рама устанавливается на заготовленное место, а через сквозные отверстия в ушках на откосах размечаются точки, которые требуются для рассверловки пазов анкерных креплений. Далее рама снимается, и после этого подготавливаются отверстия. Затем решетка устанавливается заново и фиксируется при помощи анкерных болтов.

Назначение

По этому критерию защиты можно разделить конструкции на три основных вида:

1. Декоративные — они изготавливаются по заранее подготовленному эскизу или чертежу и соответствуют стилю проекта, а также желанию заказчика. Их основная функция больше декоративная, чем обеспечение безопасности.

2. Охранно-декоративные — такие конструкции считаются усиленными, металлические элементы размещаются с меньшим интервалом, а их прочность значительно улучшена. Помимо того, что решетка состоит из простых прутьев основы, они также украшаются различными элементами.

Кованые ажурные оконные решетки поражают своей изящностью и грацией, мастерством и технологией изготовления. Подобные конструкции являются необычными образцами дизайнерского искусства.

Очень часто такая ковка становится отличным дополнением к общему архитектурному стилю здания.

3. Охранные — такие решетки являются очень простыми по дизайну, но, несмотря на это, их устройство считается самым надежным. Образцы таких конструкций можно заметить на складских помещениях, заводах и различных режимных объектах.

Благодаря использованию стальных элементов и замков усиливается их надежность. Изготовить подобные решетки можно и самостоятельно, так как их производство считается элементарным.

Заранее подготавливается эскиз, по которому в дальнейшем формируется качественная защита.

Источник: https://www.syl.ru/article/337912/reshetki-na-okna-svoimi-rukami-tehnologiya-i-instruktsiya

Как сделать решетку на окно своими руками?

Цена на услугу создания оконной решетки достаточно велика, поэтому многие решают собрать решетки на окна своими руками.

Металлические конструкции на окнах давно уже перестали быть исключительно защитным элементам жилища, теперь многие люди думают и том, чтобы внешний вид их фасада выглядел привлекательно и органично.

Это вполне можно сделать: об особенностях процесса вы узнаете в нашей статье, а фото и схемы помогут вам сделать как самую простую, так и более сложную конструкцию для вашей квартиры, дома или дачи.

Простые и раздвижные решетки

Проще всего сделать обычные решетки, в этом случае арматуру устанавливают в проемы окна, а затем на нее закрепляют прутья, которые украшают декоративными коваными деталями: пиками, корзинками или вензелями.

Смотрите на фото, как выглядит подобная конструкция.

При такой конструкции она не будет слишком тяжеловесной, а сможет даже украсить окно и придать ему необычный вид.

Чтобы сделать подобную конструкцию своими руками для дома или дачи, вам понадобятся схемы, чертежи, а из материалов – полосы и прутья из металла.

Перед началом работ нужно измерить окно, и сделать чертежи в соответствии с ним.

Поскольку большинство оконных проемов имеют стандартный размер, вы сможете найти уже готовые схемы, или немного изменить их под свои размеры.

Примеры схем вы можете увидеть на фото. Для того чтобы сделать решетку, прутья нужно согнуть, либо сложить их один на другой и приварить в местах стыка.

Чтобы вся конструкция находилась внутри и не была видна снаружи, вокруг ограждения необходимо создать каркас.

При составлении схемы решетки следите, чтобы она получилась не только нужной по размеру, но также чтобы пустоты в решетке не были слишком объемными – они должны быть такими, чтобы даже маленький и худой человек не смог через них пройти.

Иначе вся защитная необходимость в решетке отпадет, и она сможет выполнять исключительно декоративную функцию.

Таким способом делается самая простая решетка на окна, проследить весь процесс ее изготовления вы можете по видео.

После того, как прутья приварены друг к другу, желательно дополнить конструкцию декоративными элементами – это улучшит ее внешний вид.

Места сварки чаще всего закрываются обжимками, благодаря этому они становятся практически незаметны, и не портят общий внешний вид изделия.

Скорее всего, сделать декоративные элементы самостоятельно не получится, т.к. для этого требуются навыки холодной металлической ковки, а также специализированное оборудование.

Можно оставить решетку и без декоративных элементов, если вам важнее просто защитить жилище или, например, дачу от непрошенных гостей, а не украсить фасад.

В ином же случае лучше заказать изготовление дополнительных элементов, либо решетки целиком у профессионалов.

Сделать раздвижную решетку самостоятельно будет гораздо сложнее, но тоже возможно.

Некоторые этапы работ будут аналогичны созданию обычной конструкции, главная же сложность в изготовлении такой решетки в том, чтобы изготовить ее механическую часть.

Каждая секция такой решетки должна быть способна не только сложиться, но и при необходимости перемещаться.

Такая защитная установка состоит из двух элементов: рамы и непосредственно решетки. Рама выступает в качестве направляющей, а также каркаса для удерживания конструкции.

Элемент решетки в такой конструкции разбивают на секции, которые соединяются друг с другом, но не ограничивают в движении.

Такие конструкции обязательно оснащены роликовым механизмом, благодаря которому ее можно передвигать.

Чтобы сделать складной механизм решетки, вам понадобятся пластины в количестве двух штук, которые фиксируются между прутьями.

В пластинах просверливаются отверстия с обоих концов и по центру, а затем их соединяют в этих местах с помощью специальных заклепок.

В центральных местах соединения должна быть установлена вертикальная стойка. Ею должны быть оснащены все три механизма. При этом при крепеже пластин они должны быть раздвинуты.

Смотрите на фото вариант устройства раздвижной решетки

 Следующим этапом нужно соединить заклепками крайние пластины. По краям створок предварительно устанавливают подшипники и направляющие, чтобы сделать конструкцию подвижной.

Последним этапом устанавливают замок или другой закрывающий элемент – для этого подойдет даже обычный шпингалет или дверной замок.

Создание такой конструкции непросто, вам понадобятся схемы и фото в работе, а если подобного опыта у вас нет, то лучше остановиться на обычной решетке.

Как установить решетку?

Этап правильной установки конструкции не менее важен, чем ее создание. Сделать это можно двумя способами: присоединить решетку к торцам проема окна, либо наложить ее сверху на проем.

Для кирпичных и бетонных строений перед установкой конструкции требуется установить в оконный проем несколько металлических штырей.

При этом в установленном виде они должны выступать за проем на несколько см. Решетку нужно фиксировать на концы установленных штырей.

Если строение деревянное, то на окна нужно установить проушины.

В них есть специальные отверстия, через которые можно зафиксировать решетку на торцы окна с помощью шурупов.

В дачных или частных домах, сделанных из бруса, можно устанавливать конструкцию внакладку, предварительно сделав для нее отверстия в нужных местах стены.

Для большей прочности решетки, для ее фиксации можно использовать сквозные болты.

Такой способ крепления наиболее приемлем, т.к. считается самым надежным, однако использовать его можно только в домах, где стены достаточно толстые, т.к. тонкие конструкции такой нагрузки просто не выдержат.

Существуют и другие способы установки. Первым делом нужно сделать разметку рамы и отметить места крепления решетки.

Затем в этих местах нужно сделать отверстия (лучше всего использовать для этого перфоратор). На конструкции нужно зафиксировать стержни, устанавливая их снизу вверх.

Теперь нужно приварить решетку. Такой способ фиксации самый надежный – можно не сомневаться, что она отойдет от окна.

Устанавливать таким образом можно как обычную конструкцию, так и раздвижную.

Если ваша раздвижная решетка оснащена петлями, то устанавливать ее нужно осторожно, чтобы они не повредились.

В противном случае открыть и закрыть ее будет невозможно, раздвижная конструкция превратится в обычную стационарную.

Самостоятельно проще всего поставить съемную решетку – ее закрепляют с помощью специальных крючков, однако такой способ подходит только для конструкций с минимальным весом.

Кроме того, надежной защитой она не является, особенно, если речь идет о раздвижной решетке.

Наиболее надежными считаются установленные решетки на окна своими руками, которые будут находиться внутри комнаты, а не снаружи.

Вы можете увидеть, что все официальные учреждения оснащены именно такими видами конструкций.

Вскрыть такой объект гораздо сложнее, но и установить такую решетку самостоятельно будет сложно, поскольку для этого нужно переделать оконные откосы, которые неминуемо будут повреждены в процессе установки.

Все это требует дополнительных финансовых и физических усилий.

Процесс установки решетки можно увидеть на фото.

Финишная отделка

Установленная конструкция обязательно нуждается в дополнительной обработке – как минимум, покраске. А лучше также обработать ее антисептиком, который защитит металл от коррозии.

С помощью краски можно скрыть места сварки, особенно это актуально, если вы отказались от декоративных элементов, которыми можно их скрыть.

Краска также служит защитным покрытием, которое защищает металл от погодного воздействия и влажности, таким образом, продлевая срок эксплуатации конструкции.

На фото можно увидеть вариант оформления решетки.

Для раздвижных конструкций нужно дополнительно установить полозья, с помощью которых она сможет двигаться.

Для раздвижных решеток обязательно оборудование защитным от взлома механизмом, поскольку вскрыть такую конструкцию гораздо проще, чем стационарную.

Полозья также можно визуально скрыть с помощью декоративных элементов, например, цветочных горшков.

Источник: https://rezhemmetall.ru/reshetki-na-okna-svoimi-rukami.html

Как изготовить оконные решетки

Красивые резные ставни, которые раньше были традиционными в русских избах, в наше время все чаще заменяют на надежные и крепкие решетки. Решетки для окон – это больше функциональное решение, нежели дизайнерское. Их основное предназначение – защитить ваш дом от стороннего проникновения и возможного взлома с целью кражи.

Но красивый внешний вид никто не отменял, поэтому оконные решетки являются дизайнерским дополнением общего стиля дома и участка в целом. Они могут быть разных видов и типов, с изысканными коваными элементами, с подставками для цветов, в разных цветовых решениях. Главное, чтобы они надежно выполняли свою охранную функцию.

В нашей статье мы постараемся подробно рассказать о способах изготовления оконных решеток, об их видах, дизайне, объясним, какие решетки раздвижные, а какие глухие, покажем их образцы, вы узнаете, как можно изготовить и сделать монтаж оконных решеток своими руками.

Оконные решетки – ваша безопасность

Вы, конечно же, видели идеальный газон в кино, на аллее, а возможно, и на соседской лужайке. Те, кто хоть раз пытался вырастить зеленую площадку у себя на участке, без сомнений скажут, что это огромный труд. Газон требует тщательной посадки, ухода, удобрения, полива. Однако так думают только неопытные садоводы, профессионалы давно знают про инновационное средство — жидкий газон AquaGrazz.

Читать далее>>

Виды оконных решеток

Поскольку оконные решетки предназначены, в первую очередь, для охраны от несанкционированного доступа, то их чаще всего используют жильцы нижних этажей в многоквартирных домах, офисах предприятий, загородных домах.

Есть целый перечень предприятий и офисных помещений, где наличие решетки на окне является обязательным и предусмотрено Правилами безопасности. К ним относятся:

  • банковские учреждения,
  • кассы предприятий,
  • кабинеты для работы с секретными документами,
  • компьютерные отделы и классы,
  • ювелирные магазины

и целый ряд других объектов, где конструкция решеток и стальные замки защищают от внешнего проникновения.

Металлические оконные решетки с оригинальным дизайном, могут стать украшением фасада здания (смотрите фото далее), они добавляют в его архитектуру нотку неповторимой уникальности.

Различные чертежи таких решеток на окна, а также их образцы, ажурные или простые, вы можете найти на фото в интернете, заказать в специализированных фирмах или придумать самому. Для этого, необходимо знать, какие виды оконных решеток существуют.

Оконные решетки с оригинальным дизайном

Оконные решетки классифицируют по разным параметрам :

  • способу производства: сварные, кованные;
  • типу открывания: распашные, раздвижные, глухие;
  • типу крепления: стационарные, съемные;
  • по месту крепления: наружные, внутренние;
  • по назначению: декоративные, декоративно-охранные, охранные.

Рассмотрим каждый по отдельности.

Сварные

Оконные решетки сварные изготавливаются с помощью сварки и ковки металла по заранее изготовленным чертежам, где строго определены все размеры и элементы дизайна.

  1. Узоры на решетках создаются с помощью технологии горячей или холодной сварки.
  2. Их изготавливают из: профильной трубы, уголка, круга, арматуры и полосы.
  3. Для этого используют прием полуавтоматической сварки, что в итоге позволяет достичь отличного качества внешних швов изделия.
  4. В наличии у фирмы изготовителя всегда есть готовые образцы изделий. Поэтому вы можете упростить свой выбор, рассмотрев поближе готовые простые или сложные оконные решетки или их чертежи.
  5. Также сварка оконных решеток применяется при их сборке.

Но стоит отметить, что конструкция сварной решетки уступает по надежности кованной. Таким решеткам рекомендуется покраска.

Кованые

До конца XIX-го века технологии сварки как таковой не существовало, поэтому была популярна ковка, оконные решетки делали вручную. Мастерство кузнеца способно превратить метал в тонкое кружево, цветы, виноградную лозу.

  1. Кованые оконные решетки стали образцом искусства, поэтому они значительно превосходят по цене те, что сделаны с помощью сварки.
  2. Заказать кованую решетку можно любого дизайна, но это скажется на стоимости данного изделия.
  3. По желанию может быть осуществлена покраска изделия «под старину».

Ажурные кованые решетки (фото далее) только на первый взгляд кажутся хрупкими. На самом деле ковка таких решеток делает их необычайно прочными конструкциями.

Часто эти два способа производства (ковка оконной решетки и сварка) совмещают между собой.

Стационарные

Оконные решетки крепятся в оконный проем «наглухо», снять их быстро и без специального инструмента невозможно.

Такое крепление самое надежное по охранным качествам, но становится очень опасным в непредвиденных ситуациях, например, при пожаре.

Ажурные кованые решетки

Поэтому хотя бы одна из защитных решеток в помещении должна быть съемной.

Съемные

Оконные решетки крепятся к стене болтами, которые, в случае необходимости, можно отвинтить и снять решетку.

Но это все равно занимает определенное время и создает неудобства, поэтому во многих случаях в оконных решетках предусмотрена возможность их открывания.

Раздвижные

Оконные решетки (на фото) используются редко в жилых домах, поскольку они монтируются с внутренней стороны окна и открываются всего на 80 % от ширины проема, чаще всего они используются в магазинах, офисных и складских помещениях.

  1. Раздвижные решетки (в основном стальные) простые по своей конструкции, они состоят из вертикальных прутьев, которые соединены между собой подвижными элементами в форме «Х».
  2. Они могут сдвигаться в одну или разные стороны, в раскрытом виде раздвижные решетки почти незаметны.
  3. Также плюсом является тот факт, что раздвижные решетки не затрудняют уход за окнами: вы легко сможете снять стальные замки с решетки и помыть окно.

Крепление их производится непосредственно к стене.

Распашные

Распашные оконные решетки (на фото) состоят из нескольких ставен и закрываются в месте соединения на замки. Они надежные, удобные и при необходимости их легко открыть.

Раздвижные оконные решетки

Глухие

Название говорит само за себя – они не открываются, как раздвижные, и их применяют в основном в складских помещениях.

Место крепления

Оконные решетки крепятся или снаружи оконного проема (самое популярное и оптимальное крепление), или с его внутренней стороны.

Декоративные

Они выполняются по дизайну и чертежам, соответственно стиля проекта и пожелания заказчика. Функционально они служат больше украшением, чем охранным элементом.

Охранно-декоративные

В охранно-декоративных решетках конструкция уже усилена, металлические элементы размещены с меньшим интервалом, их прочность увеличена (на фото).

Помимо того что они содержат простые прутья, как основу, они украшены декоративными элементами.

Ажурные кованые оконные решетки поражают грацией и изящностью своих кружев, технологии и мастерство современных кузнецов превращает их в необычные образцы дизайнерского искусства. Довольно часто ковка оконной решетки становится дополнением к общему стилю архитектуры здания.

Охранные

Оконные решетки, самые простые по дизайну, но вместе с тем, их конструкция самая надежная.

  1. Образцы таких решеток вы можете увидеть на окнах заводов, складских помещений, режимных объектов.
  2. Стальные элементы и замки усиливают их надежность.
  3. Очень часто производится их покраска в общий тон окна или здания.

Изготовление оконных решеток вы можете заказать в специализированных фирмах, предварительно посмотрев образцы готовых изделий, чертежи и эскизы возможных вариантов, сделать дизайн по своему проекту. Независимо от того, будет ли это ковка оконной решетки или сварка, простые или декоративные, вам всегда предложат самое оптимальное решение.

Охранно-декоративные решетки

Делаем решетку на окно своими руками

Образцы готовых оконных решеток вы легко найдете и на домах, мимо которых вы проходите каждый день, и на фото, и в журналах или интернете.

Чертежи и эскизы

Чтобы сделать оконную решетку своими руками, вам первым делом необходимо сделать точные измерения ваших окон, потом сделать чертежи и эскизы декоративных элементов (на фото).

Но при этом необходимо помнить, что конструкция решетки на окнах должна быть такая, чтобы оставалась возможность эвакуации в случае опасности (например, пожара). Иначе такая защита несет в себе потенциальную опасность для живущих людей в этом здании.

Для частных домов лучше всего подойдут распашные оконные решетки.

Приобретение необходимого материала

Следующим этапом будет приобретение необходимого материала и комплектующих.

Некоторые сложные элементы ковки (цветы, ажурные листья, гроздья винограда и др.), для которых требуются специальные мастерство и технологии, можно приобрести в готовом виде.

Необходимо приобрести также стальные полосы, пруты, расходные материалы для сварки, элементы крепления, замки, стальные уголки, которые нужны для того, чтобы закрепить остальные детали на внешнюю раму конструкции решетки.

Сама конструкция оконной решетки, для изготовления своими руками не так сложна, как может показаться на первый взгляд.

  1. Для того, чтобы соединить детали, обычно используют сварочное оборудование, но иногда для соединения элементов используется так называемое заклепочное крепление.
  2. Еще вам понадобятся инструменты для прорези металла на стальные отдельные заготовки. Отличным вариантом в данном случае может стать угловая шлифовальная машинка. Если толщина профиля небольшая, то можно воспользоваться болгаркой небольшой мощности.
  3. При отсутствии таких инструментов, у вас еще остается вариант использовать слесарную ножовку, но такой вариант требует значительного количества времени и сил.

Обязательно используйте защитную маску и одежду при проведении работ по сварке и сборке оконной решетки своими руками.

Изготовление

Для сварочных работ вам необходимо подготовить ровное негорючее основание.

  1. Стальные листы тут не подойдут, так как есть вероятность прикрепления вашей конструкции к нему. Хорошим вариантом в таком случае станет верстак, у которого реечная столешница.
  2. Далее, основываясь на эскизе и чертежах, вам необходимо раскроить стальные детали. Сортировка полученных деталей по форме и размеру значительно ускорит и упросит работу по сборке.

Эскизы оконных решеток

Распашные решетки имеют в основе рамную конструкцию, которая сделана из уголкового профиля. Именно на ней будет проводиться крепление деталей рисунка с эскиза, и не забудьте добавить навески под замки.

Установка

Установка оконных решеток проводится в проем окна по его периметру, при этом используют стальные штыри. Если дом кирпичный, необходимо для начала просверлить отверстия для дальнейшего крепежа конструкции.

Распашные решетки, созданные своими руками, не только надежны, но и эстетично красивы.

Покраска решетки на окне делается по вашему желанию.

Как сделать кованную оконную решетку своими руками, вы узнаете из видео.

Источник: https://Rozarii.ru/dekorativnye-elementy/okonnye-reshetki.html

Кованые решетки на окна

Чтобы оградить свое жилье от так называемого незаконного проникновения посторонних лиц, многие пользуются простым, но достаточно эффективным методом защиты – устанавливают на окна решетки, в частности кованые, как более декоративные.

Металлические кованые решетки

Приняв решение об установке на окна кованых решеток, следует учесть несколько немаловажных нюансов. Прежде всего, кованые оконные решетки должны поддерживать общую стилистику оформления того или иного здания – сочетаться по рисунку (или хотя бы по отдельным основным элементам) с рисунком забора и ворот, если таковые имеются, ландшафтными элементами или балконными ограждениями.

Также следует определиться и с тем, какая из разновидностей решеток вам более всего подходит. Это могут быть раздвижные решетки, решетки с открывающимися створками – распашные, съемные, которые устанавливаются в проем окна при помощи болтов и стационарные, характеризующиеся как особо надежные.

По правилам пожарной безопасности не допускается установка на всех окнах одного помещения стационарных решеток – это может помешать быстрой эвакуации людей в случае возникновения пожара. Конечно же, стоит тщательно подойти к выбору цвета решеток, чтобы он гармонировал с цветом здания и при этом удачно подчеркивал бы красоту самого кованого изделия.

И последний, но очень важный момент – не стоит делать самостоятельно замеры под решетки. Чтобы установка решеток не стала напрасной тратой денег, лучше всего обратиться к профессионалам. Тем более, что солидные фирмы предоставляют услуги замерщика бесплатно.

Декоративные кованые решетки

Поскольку кованые решетки выполняют не только защитную функцию, но и также функцию декорирования, то производители данного вида изделий предложат вам огромный выбор различных рисунков решеток с использованием такого же огромного количества декоративных элементов.

Решетки могут быть выполнены с использованием замысловатых фантазийных рисунков или цветочных орнаментов, с анималистическими элементами или же могут быть добавлены декоративные элементы в виде фигурок.

Эффектно и очень благородно выглядят кованые решетки, где некоторые элементы «оттенены» бронзовым, серебряным или даже золотым покрытием.

В качестве исходного материала, применяемого для изготовления кованых решеток, используется металлический квадрат или т.н. пруток.

Для защиты этих конструкций от неблагоприятного воздействия окружающей среды (дождь, снег, град, грязь) используются не только специальные грунтовки, лаки и антикоррозийные покрытия, но и такие более специфические приемы, как хромирование или никелирование.

Это несколько поднимает цену кованых решеток, но зато долговечность и уникальный внешний вид этого декоративного элемента сторицей окупают понесенные затраты.

В последнее время все большей популярностью среди потребителей пользуются и объемные кованые решетки, которые очень удобны в качестве ограждающего элемента, да и защищающего тоже, для балконов или лоджий.

Красивые кованые решетки

Кованые решетки широко применяются также и как декоративный элемент в оформлении внутреннего интерьера помещений. Так, например, великолепно смотрятся кованые решетки в качестве ограждающего элемента камина. В этом случае для изготовления решетки используют специальное огнеупорное железо. Кованые решетки могут также выступать в качестве элементов перил для лестниц в загородных домах или коттеджах, придавая всей конструкции легкости и одновременно надежности.

Источник: https://womanadvice.ru/kovanye-reshetki-na-okna

Декоративные решетки на окна

Красивые резные ставни, которые раньше были традиционными в русских избах, в наше время все чаще заменяют на надежные и крепкие решетки. Решетки для окон – это больше функциональное решение, нежели дизайнерское. Их основное предназначение – защитить ваш дом от стороннего проникновения и возможного взлома с целью кражи.

Но красивый внешний вид никто не отменял, поэтому оконные решетки являются дизайнерским дополнением общего стиля дома и участка в целом. Они могут быть разных видов и типов, с изысканными коваными элементами, с подставками для цветов, в разных цветовых решениях. Главное, чтобы они надежно выполняли свою охранную функцию.

В нашей статье мы постараемся подробно рассказать о способах изготовления оконных решеток, об их видах, дизайне, объясним, какие решетки раздвижные, а какие глухие, покажем их образцы, вы узнаете, как можно изготовить и сделать монтаж оконных решеток своими руками.

Оконные решетки – ваша безопасность

Решетки на окна своими руками

Изначально решетки на окнах стали ставить для того, чтобы защитить свое жилье от непрошеных гостей. Но со временем люди стали обращать свое внимание не только на надежность конструкции, но и на то, сделает ли такая ограда фасад здания более привлекательным.

Простая решетка

Очень часто ограждение на окнах люди воспринимают, как негативное явление, как ограничение своей свободы, поэтому кузнецы придумали несколько видов этой конструкции. Сделать решетки на окна можно и своими руками, для начинающих мастеров есть самый простой вариант: сначала концы арматуры оставить в проемах окна, а далее к ним прикрепить прутья и украсить готовыми коваными изделиями. Это могут быть:

Чтобы изготовить решетку на окна своими руками, вам нужно запастись металлическими полосами или прутьями.

  1. Сделайте замеры окна, на которое будете ставить решетку.
  2. Сделайте чертеж будущей решетки.
  3. Пользуясь чертежом и расчетами, согните прутья или положите их друг на друга и приварите на стыках.
  4. Чтобы прутья не выглядывали наружу, необходимо по периметру ограждения сделать каркас.
  5. Проверьте, чтобы отверстия в решетке не были большими, в нее не должен протиснуться даже очень худой человек, иначе ставить ее — смысла нет.
  6. Простая решетка готова и пришел черед украсить ее коваными изделиями. Места соединения решетки и узоров нужно закрыть специальными обжимками, тогда они будут не заметны на общем фоне и не испортят картинку. Для охраны жилища подойдет и самая простая конструкция, но с украшением решетка превратится в элемент дизайна. Но и стоят такие решетки на порядок дороже обычных.

Если ваш бюджет ограничен, то вам подойдут обычные сварные решетки. Если вы когда-то держали в руках сварочный аппарат, то можете попробовать сделать их самостоятельно. Конструкция у них простая, а держится намного надежнее, чем в кованом варианте, к тому же и дизайн у них может быть разный. Их отличительная особенность заключается в том, что по форме они напоминают геометрические фигуры, и все детали располагаются симметрично. Основными элементами можно назвать:

  1. Дуги, овалы.
  2. Кольца или их части.
  3. Формочки, напоминающие латинскую букву «S».

Благодаря тому, что выглядят они аккуратно, а служат надежно, сварные решетки сегодня лидируют при выборе оконных ограждений. Кстати, как решетка в итоге будет выглядеть, зависит не исключительно от умелых рук мастера, а также от того, из какого материала она сделана. Примеры решеток на окна можно посмотреть на фото.

Раздвижная решетка своими руками

Сложно, но возможно сделать и раздвижную решетку своими руками. Вся сложность заключена в механической части этой конструкции. Отдельные секции не только должны складываться, но и перемещаться.
Конструкция раздвижной решетки состоит из:

  1. Рамы, которая является направляющей для движения решетки и держит на себе всю конструкцию. Вверху и внизу рамы есть пазы, по которым и ездят ролики .
  2. Решетки, которую нужно будет разбить на отдельные секции и подвижно соединить их друг с другом. А сверху и снизу прикрутить роликовый механизм.

Для изготовления решеток на окна необходимо:

  1. Для изготовления складного механизма нужно подготовить две пластины на каждый участок между прутьями.
  2. Сделать на пластинах по два отверстия по краям и одно посередине. Соединить их между собой через отверстия (сначала крест-накрест, а потом и по краям). Делать это нужно при помощи стальных заклепок, потому что пластины должны оставаться подвижными. Таких механизмов должно быть три: сверху, посередине и снизу решетки.
  3. Там, где пластины соединяются с отверстием посередине, нужно приварить вертикальную стойку. Так необходимо сделать сразу с тремя механизмами. Проследите, чтобы они оставались в раздвинутом состоянии во время крепежа элементов.
  4. Прикрепить крайние пластины, когда они в развернутом состоянии к раме при помощи стальных заклепок. Для того чтобы под своим весом створки не перекосились, нужно поставить направляющую, чтобы по ней скользил подшипник, его нужно смонтировать с краю каждой створки.
  5. Установить замок или защелку на усмотрение хозяев. Можно использовать шпингалеты или дверные замки.

Материал для решетки

В качестве материала для сварной решетки могут служить:

  1. Прутья.
  2. Металлический квадрат.
  3. Профиль комбинированный.
  4. Металлические полосы.

В целях экономии можно использовать металлические полосы, но стоит учитывать тот факт, что стоят они дешевле других материалов, но и по качеству и надежности им тоже уступают. Да и высокохудожественными такие изделия сложно назвать.

Из металлического прутка или квадрата можно сделать интересную решетку на окна. Обычно мастера берут квадрат 16х16, а прут диаметром 2 см. Решетки для окон из труб отличаются долговечностью, но все-таки чаще мастера делают из труб рамки, а внутри конструкцию из других материалов.

Как правило, для того, чтобы сделать сварные решетки, берут разные материалы и комбинируют их.

Установка решеток

Монтировать решетку можно двумя вариантами:

  1. В торцы оконного проема.
  2. В накладку на оконный проем.

Если жилище построено из кирпича или бетона, то в проемы окна нужно забить металлические штыри так, чтобы в конце они выступали на пару сантиметров. Готовую решетку нужно прикрепить к концам штырей.

Если здание построено из дерева, то к рамам окна нужно прикрепить проушины, сквозь их отверстия прикрутить шурупами конструкцию к торцам окна. В домиках из клееного бруса установку решетки можно проводить внакладку.

Для этого нужно просверлить отверстия для шурупов по всей стене. А чтобы конструкция держалась прочно, ее нужно посадить на сквозные болты.

Этот самый надежный способ крепления оконных решеток, но он не всегда приемлем, все зависити от того, насколько толсты стены и какой материал использовался для строительства.

Можно поставить ограду и таким способом:

  1. Отметить на оконной раме, где будет крепиться решетка штифтами.
  2. При помощи перфоратора сделать в отмеченных местах углубления. Устанавливать стержни нужно, начиная с низа и постепенно переходя к верху.
  3. Приварить решетку. Это самый надежный способ крепления данной ограды. Приваривать можно, как стационарную решетку, так и распахивающуюся.
  4. Если в решетке есть петли, то старайтесь их не повредить при установке, иначе вы уже не сможете открывать и закрывать данную конструкцию.

После того, как установите решетку, ее обязательно нужно покрасить, таким образом вы скроете места сварки, и у конструкции сразу станет завершенный вид. Также краска оградит металл от разрушающего воздействия природных явлений, особенно от влажности. Так решетка прослужит дольше.

Таким же образом можно прикрепить и раздвижные решетки, но для них еще нужно смонтировать полозья, по которым будет двигаться вся конструкция. Также если решетки раздвижные, то их легче взломать, а значит, нужно предусмотреть защиту от взлома. Полозья можно скрыть за различными декоративными элементами, чаще всего это растения в горшках.

Для самостоятельной установки конструкции есть еще один вариант – это съемные решетки. Они крепятся на специальные крючки, при этом решетка должна быть сама по себе не тяжелой. Но эту конструкцию специалисты не считают надежной, она скорее выполняет декоративную функцию и не станет препятствием для злоумышленника. Также этот тип решеток уместен тогда, когда вам в скором времени предстоит замена окна.

А вот по надежности лидируют решетки, которые устанавливают внутри помещения. К примеру, во всех банках ставят именно такие конструкции. Специалисты считают, что чтобы взломать такую решетку, нужно потратить намного больше времени, чем на ту, что устанавливается снаружи. Но, если таким образом ставить конструкцию у себя дома, то придется переделывать откосы на окнах, потому что существующие при установке будут повреждены.

Бывают такие ситуации, как, например, пожар, когда решетка станет своеобразной ловушкой для хозяев дома. В этом случае могут помочь раздвижные или распашные решетки. Такого рода конструкции можно увидеть на многих общественных зданиях, потому что на установку сплошной решетки разрешения бы пожарная служба не дала бы.

Раздвижные решетки могут открываться на свою ширину практически полностью (на 80%). Если делать такую решетку самостоятельно, обязательно нужно проследить, чтобы замок находился с ее внутренней стороны. Но ключ от этого замка должен храниться в недоступном для детей месте.

Источник: https://stroiremdoma.ru/reshetki-na-okna-svoimi-rukami/

Решетки на окна от детей — надежная защита малышей

Решетки на окна от детейдостаточно актуальное решение, если у вас есть маленькие дети, которые любят выглядывать в окно.

Этот несложный в установке аксессуар сможет не только защитить дом от посторонних, но и не позволит малышам выпасть из окна во время вашего отсутствия. Это же устройство можно применять для защиты окна от кошек и собак.

Альтернативное решение, это применение защитных замков на окна благодаря которым достигается ограничение в открывании. А если все же нужно проветривать помещение постоянно летом то тут помогут только решетки.

Как использовать решетку?

 

На окно можно установить и обычную решетку от грабителей, однако не все хотят этим заниматься, особенно это неактуально, если квартира находится на большой высоте, и попасть в нее через окно преступникам затруднительно и без дополнительной преграды. Несмотря на разные дизайнерские оформления, не все хотят, чтобы такой элемент портил вид из окна. Решетки на окна для детей внешне и конструктивно отличаются от обычных. Главной их особенностью является то, что при необходимости их можно отодвинуть.

Выбор типа устройства зависит от того, какой функционал оно должно выполнять. Некоторые разновидности решеток предназначены исключительно для украшения, другие служат для разграничения пространства и зашиты оконных проемов от детей, некоторые могут стать серьезной защитой от незаконного проникновения в жилище.

Решетки на пластиковые окна могут быть установлены как с внутренней, так и с наружной стороны окна. Это зависит от модели изделия, а также предпочтений владельца помещения. Материалы, применимые для изготовления, могут быть разными. Чаще всего применяются такие виды, как сталь, железо, алюминий. Их рекомендуется красить, так как при контакте с влагой и кислородом многие металлы окисляются, из-за чего появляется ржавчина, исключением является только алюминий и оцинкованная сталь.

Выбирать цвет нужно в соответствии с оформлением фасада или внутреннего убранства помещения, это позволит сделать решетку менее заметной и превратит ее в часть интерьера.

Разновидности конструкций

Решетки на окна от детей чаще всего являются раздвижными. Это красивая, простая в монтаже конструкция, не загромождающая окно целиком. Ее можно сдвинуть в сторону, при этом ребенок открыть окно не сможет.В сложенном виде такая решетка не мешает. Она складывается гармошкой в оконном проеме, некоторые типы конструкций налегают на раму. Устройство можно убирать за комбинированную и основную стену.

Как перемещается решетка?

Решетки на окна для детей удобны функциональностью. Когда они не нужны, их можно убрать в сторону, для этого конструкция складывается гармошкой. Размер можно выбрать любой, поэтому решетка закрывает либо весь оконный проем, либо открывающуюся часть створок.

Если окно очень большое, пользоваться обычной гармошкой будет неудобно. Предлагается использовать такой тип конструкции: средняя часть решетки закрепляется и двигаться не может. К ней прикрепляется две секции, одна из которых гармошкой открывается в левую сторону, а другая в правую.

Решетка-ножницы и принцип ее работы

у или внизу такой конструкции устанавливают ролики, по которым система двигается. При этом ее элементы соединены подвижными элементами, которые двигаются как лезвия ножниц.

Если ваша квартира находится даже на первом этаже, не стоит расслабляться: если у вас есть маленькие дети, малыш может выбраться в окно и выпасть из него. Даже небольшая высота может сказаться плачевно на его здоровье и даже жизни.

Чем высота больше, тем падение опаснее, именно поэтому рекомендуется устанавливать решетки на пластиковые окнакидстоп. Устройство надежно защитит оконный проем, не дав ребенку пробраться к нему.

При этом вы сможете без проблем пользоваться окном, проветривать и открывать его, когда вам это необходимо, беспокоиться за малыша или домашних животных не придется.

Решетки на пластиковые окна-кидстоп

Если вы хотите обезопасить своего ребенка, то нельзя ограничиваться установкой обычной москитной сетки. Сетка крепится на саморезах и при небольшом давлении рвется или вываливается, поэтому часто служит причиной выпадения из окна кошек и детей, так как они думают, что на нее можно опереться. Система кидстоп поможет исключить такие падения.

Детские решетки на окна менее функциональны по сравнению с теми, которые предназначены для защиты жилища, однако они являются менее громоздкими, не портят внешний дизайн окна, легко сдвигаются взрослым, когда это необходимо.

Материалы решетки кидстоп прочные, металлические. Многие изделия окрашены уже с завода, однако при необходимости можно и перекрасить, оформив в нужном вам стиле.

Такое изделие не кажется громоздким, при этом оно достаточно прочное, способно хорошо выдерживать даже высокую нагрузку.

Установка решеток – не самое простое занятие. Важно не только чтобы они обладали нужными функциями, но и чтобы при этом соблюдалась пожарная безопасность, так как нередки случаи, когда при пожаре из-за решетки люди не могут покинуть помещение и погибают.

Защитные решетки на окна кидстоп имеют следующие преимущества:

  • Рама выполнена из стали, прутья вертикальные, расположены близко друг к другу. Устройство хорошо защищает от падения с высоты.
  • Рама крепится в непосредственной близости к откосу, для этого используются стальные кронштейны.
  • При креплении задействован только боковой откос, поэтому не приходится беспокоиться о целостности пластикового окна. Решетка не мешает использованию москитной сетки.
  • Снять ограждение можно довольно быстро.

Способ установки решетки

Зная, как поставить решетку на пластиковое окно, вы сможете либо сделать это самостоятельно, либо проследить за работой фирмы установщика. Начинать любую работу требуется с подготовки места.

Для этого нужно замерить окно, отнять несколько сантиметров от его размера, так как решетка должна быть немного меньше проема окна. Не помешает предусмотреть замок.

При покупке конструкции обратите внимание на то, как часто стоят прутья: чем они дальше друг от друга, тем меньше эффективность и жесткость конструкции.

Монтаж начинается с разметки стены под штифты. Удобнее всего это сделать, просто приладив ограждение к стене, после этого в стене просверливаются отверстия 15 см глубиной, в которые вбивают штифты. Каркас наваривается на них. Петли монтируют по встречной схеме, это поможет зафиксировать решетку, и ее уже нельзя будет снять. После этого конструкция приваривается к петлям. Неровности зачищают, конструкцию чистят, обезжиривают и окрашивают.

Детская решетка поможет обезопасить вашего малыша от падения из окна. Вы сможете спокойно заниматься своими делами, не беспокоясь, что ребенок заберется на подоконник и выпадет.

Если не находите решетку то установите хотя бы предохранительный механизм или замок от открывания детьми.

Источник: http://OknaNaGoda.com/okna/komplektuyushhie/reshetki-na-okna-ot-detey-nadezhna.html

Решетки на окна Санкт-Петербург

Декоративные решетки на окна

Стоимость изготовления от 1000 руб за квадратный метр. В связи с многообразием вариантов рисунков и материалов и различным объемом заказов цена решетки рассчитывается индивидуально для каждого заказа.

Во все времена решетки на окнах выполняют не только защитную функцию, но и эстетическую.

Декоративные решетки прекрасно сочетаются с архитектурным обликом здания.

Большое разнообразие рисунков, эскизов и фото декоративных решеток позволит каждому найти решетку на свой вкус и бюджет.

Не случайно декоративные решетки на окна пользуются большим спросом.

Ваши решетки - отражение Вашего вкуса и фантазии. Поможем подобрать подходящую для Вас оконную решетку. Мастера доставят и установят металлические решетки на окна.

На фото изысканная решетка из прутка с полукольцами для проема неправильной формы. Интересное сочетание цвета решетки и облицовки здания служит хорошим украшением окна.


Решетки распашные защитные

Простая и элегантная распашная решетка - лидер заказов для общественных зданий и учебных заведений.

Решетки на окнах обеспечат защиту Вашего жилища от непрошенных гостей. Решетки на окна незаменимы на первых этажах.

Предлагаем разнообразные решетки на окна: распашные и глухие, из профильной трубы или прутка, с декоративными элементами или минималистические.


Решетки - изготовление

Изготовление решеток на окна производится из профильной трубы различного сечения, прутка, полосы. Для декоративных решеток применяем декоративные элементы.

Металлические решетки распашные или глухие не только защитят вау квартиру или дом от проникновения злоумышленников, но также украсят ваш дом, если правильно подобрать дизайн решетки.

Для изнотовления стандартных оконных решеток используем профильную трубу 20х20 для рамы и пруток10 для заполнения. Для украшения много видов пик и завитков.

На фото интересная решетка из квадратов. Простой узор с неожиданным расположением базовых элементов решетки придает окну неповторимый вид.

Окраска антикоррозионной эмалью УНИКОМ (Hammerite).

Стоимость монтаж решеток на окна составляет 30% от стоимости решетки.

Всегда рады клиентам.


Виды металлических решеток на окна с фото

С каждым годом криминогенная обстановка во многих российских городах ухудшается, а это вынуждает хозяев квартир использовать дополнительные меры защиты. Сегодня большой популярностью пользуются не только металлические двери, но и прочные решетки на окна, фото которых позволяет в полной мере ознакомиться с применяемыми конструкциями.

Решетки подразделяются на несколько видов, которые необходимо рассмотреть более подробно.

Виды конструкций

Металлические решетки на окна могут быть:

  • в зависимости от способа изготовления – сварными и коваными;
  • в зависимости от принципа действия – распашными (одно- и двухстворчатыми), стационарными, запорно-распашными и раздвижными;
  • в зависимости от дизайна – плоскими или выпуклыми.

Сварные приспособления – это самый простой и доступный вариант, относящийся к низкой ценовой категории. Обычно данные конструкции не отличаются декоративностью и предназначены лишь для защиты окон от несанкционированного проникновения. В некоторых случаях для придания более эстетичного внешнего вида решетки могут украшаться дополнительными металлическими элементами.

Хозяева, стремящиеся не только обезопасить жилище, но и сделать его более изысканным, используют эксклюзивные варианты – кованые решетки на окна, узор которых разработан опытными дизайнерами. Так как производство конструкций включает большой объем ручного труда, то и стоимость подобных изделий достаточно высока. Вместе с тем существует вероятность, что вы станете обладателем решетки, изготовленной в единственном экземпляре в соответствии с вашими требованиями.

Нередко  решетки на окна используются для обустройства загородных домов и коттеджей. В данном случае приветствуется соответствие общему стилю, в котором выполняются ограды, ворота, малые архитектурные формы, светильники и декоративные элементы.

С учетом расположения основных конструкционных элементов кованые решетки подразделяются на 3 разновидности:

  • с вертикальным ограждением, переходящим в орнамент или являющимся основой для крепления декоративных деталей;
  • с вертикальным и горизонтальным ограждением, дополненным художественными элементами;
  • с отсутствием линий четкой направленности, где переплетается множество декоративных орнаментов.

Во всех случаях основным отличием кованой решетки от сваренной становится легкость, воздушность и высокая эстетичность.

Частыми составляющими узора кованых решеток на окна, фото которых представлено ниже, становятся растительные мотивы, изображения морских волн, звезд, паутины и много другого. Для повышения декоративных качеств может использоваться патинирование металлических прутьев, то есть их окраска под старину, имитирующая окисление и т. п.

Выбор конструкций в зависимости от способа действия

Основными критериями, определяющими выбор вида решеток на окна, являются степень защиты и безопасность людей, находящихся в помещении. Большое значение имеет возможность эвакуации через окна при пожаре или других чрезвычайных ситуациях. Конструкции стационарного вида полностью исключают такую возможность, хотя считаются наилучшим вариантом защиты от грабителей.

Раздвижные приспособления, передвигающиеся при помощи специальных шарниров, освобождают лишь часть оконного проема. Если окно имеет небольшие размеры, то людям будет достаточно затруднительно покинуть помещение, в то же время мошенникам будет так же сложно проникнуть в него.

В вышеописанных случаях при возникновении пожара, угрожающего жизни, хозяева должны будут избавиться от решеток, сняв их, но делать это в отсутствие инструментов, дыша дымом и токсинами, выделяющимися при горении, выглядит практически невозможным.

Несмотря на то, что распашные решетки на окна выглядят более доступными для воров, они же и наиболее выгодны с точки техники безопасности. Конструкции называются распашными за счет оснащения открывающимися створками, скрепляющимися накладным или навесным замком. Чаще всего используются одно- или двухстворчатые приспособления. Для того чтобы освободить окно, необходимо всего лишь открыть крепления ключом.

В последние годы потребителям предлагаются запорно-распашные устройства, вмонтированные в наружные откосы стены. Крепежом для створок в таких конструкциях является стержень с пружиной. Рычаг от пружины проводится через стену и располагается внутри помещения. Для того чтобы открыть решетку, достаточно снять защитную коробку и повернуть конец рычага. Если требуется закрыть приспособление, рычаг поворачивают в другую сторону.

Последний вид выглядит наиболее удобным в плане безопасности проживающих в доме людей. К тому же конструкция затрудняет доступ к запорному механизму мошенникам.

Дизайн металлических конструкций

Металлические решетки на окна могут иметь различный дизайн. Большую роль при этом играет вид материала, из которого изготавливается конструкция. В современных приспособлениях используются следующие элементы из металла:

  • пруток;
  • квадрат;
  • полосы;
  • комбинированный профиль.

Наибольшая декоративность достигается при использовании прутка или квадрата. И тот и другой материал достаточно надежный, отличается высокими прочностными характеристиками. Сечение прутка, применяемого для изготовления оконных решеток, варьируется от 0,6 до 1,6 см, квадрата – от 1 до 2 см.

Использование полосы не позволяет достичь высокого декоративного эффекта, да и прочностью данный материал значительно уступает всем другим. Но этот вариант отлично подойдет тем людям, которые не готовы потратить значительную часть семейного бюджета на обустройство решеток на окна.

Основы рам производятся из профильной комбинированной трубы сечением 20 или 25 мм.

Форма и дизайн решеток предусматривают использование того либо иного материала. Плоские конструкции обычно изготавливаются из квадрата или прутка и являются двухмерными, то есть расположенными в 2 плоскостях. Цена на такие изделия чуть ниже, чем на объемные (выпуклые) приспособления.

Выпуклые конструкции называются французскими и имеют очень необычный и изящный вид. Также удобство их использования заключается в простом доступе к окну (с наружной стороны его легко мыть или красить). За счет того, что нижний край конструкции значительно отдален от рамы, между решеткой и окном можно поместить ящик для цветов.

При желании защитить окна выпуклыми решетками необходимо обращаться только в проверенные компании, имеющие хорошие отзывы. Изготовление таких конструкций требует немалого умения, особенно если объем будет сочетаться с наличием декоративных элементов или орнамента. Профессиональный дизайнер воздаст проект с учетом не только особенностей оконных проемов, но и пожеланий хозяев.

Выбирая металлические конструкции на окна, необходимо руководствоваться основными критериями:

  • качеством материалов и фурнитуры;
  • толщиной и прочностью сплавов;
  • профессионализмом мастеров;
  • соответствием проекта внешнему облику дома или загородного коттеджа;
  • стоимостью.

При грамотном сочетании всех составляющих оконные решетки станут не только надежной защитой, но и привлекательным элементом декора.

Решетки на окна «Беккер» в Саратове, Энгельсе, области

Решетка А-01

Цена решётки: 2300 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- круг 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-02

Цена решётки: 2350 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-03

Цена решётки: 2450 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-04

Цена решётки: 2550 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-05

Цена решётки: 2700 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-06

Цена решётки: 2950 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-07

Цена решётки: 2700 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-08

Цена решётки: 3000 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-09

Цена решётки: 2800 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-10

Цена решётки: 3450 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-11

Цена решётки: 3600 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Решетка А-12

Цена решётки: 3750 р./м²
Монтаж решётки: 300 р./м²
Смотреть фото
  • Материал- квадрат 10 мм
  • Покраска- алкидный грунт эмаль класса "люкс". 3 цвета (серый, коричневый, черный)
  • Установка на металлический прут или анкера (диаметр 10 мм)
  • Доставка в черте города бесплатная, если общая площадь всех решеток не менее 4 м².
  • Доставка менее 4 м² — 300 р.
  • Доставка за чертой города: смотреть подробности
  • Решетка площадью менее 1 м² и монтаж решётки менее 1 м² считаются за 1 м².

Дополнительные опции

Монтаж (2 этаж) 200 р/м²
Материал квадрат 12 мм 400 р/м²
Покраска порошковая 400 р/м²
Каркас откр. створки (1 створка) 1000 р.
Каркас откр. створки (2 створки) 1500 р.
Замок Гардиан 10.01 (4кл.) 900 р.
Химический анкер 300 р./отверстие
Шпилька (для крепления сквозь стену) 300 р./м.п.
Арка (за изделие) 800 р.
Столб 40×40* 160 р./м.п.
Столб 60×60* 320 р./м.п.
Монтаж столба * 350 р.
* - столбы могут использоваться при устройстве невысоких ограждений, заборчиков.

Фотографии решёток с большим разрешением

Чтобы открыть фотографию в полном размере, нужно:
- первый раз кликнуть по фото,
- второй раз по третьей кнопке слева "Full Size" .

Решетка А-01
Решетка А-02 Решетка А-03
Решетка А-04 Решетка А-06
Решетка А-10 Решетка А-12

Кованые решетки на окна - Екатеринбург, Нижний Тагил

Рассчитать полную стоимость кованых решеток на окна по вашим размерам, вы можете на странице прайс-листа, позвонив по телефону: 8 (343) 455-01-02.

Кованые решетки: изящное обрамление окна

Установка решеток на окна — надежный способ защитить жилье от несанкционированного проникновения. При выборе оформления важно предусмотреть, чтобы решетка не только не портила внешний вид здания, но также служила его украшением. Благодаря сочетанию надежности и эстетической привлекательности кованые оконные решетки пользуются высоким спросом. Они устанавливаются на окна первых этажей зданий, в частных домах и дачах, больницах.

Благодаря универсальности материала решетки из ковки гармонируют с фасадами деревянных, кирпичных зданий, облицованными камнем или плиткой фасадами. Как правило, металлической решетки подбирают в единой стилистике с крыльцом, лестницей, козырьком, балконными ограждениями. Загляните в наш каталог кованых решеток, чтобы выбрать наиболее подходящую по оформлению модель. В данном разделе представлены фото, подробные чертежи и расчетная стоимость кованых изделий.

Виды оконных решеток

Решетки для окон бывают кованые и сварные. Кованые оконные решетки привлекают внимание оригинальными декоративными узорами. Художественная ковка позволяет изготавливать уникальные по форме и дизайну конструкции, которые будут выгодно подчеркивать архитектуру здания. В числе функциональных преимуществ кованой решетки: прочность, долговечность и практичность эксплуатации. Изделия надолго сохраняют привлекательный вид, не требуя при этом сложного ухода. Для защиты от внешних факторов и коррозии кованые элементы покрываются полимерными покрытиями.

Не менее популярны сварные решетки для окон. Такие конструкции отличаются повышенной безопасностью и более доступной стоимостью. Для изготовления сварных решеток применяются готовые эскизы с несложными узорами.

По типу конструкции различают стационарные и съемные решетки. Для частного дома или дачи стоит заказать кованые решетки съемного типа, которые в экстренном случае можно открыть. Также изделия могут иметь раздвижную или распашную конструкцию.В нашей мастерской вы всегда сможете заказать решетки кованые по индивидуальным размерам и эскизам. Изделия могут быть окрашены в любой цвет и декорированы патиной для винтажного эффекта.

Цена на кованые решетки на окна зависят от размера конструкции, сложности декора, технологии изготовления.

Наши кованые решетки на окна купить можно в Екатеринбурге, Нижнем Тагиле, Верхней Салде или заказать в другой город. Заказать красивые кованые решетки на окна вы можете, заполнив форму на сайте или связавшись с нами по телефонам 8 (343) 288-29-73 и 8 (343) 455-01-02.

Манипуляции и количественная оценка целостности решетки микротрубочек

РЕЗЮМЕ

Микротрубочки - это структурные полимеры, которые участвуют в широком спектре клеточных функций. Добавление и потеря субъединиц тубулина позволяет микротрубочке расти и укорачиваться, а также развиваться и восстанавливать дефекты и разрывы в ее цилиндрической решетке. Эти дефекты решетки действуют, чтобы модулировать взаимодействия микротрубочек с молекулярными моторами и другими белками, ассоциированными с микротрубочками. Следовательно, инструменты для контроля и измерения структуры решетки микротрубочек будут неоценимы для развития количественного понимания того, как структурное состояние решетки микротрубочек может регулировать ее взаимодействия с другими белками.В этой работе мы манипулировали целостностью решетки микротрубочек in vitro для создания пулов микротрубочек с общими нуклеотидными состояниями, но с вариациями структурных состояний. Затем мы разработали серию новых полуавтоматических инструментов анализа как для флуоресцентных, так и для электронных микроскопических экспериментов, чтобы количественно оценить тип и серьезность изменений целостности решетки микротрубочек. Эти методы позволят проводить новые исследования, которые исследуют роль структуры решетки микротрубочек во взаимодействиях с белками, ассоциированными с микротрубочками.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Микротрубочка, Таксол, Структура, Решетка, GMPCPP

ВВЕДЕНИЕ

Микротрубочки - длинные полые трубки, которые действуют как важные структурные и сигнальные компоненты внутри клеток. Микротрубочки обычно представляют собой замкнутые трубочки, которые образованы 13 латерально связанными отдельными протофиламентами, каждая из которых состоит из гетеродимеров αβ-тубулина, уложенных друг за другом встык (Zhang et al., 2015; Wang and Nogales, 2005). Однако, в то время как это регулярное, многослойное расположение αβ гетеродимеров микротрубочек широко сохраняется, исследования электронной микроскопии выявили наличие широкого диапазона структур решетки микротрубочек и неоднородностей.Например, исследования с помощью криоэлектронной микроскопии показали, что решетчатые структуры вблизи растущих концов микротрубочек часто характеризуются уплощенными открытыми листами, а не закрытыми трубками (Chrétien et al., 1995; Guesdon et al., 2016). Кроме того, различия в количестве отдельных протофиламентов наблюдались как внутри микротрубочек (Vitre et al., 2008; Doodhi et al., 2016), так и между микротрубочками, которые зарождаются в разных условиях (Vitre et al., 2008; Moores et al., 2016). al., 2012; Уэйд и Кретьен, 1993; des Georges et al., 2008), что приводит к неоднородности и дефектам решетки микротрубочек. Недавно сообщалось, что гидролиз субъединицы β-тубулина в решетке микротрубочек приводит к общему «уплотнению» решетки микротрубочек (Alushin et al., 2014), что, вероятно, приводит к структурной неоднородности внутри решетки микротрубочек. Наконец, сообщалось, что ряд лекарственных средств, нацеленных на микротрубочки, изменяет крупномасштабную структуру микротрубочек, внося неоднородность и дефекты в решетку микротрубочек (Díaz et al., 1998; Дудхи и др., 2016; Kellogg et al., 2017).

Важно отметить, что недавняя работа раскрыла связь между целостностью решетки микротрубочек и эффективностью транспорта на основе кинезина (Liang et al., 2016), опосредованного катанином отсечения микротрубочек (Davis et al., 2002), дестабилизации микротрубочек под действием Stathmin (Gupta). et al., 2013) и ацетилирование тубулина в микротрубочках (Coombes et al., 2016). Точно так же нарушение структуры закрытой решетки микротрубочек рядом с растущим концом микротрубочек указывает на то, что белки, отслеживающие кончики микротрубочек, могут распознавать эту конфигурацию, чтобы облегчить отслеживание кончиков (Guesdon et al., 2016; Бехстедт и Броухард, 2012; Bechstedt et al., 2014). Таким образом, целостность решетки микротрубочек может значительно влиять на различные клеточные процессы, связанные с микротрубочками. По этой причине инструменты необходимы как для систематического управления целостностью решетки микротрубочек в установке in vitro , так и для количественной оценки связанной структуры решетки микротрубочек.

Однако методы систематической генерации in vitro пулов микротрубочек с общими нуклеотидными состояниями, но с различными состояниями структурной целостности решетки не описаны.Эти пулы микротрубочек были бы неоценимы для оценки вклада целостности решетки микротрубочек в различные клеточные процессы, связанные с микротрубочками. Точно так же, хотя вариации в целостности решетки наблюдались с помощью электронной микроскопии (Coombes et al., 2016), методы количественной оценки и описания этих вариаций были бы полезным вкладом в эту недавно развивающуюся область исследований.

В этой работе мы описываем новые методы для создания пулов из in vitro микротрубочек с общими нуклеотидными состояниями, но с разными степенями и типами нарушений целостности решетки.Кроме того, мы разработали новые аналитические инструменты для количественной оценки этих структурных состояний микротрубочек с помощью (1) полуавтоматической платформы анализа изображений для изображений электронной микроскопии (ЭМ) и (2) экспериментов и полуавтоматического метода анализа с использованием полного внутреннего отражения. Флуоресцентная микроскопия (TIRF). С помощью наших новых количественных инструментов мы обнаружили, что условия роста и хранения микротрубочек in vitro оказали сильное влияние на структурную целостность решетки микротрубочек.Эти результаты имеют значение, которое следует учитывать при исследовании взаимодействий микротрубочек с рядом белков, связанных с микротрубочками, такими как молекулярные моторы, белки отслеживания кончиков микротрубочек, ферменты посттрансляционной модификации и ферменты, разделяющие микротрубочки.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

Метод: пулы микротрубочек GDP-тубулин с потенциальными вариациями структурных состояний решетки

Мы впервые разработали метод для создания стабильных пулов микротрубочек in vitro с общим состоянием нуклеотидов GDP-тубулина, но с разной степенью и типами нарушений целостности решетки.Для приготовления микротрубочек GDP-тубулина была приготовлена ​​смесь, состоящая из 33 мкМ тубулина (см. Дополнительные материалы и методы) (25% меченых родамином, 75% немеченых), 1 мМ GTP, 4 мМ MgCl 2 и 4% ДМСО. и выдерживали на льду 5 мин, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. После инкубации 10 мкл смеси микротрубочек разводили за один этап в 990 мкл теплого 10 мкМ раствора таксола (Sigma-Aldrich) в Brb80 (80 мМ PIPES pH 6,9, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCl 2 ) ( А).

Приготовление пула нуклеотидов микротрубочек. (A) Протокол роста и условия хранения микротрубочек GDP. (B) TIRF-изображения микротрубочек GDP с хранением при 37 ° C (слева, вверху) и микротрубочек с хранением GDP при 25 ° C (слева, внизу), а также ЭМ-изображения для каждой (справа). (C) Протокол роста, условия хранения и протокол обработки CaCl 2 для микротрубочек GMPCPP. (D) TIRF-изображения микротрубочек GMPCPP, как необработанных (слева, вверху), так и обработанных CaCl 2 (слева, внизу), а также ЭМ-изображения для каждого (справа). (E) Протокол роста и условия хранения микротрубочек GTPγS.(F) TIRF-изображения микротрубочек GTPγS, подготовленные и сохраненные в соответствии с процессом №1 (слева, вверху) и процессом №2 (слева, внизу), а также изображения ЭМ для каждого (справа). Для всех изображений ПЭМ были выбраны микротрубочки, чтобы подчеркнуть различия в структуре, которые наблюдались, хотя многие микротрубочки из измененных препаратов (красный) напоминают микротрубочки из контрольного препарата (синий). Изображения, представляющие среднее состояние, показаны на.

Чтобы потенциально манипулировать структурными состояниями микротрубочек и гарантировать, что микротрубочки были полностью гидролизованы в GDP-тубулин, раствор микротрубочек затем разделяли на две пробирки для хранения в течение ночи.Одну пробирку хранили в течение ночи при 37 ° C, в то время как вторую пробирку хранили в течение ночи при 25 ° C (A). Здесь мы предсказали, что условия хранения 37 ° C могут потенциально способствовать более эффективному восстановлению решетки микротрубочек по сравнению с раствором, хранящимся при 25 ° C. Эта идея была подтверждена наблюдением, что микротрубочки, хранящиеся при 37 ° C, были дольше, чем микротрубочки, хранящиеся в течение ночи при 25 ° C (B, слева; количественный анализ длины, рис. S1A; P = 2 × 10 −9 , т). -тест), а предварительные ЭМ-изображения намекали, что существуют также различия в структурной целостности решетки в результате этих альтернативных условий хранения (B, справа).

Мы отмечаем, что для создания стабилизированных микротрубочек GDP-тубулина таксол был добавлен к раствору микротрубочек перед хранением в течение ночи, повторяя широко используемый подход в исследовании микротрубочек. Поскольку сообщалось, что сам таксол влияет на структуру микротрубочек (Kellogg et al., 2017; Díaz et al., 1998), пробирки со смесью микротрубочек с условиями хранения при 25 ° C и 37 ° C были одинаково обработаны таксолом перед хранением. . Следовательно, любые наблюдаемые изменения в структуре микротрубочек после хранения в течение ночи не будут зависеть от эффекта самой начальной обработки таксолом.

Метод: пулы микротрубочек GMPCPP-тубулин с потенциальными вариациями структурных состояний решетки

Для приготовления стабилизированных микротрубочек GTP-тубулина мы использовали медленно гидролизующийся аналог GMPCPP. Поскольку микротрубочки GMPCPP очень стабильны и образуют ядро ​​при низких концентрациях свободного тубулина, нарушение целостности решетки микротрубочек GMPCPP было достигнуто обработкой после сборки CaCl 2 , которая разбирает микротрубочки GMPCPP на протофиламентные структуры (Gupta et al., 2013), а при промежуточной степени воздействия приводит к микротрубочкам на разных стадиях повреждения и разборки (Coombes et al., 2016).

Для получения стабилизированных микротрубочек GMPCPP смешивали 3,9 мкМ тубулина (25% меченых родамином, 75% немеченых) и 1 мМ GMPCPP в Brb80 и выдерживали на льду в течение 5 минут, затем инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. После инкубации микротрубочки разбавляли 400 мкл теплого Brb80 и 350 мкл этого разведения центрифугировали в ультрацентрифуге с воздушным приводом (Beckman-Coulter, Индианаполис, Индиана, США) при 20 фунт / кв. Дюйм в течение 5 мин.Супернатант отбрасывали, и осадок ресуспендировали в 400 мкл теплого Brb80 с 10 мкМ таксола для дальнейшей стабилизации микротрубочек. Затем смесь микротрубочек была разделена на две партии. Одна партия оставалась необработанной, а вторую партию инкубировали при конечной концентрации 0,04 M CaCl 2 в течение 40 минут при 37 ° C непосредственно перед использованием в анализах под микроскопом (C). Хотя не было различий в длине этих препаратов микротрубочек при использовании TIRF-микроскопии (D, слева; количественный анализ длины, рис.S1C; P = 0,26, t -тест), ЭМ-изображения продемонстрировали случайные нарушения целостности решетки микротрубочек и разматывание протофиламентов для обработанных CaCl 2 микротрубочек (D, справа).

Подобно препаратам нуклеотидов микротрубочек GDP, таксол добавляли к раствору микротрубочек для дальнейшей стабилизации микротрубочек и особенно для сохранения обработанных CaCl 2 микротрубочек GMPCPP. Однако как необработанные, так и обработанные CaCl 2 микротрубочки были одинаково смешаны с таксолом перед визуализацией.Следовательно, любые наблюдаемые изменения в структуре микротрубочек между необработанными и обработанными CaCl 2 микротрубочками не будут зависеть от эффекта обработки таксолом.

Метод: пулы микротрубочек GTPγS-тубулина с потенциальными вариациями структурных состояний решетки

Наконец, мы приготовили стабилизированные микротрубочки GTP-тубулина, используя аналог GTP GTPγS. Здесь использовались два разных метода приготовления. В Процессе № 1 смесь, состоящая из 12 мкМ тубулина (25% меченых родамином, 75% немеченых), 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 0.Готовили микротрубочки «затравки» с 1 мг / мл казеина, 4 мМ GTPγS и немеченые GMPCPP и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Через 1 час 10 мкл смеси микротрубочек разбавляли в 24 мкл теплого Brb80 с 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 0,1 мг / мл казеина и 10 мкМ таксола и хранили в течение ночи при 37 ° C (E). Мы предсказали, что протокол процесса No1 максимизирует возможность производства микротрубочек GTPγS с неповрежденными решетчатыми структурами, потому что (1) относительно низкая концентрация тубулина, используемая в начальной сборке микротрубочек, может способствовать более упорядоченному процессу сборки (Gardner et al., 2011) и (2) хранение микротрубочек GTPγS, стабилизированных таксолом, при 37 ° C может способствовать более эффективному восстановлению дефектов решетки микротрубочек, как описано выше.

Затем мы использовали альтернативный процесс, процесс № 2, для получения микротрубочек GTPγS с потенциально более разрушенной структурой решетки. Этот процесс был идентичен процессу № 1, за исключением того, что (1) концентрация тубулина, используемая в начальной сборке микротрубочек, составляла 25,5 мкМ, а не 12 мкМ, поскольку мы предсказали, что более высокая концентрация свободного тубулина может способствовать более быстрому и, следовательно, менее упорядоченному , более склонный к дефектам процесс сборки (Gardner et al., 2011) и (2), через 1 час сборки 10 мкл смеси микротрубочек разводили в 255 мкл теплого Brb80 с 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 0,1 мг / мл казеина и 10 мкМ таксола (для сравнения до 24 мкл, как описано выше), и (3) смесь хранили в течение ночи при 25 ° C (в отличие от 37 ° C, как указано выше) (E). Здесь мы предсказали, что за счет снижения остаточной концентрации свободного тубулина во время хранения и за счет хранения микротрубочек при более низкой температуре это будет препятствовать любой репарации дефектов решетки микротрубочек GTPγS.Действительно, микротрубочки, хранящиеся при 37 ° C и с более высокой концентрацией остаточного свободного тубулина (процесс №1 выше), были значительно дольше, чем микротрубочки, хранящиеся в течение ночи при 25 ° C при более низкой концентрации остаточного свободного тубулина (процесс №2) (F, слева; количественный анализ длины Рис. S1B; P = 2 × 10 −16 , т -тест), что свидетельствует о том, что полимеризация и ремонт могли происходить во время хранения. Предварительные ЭМ-изображения намекали, что оба препарата имели некоторую степень нарушений целостности крупномасштабной решетки микротрубочек, причем Процесс № 2 имел более частые нарушения (F, справа).

Подобно другим препаратам микротрубочек, мы отмечаем, что для создания стабилизированных микротрубочек GTPγS-тубулина таксол был добавлен к раствору микротрубочек перед хранением в течение ночи, повторяя широко используемый подход в исследовании микротрубочек. Поскольку сообщалось, что сам таксол влияет на структуру микротрубочек (Kellogg et al., 2017; Díaz et al., 1998), пробирки со смесью микротрубочек Процесса №1 и Процесса №2 были одинаково обработаны таксолом перед хранением.Следовательно, любые наблюдаемые изменения в структуре микротрубочек между Процессом №1 и Процессом №2 не будут зависеть от эффекта обработки таксолом.

Метод: инструмент количественной характеристики структурной решетки для EM

Затем мы собрали изображения каждого препарирования микротрубочек с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и проанализировали изображения на предмет потенциальных структурных нарушений с помощью недавно разработанного полуавтоматического инструмента анализа. Следует отметить, что используемый здесь метод ТЕМ с отрицательным окрашиванием обеспечивает простой метод для сравнительного анализа наших пулов микротрубочек, тем более что оба пула микротрубочек в каждом случае нуклеотидов были одинаково приготовлены и визуализированы с помощью ТЕМ в нескольких испытаниях.Однако наш новый автоматизированный инструмент для количественной структурной характеристики микротрубочек, как описано ниже, будет в равной степени применим к криоэлектронной микроскопии, методу, который может позволить улучшить сохранение структуры микротрубочек.

Для получения изображений с помощью ПЭМ микротрубочки были приготовлены так же, как описано выше. Затем каплю смеси помещали на медную сетку с углеродным покрытием размером 300 меш на 1 мин. Через 1 мин сетку окрашивали 1% уранилацетатом в течение 1 мин.Затем пятно удаляли фильтровальной бумагой, оставляли сетку сушиться и хранили. Образцы получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Technai Spirit BioTWIN (FEI, Thermo Fisher Scientific). Все изображения были получены с увеличением 18,5k × (размер пикселя, 1 нм), размером изображения 2048 × 2048 и сохранены в формате изображения без потерь.

Анализ ЭМ-изображений был выполнен с использованием нового пользовательского скрипта MATLAB (MathWorks) (см. Дополнительные материалы и методы). Сначала микротрубочки на ЭМ изображениях отслеживались вручную с помощью соединенных отрезков линий (A, B).Мы отмечаем, что размер сегмента, полученный в результате ручного отслеживания, зависел от степени кривизны, при этом более высокая кривизна приводила к более коротким сегментам. Сегменты были уточнены с использованием автоматизированного алгоритма для уменьшения человеческой ошибки или систематической ошибки (C-E). Это автоматическое уточнение включало сначала сглаживание изображения для улучшения обнаружения краев (C), а затем использование фильтра краев и немаксимального подавления, которое представляет собой метод прореживания на основе интенсивности для определения центра краев (D). Наконец, «сильные», высокоинтенсивные края микротрубочек были идентифицированы с использованием многоуровневой реализации порогового алгоритма Otsu, с помощью которого можно было уточнять ручные трассировки краев (E).По уточненным следам микротрубочек автоматически измеряли ширину микротрубочек ( W ) и кривизну ( C ) (F) (подробности сегментации следа и расчета средней линии см. В дополнительных материалах и методах).

Автоматическая количественная оценка целостности крупномасштабной решетки микротрубочек. Описание (слева) и пример визуализации (справа) автоматизированного метода количественной оценки ЭМ. Обведенная в рамку область в B (справа) показана увеличенной от C до E (справа).

Затем показатели ширины и кривизны были объединены для расчета общей «Структурной метрики» ( S ), которая обеспечивает количественную оценку морфологии решетки микротрубочек.Для этого общая абсолютная кривизна была рассчитана путем суммирования абсолютных значений кривизны для каждого сегмента средней линии отдельной микротрубочки [A, слева; ( C Всего )]. Затем автоматически рассчитывалась метрика «отклонения ширины» микротрубочки путем измерения ширины микротрубочки для каждого сегмента [A, справа, ( W, )], а затем путем вычитания ширины типичной интактной микротрубочки ( W, , ожидалось). ) в пикселях, как измерено на основе типичных неповрежденных микротрубочек на изображениях.Абсолютное значение этого отклонения ширины было суммировано по всей микротрубочке, нормализовано к длине микротрубочки и использовано в качестве показателя отклонения ширины (| W - W Ожидаемое |). Окончательный структурный показатель ( S ) был затем рассчитан путем суммирования показателей отклонения ширины и кривизны, каждый из которых, соответственно, нормализован параметрами N W и N C , чтобы обеспечить примерно равный вес кривизны и ширины. окончательная оценка выглядит следующим образом:

(1)

Крупномасштабная целостность решетки смещена в пулах микротрубочек. (A) Визуализация метода количественной оценки ЭМ. Слева: измерение ширины в структурной метрике. Справа: измерение кривизны в структурной метрике. (B) Образцы ЭМ-изображений микротрубочек GDP для хранения при 37 ° C (вверху) и микротрубочек GDP для хранения при 25 ° C (внизу; стрелки указывают на структурные нарушения). (C) Метрика структуры увеличивается при хранении при 25 ° C, предполагая, что крупномасштабная структура микротрубочек нарушена. (D, E) Измерения ширины и кривизны вносят вклад в метрику конструкции.(F) Образцы изображений ЭМ необработанных микротрубочек GMPCPP (вверху) и микротрубочек, обработанных CaCl 2 (внизу; стрелки указывают на структурные нарушения, вставка - увеличение). Масштабные линейки: 100 нм. Метрика структуры увеличивается с обработкой CaCl 2 (внизу), предполагая, что крупномасштабная структура микротрубочек нарушена. (H, I) Измерения ширины и кривизны влияют на метрику конструкции. (J) Образцы ЭМ-изображений микротрубочек GTPγS, подготовленные и сохраненные с использованием процесса №1 (вверху) и процесса №2 (внизу; стрелки указывают на разрушенную структуру).Масштабные линейки: 100 нм. Метрика структуры увеличивается с помощью процесса №2, предполагая, что крупномасштабная структура микротрубочек дополнительно нарушается с помощью процесса №2 по сравнению с процессом №1. (L, M) Измерения ширины и кривизны влияют на общую метрику конструкции. Гистограммы на C, G и K показывают среднее значение ± s.e.m; P - значения были рассчитаны на основе t - теста независимых средних.

Значения N W и N C были установлены на 2 и 0.1 соответственно, так что отклонение по ширине в 2 пикселя взвешивалось одинаково с общей абсолютной кривизной 0,1 радиана. Эти значения были выбраны в соответствии со шкалой наблюдаемых вариаций ширины и кривизны, чтобы каждая составляла приблизительно 50% окончательной общей структурной метрики ( S ). Мы отмечаем, что более высокое значение метрики структуры ЭМ ( S ) будет отражать более частые или более серьезные морфологические структурные нарушения целостности решетки микротрубочек, такие как изгибы, частичные трубки и открытые пластинчатые области, которые имеют тенденцию к увеличению. ширина и кривизна микротрубочек.Меньшие нарушения целостности решетки микротрубочек, такие как дефекты или дыры в решетке, будут менее эффективно обнаруживаться с помощью этой меры.

Результаты: пулы микротрубочек имеют изменения структурной целостности решетки, как измерено с помощью EM

. Затем автоматизированный код MATLAB был применен для анализа изображений ЭМ для каждой объединенной партии микротрубочек. Используя общую структурную метрику, основанную на ширине и кривизне микротрубочек ( S , уравнение 1), можно сравнивать крупномасштабную структурную целостность препаратов микротрубочек между пулами микротрубочек с разными препаратами.Достоверность оценивалась с помощью двустороннего критерия Стьюдента t независимых средних. Все отображаемые микротрубочки были включены в анализ независимо от видимого структурного состояния. Изображения в были выбраны так, чтобы соответствовать средней метрике структуры каждого условия.

Сначала была оценена целостность решетки микротрубочек GDP. Качественно пул микротрубочек GDP в условиях хранения 37 ° C был охарактеризован на ЭМ-изображениях прямыми краями и однородной шириной (B, вверху).Напротив, пул микротрубочек в условиях хранения при 25 ° C, по-видимому, имеет более частые изгибы по длине микротрубочек и более высокую вариабельность ширины по длине микротрубочек, часто совпадающую с областями пониженной интенсивности (B, внизу). Эти сбои могут быть связаны с открытыми, листовыми или неполными трубками. Затем мы использовали наш автоматический инструмент анализа для измерения структурной метрики (S) множества микротрубочек в каждом пуле. Мы обнаружили, что наблюдалось значительное увеличение структурной метрики для пула микротрубочек GDP при условиях хранения при 25 ° C по сравнению с условиями хранения при 37 ° C (C; P = 2 × 10 −6 , ). t -test), и что это увеличение произошло из-за сдвигов в сторону большей вариации ширины и большей кривизны микротрубочек (D, E), предполагая, что условия хранения при более низкой температуре снижали структурную целостность решетки (т.е.е. привело к увеличению частоты структурных нарушений) микротрубочек GDP, стабилизированных таксолом. Обратите внимание, что D и соответствующие цифры для других нуклеотидов (H, L) показывают среднюю ширину микротрубочек, хотя метрика структуры является функцией кумулятивного отклонения ширины.

Затем оценивали целостность решетки микротрубочек GMPCPP. Качественно микротрубочки GMPCPP без обработки CaCl 2 выглядели преимущественно прямыми и однородными, подобно интактным микротрубочкам GDP (F, вверху).Напротив, микротрубочки GMPCPP с обработкой CaCl 2 , по-видимому, имели больше разрывов (F, внизу) и иногда проявляли характерную черту «распутанных» нитчатых областей (F). Количественно мы наблюдали значительное увеличение структурной метрики ( S ) для обработанных кальцием микротрубочек GMPCPP (G, в центре; P = 5,9 × 10 -3 , t -тест). Это увеличение, по-видимому, в значительной степени связано с увеличенной кривизной ленточных структур микротрубочек (I и F), поскольку обработка CaCl 2 сужала типичное распределение ширины (H), вероятно, за счет образования зазоров или отверстий в решетке, а также за счет выборочная деполимеризация более нестабильных, широких и открытых структур.Это предполагает, что обработка CaCl 2 действовала, чтобы нарушить структурную целостность решетки микротрубочек GMPCPP. Обработанные CaCl 2 микротрубочки имели высокую дисперсию структурной метрики, так как некоторые из микротрубочек имели очень структурно отличные нерасположенные области (F).

Наконец, было оценено структурное состояние решетки микротрубочек GTPγS. Пулы микротрубочек GTPγS, полученные с использованием процесса №2, выглядели качественно более изогнутыми и менее однородной ширины, чем микротрубочки GTPγS из процесса №1 (J).Это наблюдение было количественно подтверждено оценкой показателя структурной метрики: наблюдалось значительное увеличение значения структурной метрики для микротрубочек GTPγS, продуцируемых и хранимых с помощью процесса №2, по сравнению с процессом №1 (K; P = 1 × 10 ). −15 , т -тест). Это увеличение происходило за счет одновременных сдвигов в сторону большей ширины и большей кривизны для микротрубочек GTPγS Процесса №2 по сравнению с Процессом №1 (L, M). Эти результаты предполагают, что микротрубочки GTPγS, полученные в процессе №2, имеют тенденцию иметь более частые области с открытыми листами и частичными трубками по сравнению с таковыми, полученными в процессе №1.

Хотя протоколы приготовления микротрубочек с использованием трех разных нуклеотидов были разными, каждый из этих протоколов отражает обычно используемые методы для получения стабильных микротрубочек in vitro . Таким образом, наш новый метод анализа подчеркивает структурные различия в решетке микротрубочек, которые возникают, когда эти протоколы используются в типичных лабораторных условиях. В частности, мы отмечаем, что даже интактные микротрубочки из процесса № 1 для микротрубочек GTPγS имели гораздо более высокий структурный показатель (∼13) и, следовательно, существенно более низкую структурную целостность, чем микротрубочки, полученные из любого из общих базовых протоколов для GDP. и микротрубочки GMPCPP (∼4 и ∼7 соответственно).

Важно отметить, что мы описали методы, которые позволили нам изменить структурную целостность решетки в пределах данного пула нуклеотидов стабильных микротрубочек. Количественная оценка ЭМ изображений микротрубочек показала, что структурная целостность крупномасштабной решетки микротрубочек, оцениваемая по ее ширине и кривизне, настраивается для микротрубочек GDP, GMPCPP и GTPγS, стабилизированных таксолом. Способность изменять крупномасштабную структурную целостность микротрубочек в пределах общего нуклеотидного состояния позволит проводить новые исследования, которые непосредственно исследуют влияние структурного состояния микротрубочек на стационарное связывание, подвижность и кинетику включения / выключения белков, связанных с микротрубочками.

Метод: характеристика структуры решетки с помощью репортерного анализа TIRF

Автоматизированный инструмент количественной оценки ЭМ, описанный выше, предоставил метод для характеристики структурных изменений решетки в микротрубочках, стабилизированных in vitro . Однако этот метод количественной оценки EM не был эффективным для характеристики более мелких нарушений в масштабе субмикротрубочки в целостности решетки микротрубочек, таких как зазоры или дыры. Для такого анализа мы разработали альтернативный автоматизированный метод.

Недавняя работа Schaedel et al.(2015) продемонстрировали, что новый тубулин может быть включен в дефекты или промежутки в решетке микротрубочек. Основываясь на этом результате, мы разработали «репортерный» анализ TIRF, который позволил нам количественно исследовать структурную целостность наших пулов микротрубочек с помощью флуоресцентной микроскопии. Экспериментальная часть нашего репортерного анализа была завершена следующим образом. Сначала каждый пул микротрубочек с красной меткой (как описано выше) инкубировали с помеченным зеленым «репортерным» тубулином. Для этого готовые препараты микротрубочек, как описано выше, центрифугировали в ультрацентрифуге с воздушным приводом при 20 psi в течение 5 минут, ресуспендировали в 50 мкл раствора «репортера» [1.5 мкМ тубулина, меченного 66% Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific), 1 мМ MgCl 2 , 250 мкМ GTP и 10 мкМ таксола в Brb80], а затем инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C (A, слева) . Этот раствор микротрубочек затем вводили в камеру для визуализации, после чего от 30 с до 3 мин позволяли микротрубочкам прилипнуть к покровному стеклу для визуализации, а затем раствор был заменен теплым буфером для визуализации (см. Материалы и методы). Затем были получены изображения микротрубочек при длинах волн 488 нм и 561 нм (B).

Экспериментальный репортерный анализ. (A) Изображение экспериментального репортерного анализа: зеленый репортерный тубулин включается в плюс концы микротрубочек, а также в зазоры и дефекты решетки в процессе восстановления. Ожидается, что количество включенного в решетку зеленого репортерного тубулина будет выше для более разрушенных структур микротрубочек (справа, внизу) и ниже для более неповрежденной структуры решетки (справа, вверху), но зеленые удлинения на плюс-концах микротрубочек будут наблюдаться в оба случая.(B) Изображение процесса визуализации TIRF. (C) Пример изображения, показывающий микротрубочку с зеленым удлинением тубулина на плюсовом конце (справа) с зазором, заполненным зеленым репортерным тубулином (слева, белая стрелка).

В течение инкубационного периода зеленый репортерный тубулин включался в виде нормального роста микротрубочек на плюсовых концах микротрубочек (C, справа), но также иногда включался по длине микротрубочек (C, слева, белая стрелка) . Здесь мы ожидали, что микротрубочки с большим количеством щелей, отверстий или других дефектов решетки будут приводить к увеличению появления зеленых репортерных пятен по длине микротрубочек из-за включения нового репортерного тубулина в решетку (A, справа, внизу).Напротив, идеально интактная решетка микротрубочек будет иметь включение только зеленого репортерного тубулина, выходящего за пределы помеченной красным решеткой на ее плюс-конце, из-за нормальной сборки конца микротрубочек (A, справа, вверху).

Метод: характеристика структуры решетки с помощью репортерного анализа TIRF - количественный анализ

Затем мы разработали новый инструмент анализа MATLAB (Mathworks) (см. Дополнительные материалы и методы), чтобы обеспечить количественную оценку степени нарушения целостности решетки в масштабе субмикротрубочки. , о чем свидетельствует доля зеленого репортерного тубулина, который был включен по длине решетки красных микротрубочек.Сначала это было выполнено с помощью автоматической обработки канала красных микротрубочек для определения положительных по микротрубочкам областей, что затем позволило преобразовать красный канал в бинарное изображение с белыми микротрубочками и черным фоном (; расширенные детали на рис. S2). Затем канал тубулина зеленого репортера также был предварительно обработан для сглаживания высокочастотного шума и корректировки неоднородности освещения TIRF (B). Затем порог зеленого канала был вручную увеличен до уровня чуть выше фонового (C).Выбор порогового значения на уровне чуть выше фона обеспечивает согласованный анализ в нескольких экспериментах, а также надежно обнаруживает тусклые включения репортерного тубулина в микротрубочки (C, правое нижнее изображение представляет собой окончательное изображение с пороговым значением). Затем автоматически производились измерения длины репортерного тубулина из идентифицированных участков микротрубочек, как показано красным контуром на D.

Автоматическая количественная оценка разрывов в целостности решетки микротрубочек. Описание (слева) и пример визуализации (справа) автоматизированного анализа включения тубулина в репортер TIRF.Часть изображения на B (справа) показана в увеличенном виде на C и D (справа).

Для анализа степени разрушения решетки для каждой микротрубочки степень включения зеленого тубулина количественно оценивали с помощью Reporter Fraction ( RF ). Этот показатель был автоматически рассчитан как общая длина сигнала зеленой репортерной тубулина ( G ; A), деленная на общую длину сигнала красной микротрубочки ( R ; A):

(2)

Целостность решетки микротрубочек составляет сдвинуты в пулах микротрубочек. (A) Вверху: пример микротрубочек (красный) после ремонта репортерным тубулином (зеленый). Внизу: изображение метода количественной оценки репортерной фракции (RF) с использованием длины красного (R) и зеленого (G). (B) Репрезентативные изображения микротрубочек после восстановления пробирным методом заполнения пробелов для микротрубочек GDP с хранением при 37 ° C (вверху) и микротрубочек GDP с хранением при 25 ° C (внизу). Белые стрелки указывают места включения репортерного тубулина. (C) Репортерная фракция увеличивается для микротрубочек GDP с хранением при 25 ° C (справа) по сравнению с микротрубочками GDP с хранением при 37 ° C, предполагая, что хранение при 25 ° C не способствует восстановлению разрывов и дефектов в решетке микротрубочек.(D) Распределение ремонтных длин. (E) Репрезентативные изображения микротрубочек после ремонта с помощью анализа заполнения пробелов для необработанных микротрубочек GMPCPP (вверху) и для микротрубочек GMPCPP, обработанных CaCl 2 (внизу). (F) Репортерная фракция увеличивается для обработанных CaCl 2 микротрубочек (справа) по сравнению с необработанными микротрубочками, что позволяет предположить, что обработка CaCl 2 может привести к разрывам и дефектам в решетке микротрубочек. (G) Распределение ремонтных длин. (H) Репрезентативные изображения микротрубочек после ремонта с помощью анализа заполнения пробелов для микротрубочек GTPγS Процесса №1 (вверху) и Процесса №2 микротрубочек GTPγS (внизу).(I) Репортерная фракция увеличивается для микротрубочек GTPγS Процесса №2 (справа) по сравнению с микротрубочками GTPγS Процесса №1, что позволяет предположить, что Процесс №2 не способствует восстановлению разрывов и дефектов в решетке микротрубочек. (J) Распределение ремонтных длин. Гистограммы на C, F и I показывают среднее значение ± s.e.m. фракция репарации, взвешенная по длине микротрубочек (рис. S3) и скорректированная на неспецифический фоновый вклад; P -значения были рассчитаны на основе теста Стьюдента t .

Эта основанная на длине метрика имеет два ключевых преимущества перед считыванием на основе интенсивности, так как (1) она не чувствительна к изменению интенсивности изображения между экспериментами, и (2) она не подвержена смещению из-за перекрытия с зелеными расширениями в растущий положительный конец, который обычно намного ярче, чем большинство участков с зазорами, и присутствует на большинстве микротрубочек независимо от структурного состояния.Мы отмечаем, что хотя анализ репарации теоретически достаточно чувствителен, чтобы уловить добавление единственного меченого димера тубулина, дифракционный предел нашего TIRF микроскопа приводит к сообщению о длине репарации зазоров, которые на самом деле значительно меньше, чем ~ 250 нм (даже один репортерный димер тубулина) как длины восстановления от 160 нм (наш размер пикселя) до ~ 250 нм [дифракционный предел, ~ 31 димер в длину (250/8)]. Здесь пороговое значение зеленого репортерного сигнала приводит к тому, что некоторые из участков восстановления диммера регистрируют только самые яркие пиксели в своей дифракционной картине, поэтому мы можем определять такие низкие длины, как размер пикселя.

Чтобы вычислить репортерную фракцию для каждой микротрубочки, красные микротрубочки были автоматически обнаружены с использованием сценария MATLAB, как описано выше. Ложноположительные (немикротрубочки) отбирались вручную. Для каждой (красной) микротрубочки длина микротрубочек автоматически регистрировалась как красный сигнал ( R ; A). Для каждой микротрубочки зеленый сигнал ( G ) определяли как совокупную длину сигнала зеленого репортерного тубулина, который перекрывался с красной микротрубочкой, что позволяло исключить удлинения плюсовых концов (т.е.е. зеленый сигнал, который не перекрывался с красной микротрубочкой) из анализа (А). Затем вычисляли репортерную фракцию ( RF ) как кумулятивную длину репортерного сигнала, деленную на длину микротрубочки (уравнение 2).

Результаты: пулы микротрубочек имеют изменения в структурной целостности решетки, как измерено с помощью анализа репортера TIRF

Затем анализ репортера TIRF был использован для характеристики каждого из наших пулов микротрубочек (B-J). Во-первых, целостность решетки пулов микротрубочек GDP оценивалась путем расчета репортерной фракции для каждого пула.Качественно сегменты включения репортера зеленого тубулина в решетку микротрубочек чаще наблюдались в пуле хранения микротрубочек GDP при 25 ° C, чем в пуле хранения 37 ° C (B, белые стрелки). После количественной оценки с использованием репортерной фракции (RF) мы обнаружили, что репортерная фракция для микротрубочек GDP пула хранения 25 ° C была на 55% выше по сравнению с микротрубочками пула хранения 37 ° C (C; P <10 - 9 ), предполагая, что более высокая температура хранения в течение ночи привела к уменьшению дефектов, зазоров и отверстий в микротрубочках.Средняя длина репарации была сходной между двумя пулами микротрубочек (D; P = 0,124, t -тест), что позволяет предположить, что более высокая репортерная фракция для пула 25 ° C является результатом увеличения количества репарационных областей, а не увеличение длины ремонтной области.

Затем целостность решетки микротрубочек GMPCPP оценивали путем вычисления репортерной фракции для каждого пула (E). Микротрубочки GMPCPP, обработанные CaCl 2 , показали на ~ 80% больше включения зеленого репортерного тубулина (более высокая репортерная фракция), чем необработанные микротрубочки GMPCPP (F; P <10 -9 ).Кроме того, распределение длин репарации было смещено после обработки CaCl 2 , так что для обработанных CaCl 2 микротрубочек наблюдалась большая средняя длина репарации по сравнению с необработанными микротрубочками (G; P <10 −13 , т -тест). Таким образом, обработка CaCl 2 вызвала появление отверстий и зазоров в решетке в дополнение к нарушениям, о которых сообщалось с помощью метрики структуры ЭМ (C).

Наконец, целостность решетки микротрубочек GTPγS оценивали путем расчета репортерной фракции для каждого пула (H).Мы наблюдали на ~ 85% больше включения зеленого репортерного тубулина (более высокая репортерная фракция) в микротрубочки GTPγS, полученные с помощью процесса №2, по сравнению с процессом №1 (I; P <10 -9 ). Средняя длина репарации была сходной между двумя пулами микротрубочек (J; P = 0,054, t -тест), предполагая, что увеличенная фракция репортера была обусловлена, прежде всего, большим количеством репарационных регионов репортера на микрон микротрубочки. Следовательно, первоначально выращивая микротрубочки GTPγS при более низкой концентрации свободного тубулина, а затем сохраняя их в таксоле в условиях, способствующих восстановлению дефектов (37 ° C, более высокая концентрация остаточного свободного тубулина в растворе для хранения), это позволяло дефекты в решетке. , например, отсутствующие элементы, отверстия и зазоры для ремонта.

Результаты: понимание процесса репарации микротрубочек. целостность стабилизированных таксолом микротрубочек GDP.

Чтобы проверить, действительно ли микротрубочки, стабилизированные таксолом, самовосстанавливаются в своей решетке во время хранения в течение ночи, мы сравнили репортерную фракцию для вновь приготовленных микротрубочек по сравнению с теми, которые хранились в течение ночи.Здесь, в день 0, сразу после приготовления микротрубочек и стабилизации таксолом раствор микротрубочек разделяли на две пробирки. Одну пробирку хранили в течение ночи при 25 ° C, а другую - в течение ночи при 37 ° C. Мы наблюдали, что репортерная фракция уменьшалась после хранения в течение ночи при 37 ° C (день 1) по сравнению с вновь приготовленными микротрубочками, стабилизированными таксолом (день 0) (A; P = 0,0014). Напротив, наблюдалось небольшое, но незначительное снижение репортерной фракции после хранения в течение ночи при 25 ° C (A; P = 0.160). Таким образом, недавно приготовленные микротрубочки GDP, стабилизированные таксолом, имели дефекты решетки, которые были исправлены после хранения в течение ночи при 37 ° C. Однако хранение при комнатной температуре (25 ° C) не способствовало аналогичному уровню репарации, предполагая, что температура хранения стабилизированных таксолом in vitro микротрубочек оказывает значительное влияние на их структуру из-за врожденного процесса самовосстановления.

Влияние условий хранения на структурную целостность решетки микротрубочек. (A) Разница во фракции репортера после 1 дня хранения при 25 ° C или 37 ° C. (B) Измененная концентрация остаточного свободного тубулина во время хранения влияет на структуру микротрубочек, как показано Reporter Fraction: увеличение количества остаточного свободного тубулина приводит к уменьшению репортерной фракции, предполагая, что микротрубочки, стабилизированные таксолом, имеют меньше дефектов и разрывов, когда они хранятся в условиях более высокая остаточная концентрация тубулина. Гистограммы в A и B показывают среднее значение ± s.e.m. фракция репарации, взвешенная по длине микротрубочек и скорректированная на фоновый вклад; P -значения были рассчитаны на основе теста Стьюдента t .(C) Схема, демонстрирующая предложенный механизм изменений в микротрубочках GDP, стабилизированных таксолом, во время хранения: хранение при 25 ° C и низкая остаточная концентрация свободного тубулина предотвращает восстановление поврежденных микротрубочек (слева, внизу). Напротив, хранение при 37 ° C и более высокая остаточная концентрация свободного тубулина приводят к восстановлению поврежденных микротрубочек (справа, внизу).

Поскольку микротрубочки, хранящиеся в растворе таксола, могут восстанавливать себя даже при очень низких остаточных концентрациях тубулина, мы затем спросили, могут ли изменения в остаточной концентрации тубулина в растворе для хранения изменить этот процесс восстановления.В нашем оригинальном препарате микротрубочек GDP-тубулин 10 мкл исходной смеси полимеризованных микротрубочек разводили в 990 мкл теплого 10 мкМ раствора Taxol Brb80 (A, слева), в результате чего измеренная остаточная концентрация свободного тубулина в растворе составляла 90 нМ. Чтобы проверить, может ли остаточный свободный тубулин способствовать процессу восстановления во время хранения, 2, 2,5 и 5 мкл свежеприготовленного раствора полимеризованных GTP-микротрубочек, как описано выше, разводили в 1000, 250 и 100 мкл теплого раствора таксола (в Brb80), соответственно, что приводит к остаточным концентрациям свободного тубулина 18 нМ, 90 нМ и 450 нМ соответственно.Мы обнаружили, что после хранения в течение ночи при 25 ° C, наблюдалось уменьшение значения Reporter Fraction с увеличением остаточной концентрации свободного тубулина (B; P = 0,0053 с 90 нМ до 450 нМ)). Например, когда наблюдалось пятикратное увеличение остаточной концентрации свободного тубулина (от 90 до 450 нМ), наблюдалось снижение репортерной фракции на 15%, и, наоборот, когда наблюдалось пятикратное снижение остаточной концентрации свободного тубулина (90 нМ до 18 нМ) наблюдалось увеличение репортерной фракции на 15%, хотя это изменение не было статистически значимым из-за вариабельности результатов репортерной фракции ( P = 0.249). Кроме того, в отдельном эксперименте мы наблюдали, что при 10-кратном снижении остаточной концентрации свободного тубулина (с 90 нМ до 9 нМ) хранение в течение ночи при 25 ° C приводило к полной деполимеризации микротрубочек (данные не показаны).

Таким образом, мы обнаружили, что, увеличивая остаточную концентрацию свободного тубулина в растворе для хранения в течение ночи, мы можем настроить репортерную фракцию микротрубочек для микротрубочек GDP, что указывает на изменение целостности решетки микротрубочек. В соответствии с изменением фракции репортера от дня 0 до дня 1 (A), это предполагает, что свежеприготовленные микротрубочки, стабилизированные таксолом в одноэтапном процессе, имели нарушения целостности решетки (C, вверху), как сообщалось ранее (Díaz и другие., 1998; Matesanz et al., 2011). Механизм, с помощью которого целостность решетки микротрубочек in vitro может быть изменен во время хранения, заключается в прямом включении в решетку и восстановлении ее свободными димерами тубулина из раствора, особенно при хранении при теплых температурах (C, внизу). Альтернативно, более разрушенная субпопуляция микротрубочек также может выборочно деполимеризоваться во время хранения. Однако, поскольку микротрубочки, стабилизированные таксолом, имели тенденцию к увеличению длины в зависимости от времени хранения (рис.S4), вероятно, поврежденные микротрубочки также могут подвергаться ремонту.

ОБСУЖДЕНИЕ

Путем количественной оценки флуоресцентных и электронных микроскопических экспериментов мы продемонстрировали, что структурным состоянием микротрубочек можно манипулировать путем изменения условий роста и хранения этих микротрубочек. Эти результаты предполагают, что протоколы, используемые для приготовления, стабилизации и хранения микротрубочек in vitro , могут влиять на целостность решетки микротрубочек. Это, в свою очередь, могло повлиять на экспериментальные результаты при изучении моторных белков (Liang et al., 2016) или другие белки, ассоциированные с микротрубочками (Bechstedt et al., 2014; Davis et al., 2002; Gupta et al., 2013).

Важно отметить, что два наших метода количественной оценки, EM и TIRF микроскопия, предоставляют информацию о различных элементах структурных состояний микротрубочек. Метрика структуры EM (S) сообщает о ширине и кривизне микротрубочек, которые являются характеристиками крупномасштабных изменений структурного состояния микротрубочек. Кривизна указывает на большую гибкость решетки микротрубочек, которая может быть результатом любого или всех зазоров (Schaedel et al., 2015), незамкнутые участки микротрубочек (Guesdon et al., 2016), гибкость решетки, присущая состоянию нуклеотидов (Lopez, Valentine, 2014; Valdman et al., 2013; Alushin et al., 2014; Yajima et al. ., 2012), обработка таксолом (Mickey, Howard, 1995; Lopez, Valentine, 2014; Hawkins et al., 2013) или температура (Kawaguchi, Yamaguchi, 2010). Сходным образом увеличенная ширина указывает на открытую решетчатую структуру, которая может происходить из-за потери отдельных протофиламентов, тогда как уменьшение ширины указывает на отверстия или зазоры в решетке микротрубочек.

Репортерный анализ TIRF идеально подходит для выявления пробелов в структуре микротрубочек. В то время как на ЭМ-изображениях можно наблюдать зазоры и дефекты, более высокая пропускная способность визуализации TIRF позволяет быстро количественно оценить многие сотни микротрубочек на предмет изменений целостности решетки. Кроме того, визуализация TIRF достаточно чувствительна, чтобы обнаружить восстановление с помощью одного флуоресцентного димера тубулина. Поскольку репортерная фракция ( RF ) зависит от относительной длины красной и зеленой флуоресценции, она более чувствительна к небольшим промежуткам, чем метод количественной оценки, основанный на интенсивности.

Важно отметить, что манипуляции со структурой решетки для микротрубочек GMPCPP отличаются по своей реализации и результатам от манипуляций с микротрубочками GDP или GTPγS. Микротрубочки GDP и GTPγS изначально имели низкую структурную целостность в результате процессов их роста и / или добавления таксола, а затем они были впоследствии помещены в благоприятные или неблагоприятные условия для восстановления. Напротив, микротрубочки GMPCPP изначально характеризовались высокой структурной целостностью и впоследствии были повреждены добавлением кальция.Это привело к характерному различию пула более низкой структурной целостности микротрубочек GMPCPP по сравнению с двумя другими нуклеотидами как в измерениях EM, так и TIRF. В измерениях ЭМ лечение кальцием имело отчетливый фенотип уменьшения средней ширины при увеличении количества выбросов кривизны. В анализе репарации репортера TIRF обработка GMPCPP кальцием была единственным условием для сдвига распределения длины репарационной области, несмотря на тот факт, что все три условия низкой структурной целостности имели сходное увеличение фракции репортера.Это указывает на то, что метод манипуляции структурной целостностью играет важную роль в результирующих характеристиках микротрубочки.

Предыдущая работа идентифицировала методы изменения структуры микротрубочек посредством контроля количества протофиламентов (Bechstedt and Brouhard, 2013). Однако методы и инструменты, описанные в нашей новой работе, манипулируют отдельным элементом структуры микротрубочек, а именно целостностью решетки, и, таким образом, расширяют доступные возможности для исследований, сосредоточенных на влиянии структуры микротрубочек на клеточные процессы, основанные на микротрубочках.Манипуляции и количественная оценка структуры микротрубочек будут полезны для будущих исследований, сфокусированных на роли взаимодействий микротрубочек с белками, ассоциированными с микротрубочками.

Коррелированная криогенная флуоресцентная микроскопия и электронная криотомография показывают, что экзогенный TRIM5α может образовывать гексагональные решетки или агрегаты аутофагии in vivo.

Значение

Одной из наиболее заметных особенностей белков TRIM5 является их способность ограничивать ретровирусные инфекции путем связывания вирусных капсидов.TRIM5α образует высокодинамичные точки различного размера и при очистке гексагональные сети на поверхности вирионов ВИЧ, но молекулярная ультраструктура клеточных тел и связь in vitro сетей с ограничением ВИЧ остается неясной. Чтобы определить клеточную ультраструктуру, лежащую в основе точечной и динамической природы тел YFP-rhTRIM5α, мы применили криогенную коррелированную световую и электронную микроскопию в сочетании с электронной крио-томографией к тельцам TRIM5α и наблюдали локализацию YFP-rhTRIM5α в органеллах, расположенных вдоль ветви агрефагии тела. путь аутофагии.В соответствии с предыдущей работой мы также обнаружили, что TRIM5α образует гексагональные сети внутри клеток.

Abstract

Было показано, что члены семейства белков с трехчастным мотивом (TRIM) собираются в структуры как в ядре, так и в цитоплазме. Было показано, что один член семейства белков TRIM, TRIM5α, образует цитоплазматические тельца, участвующие в рестрикции ретровирусов, таких как ВИЧ-1. Здесь мы применили криогенную коррелированную световую и электронную микроскопию в сочетании с электронной крио-томографией к интактным клеткам млекопитающих, экспрессирующим YFP-rhTRIM5α, и обнаружили наличие гексагональных сеток, длина плеч которых была аналогична длинам гексагональных сеток, образованных очищенным TRIM5α in vitro.Мы также наблюдали YFP-rhTRIM5α в разнообразных структурах с характеристиками, ожидаемыми для органелл, участвующих на разных стадиях макроаутофагии, включая дезорганизованные белковые агрегации (секвестосомы), секвестосомы, окруженные плоскими двухмембранными везикулами (комплексы секвестосома: фагофор), секвестосомы внутри двойных мембранные везикулы (аутофагосомы) и секвестосомы в мультивезикулярных аутофагических вакуолях (амфисомы или аутолизосомы). В этих структурах также были замечены своды, что согласуется с их ролью в аутофагии.Наши данные 1) подтверждают недавние сообщения о том, что TRIM5α может формировать как хорошо организованные сигнальные комплексы, так и несигнальные агрегаты, 2) предлагают изображения пути макроаутофагии в почти нативном состоянии и 3) показывают, что хранилища достигают ранней стадии макроаутофагии.

Было показано, что члены семейства белков трехчастного мотива (TRIM) локализуются в изолированных субклеточных компартментах (1). Одним из наиболее широко изученных компартментов TRIM является цитоплазматическое тело TRIM5α (2). Подобно другим членам семейства TRIM (1), белки TRIM5 содержат RING E3 убиквитин-лигазный домен, домен самосборки B-box 2 и антипараллельный димерный домен спиральной спирали.Предыдущие структурные исследования показали, что домены coiled-coil и B-box 2 TRIM5α облегчают олигомеризацию в плоские гексагональные решетки in vitro (3⇓⇓-6). Белки TRIM5 также содержат один из двух различных C-концевых вирусных доменов узнавания, домен B30.2 / SPRY в TRIM5α или домен циклофилина A (CypA) в TRIMCyp (7⇓⇓ – 10). Одной из наиболее примечательных особенностей белков TRIM5 является их способность блокировать ретровирусные инфекции путем связывания вирусных капсидов через их домены B30.2 / SPRY или CypA (2, 10), но как это приводит к ограничению, остается неясным.

Campbell et al. Ранее сообщалось, что флуоресцентно меченый человеческий TRIM5α (huTRIM5α) и резус TRIM5α (rhTRIM5α) образуют внутри клеток высокодинамичные флуоресцентные тельца различного размера (11, 12), которые взаимодействуют с цитоплазматическими вирусными комплексами ВИЧ-1 (12). Предыдущие исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии со сфокусированным ионным пучком показали, что фиксированные и окрашенные YFP-меченные тельца резуса TRIM5α (YFP-rhTRIM5α) выглядят как большие агрегаты внутри цитоплазмы (13), но никаких дополнительных деталей различить не удалось.Чтобы выяснить ультраструктуру тел YFP-rhTRIM5α с более высоким разрешением и в более естественном состоянии, мы стремились получить их изображения с помощью криогенной коррелированной световой и электронной микроскопии (крио-CLEM) в сочетании с электронной криотомографией (крио-ЭТ) ( 14).

Мы обнаружили, что YFP-rhTRIM5α может образовывать протяженные гексагональные сети внутри клеток, а также различные структуры, характеристики которых соответствуют ожидаемым для разных стадий макроаутофагии (15), включая секвестосомы (16), фагофоры, аутофагосомы и аутофагические вакуоли.Макроаутофагия - одна из форм аутофагии, при которой разрушаются крупные структуры, такие как митохондрии, неправильно свернутые и агрегированные белки, вирусы или другие органеллы или клеточные патогены (17, 18). Процесс начинается с секвестрации субстратов в цитоплазме. Затем чашевидный сплюснутый пузырь, называемый фагофором, растет вокруг изолированного материала, пока не сливается с самим собой, заключая субстраты в двухмембранную аутофагосому. Затем аутофагосомы перемещаются на большие расстояния по микротрубочкам к центру организации микротрубочек, пока не встретятся и не сольются либо с эндосомой, либо с лизосомой, чтобы сформировать амфисому или автолизосому, соответственно.Мембранное слияние амфисомы с лизосомой также может давать автолизосому. Еще одна структура, которая, как известно, участвует в аутофагии, - это хранилища. Хранилища представляют собой примерно эллипсоидальные мегадальтонные рибонуклеопротеидные комплексы размером 70 нм × 30 нм, содержащие основной белок свода (MVP), связанный с теломеразой протеин-1 (TEP1) и полимеразу сводчатой ​​поли (АДФ-рибозы). Своды располагаются в цитоплазме (19) и ядре и, как известно, содержат некодирующие РНК сводов, важные для регуляции аутофагии (20).

В результате обнаружения того, что тела YFP-rhTRIM5α связаны с макроаутофагией, наши криотомограммы обеспечивают трехмерные (3D) изображения всех этих структур в их естественном состоянии с макромолекулярным (~ 4 нм) разрешением и показывают, что хранилища прибывают в самом начале процесса.

Результаты

Клетки HeLa, которые либо стабильно сверхэкспрессируют YFP-rhTRIM5α, либо нет (контроль дикого типа), выращивали на крио-ЭМ решетках в течение 12 ч, а затем погружали в жидкий пропан / этан (21). Поскольку добавление ингибитора протеасом MG-132 приводит к образованию больших флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α и мало влияет на стабильные уровни белка YFP-rhTRIM5α (по сравнению с необработанными) (12, 22), клетки, обработанные MG -132 также были изображены. ( SI Приложение , Таблица S2 предоставляет подробные сведения о том, какие криотомограммы были получены от каких клеток.Затем регистрировали фазово-контрастные и флуоресцентные изображения замороженных клеток с помощью светового микроскопа, снабженного криоститулом и линзой воздушного объектива с большим рабочим расстоянием (14, 23). Сетки с флуоресцентными телами YFP-rhTRIM5α, присутствующими на периферии клетки, достаточно тонкие для просвечивающей электронной микроскопии, затем переносились в криоэлектронный микроскоп. Затем те же самые клеточные области были перемещены в криоэлектронный микроскоп, и были записаны полные серии наклона с фазовой пластиной Вольта (VPP) и без нее.Затем были рассчитаны 3D-реконструкции (то есть криотомограммы). Синие флуоросферы (500 нм), добавленные к образцам перед замораживанием, использовали в качестве реперных маркеров для точного наложения центроидов флуоресцентных точек с точностью 80 нм на криотомограммы с использованием тех же процедур корреляции изображений, которые описаны ранее (24) (). SI Приложение , рис. S2).

Всего было проанализировано 45 криотомограмм (9 полученных с помощью VPP) флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α, расположенных на периферии 20 клеток, и 51 контрольная криотомограмма клеток HeLa, не экспрессирующих YFP-rhTRIM5α.Когда мы изучили криотомограммы телец YFP-rhTRIM5α и сравнили их с контролем, мы обнаружили несколько структур, часто колокализующихся с YFP-rhTRIM5α, включая своды, плотные белковые агрегаты, уплощенные везикулы, двухмембранные везикулы и вложенные везикулы. Поскольку все эти структуры ожидаются для пути аутофагии, мы пришли к выводу, что экзогенный YFP-rhTRIM5α разлагается посредством аутофагии. Это позволило нам начать последовательно размещать криотомограммы в процессе аутофагии, основываясь на том, какие особенности сопровождали другие (белковые агрегаты иногда присутствовали без сплющенных пузырьков и наоборот), а также на существующих знаниях, включая, например, что фагофоры (уплощенные пузырьки), как известно, созревают в двухмембранные аутофагосомы.Этот анализ выявил различные этапы аутофагии и их порядок: совместная локализация субстрата, прибытие сводов, образование плотных агрегатов субстрата (секвестосомы), создание фагофоров, закрытие фагофоров вокруг субстрата с образованием аутофагосом и, наконец, слияние аутофагосом с эндосомами или лизосомами для получения производят аутофагическую вакуоль.

Чтобы подтвердить, что тельца YFP-rhTRIM5α на самом деле являются аутофагическими структурами, мы использовали иммунофлуоресцентную микроскопию на клетках, выращенных в тех же условиях (на крио-ЭМ сетках), чтобы проверить, как часто тельца YFP-rhTRIM5α колокализируются с двумя известными аутофагическими маркерами, p62 и LC3B, а также с двумя контрольными неаутофагическими маркерами, DCP1A и RAB11 (рис.1 и SI Приложение , рис. S1). Мы обнаружили, что 65% телец YFP-rhTRIM5α совместно локализованы с точкой p62 и 50% совместно локализованы с точкой LC3B. Это хорошо согласуется с результатами крио-томографии, в которых 71% тел YFP-rhTRIM5a локализованы в структурах, которые мы интерпретировали как секвестосомы p62 (16), и 44% тел YFP-rhTRIM5a локализованы в структурах, которые мы интерпретировали как стадии развития аутофагия, в которой, как ожидается, будет находиться LC3B, включая фагофоры, аутофагосомы и лизосомы (25).

Рис. 1.

YFP-rhTRIM5α колокализуется с известными маркерами аутофагии в клетках HeLa, выращенных на ЭМ сетках. ( A – C ) Общие поля зрения и подмножества, показывающие совместную локализацию YFP-rhTRIM5α и SQSTM1 / p62 ( A ) и LC3B ( B ), но не контрольного белка DCP1A ( C ) (изображения аналогичного контроля, RAB11, были сопоставимы с DCP1A). Изображения, показывающие полное поле зрения, имеют одинаковый контраст и условия микроскопии для всех белков. Представления каналов показывают весь динамический диапазон захвата в высоком разрешении; контрасты были установлены, чтобы показать совместную локализацию белков до TRIM5α.Синий, Hoechst; зеленый, YFP-rhTRIM5α; красный, анти-Rb-TRITC ( A ), SQSTM1 / p62 ( B ), LC3B ( C ) и DCP1A. ( D ) Количество видимых точек TRIM5α и количество, которые совместно локализовались с каждым клеточным маркером. (Масштабные полосы: 20 мкм на обзорных изображениях и 5 мкм на изображениях каналов.)

На рисунках мы представляем примеры криотомограмм, представляющих каждую из различных стадий аутофагии в их выведенной последовательности. Для ясности и простоты на каждом таком рисунке показана одна криотомограмма с несколькими панелями для выделения различных характеристик: Рис.2 и SI Приложение , Рис. S3 показывают своды, Рис. 3 и SI Приложение , Рис. S4 – S6 показывают префагофорные секвестосомы. Рис. 4 и SI Приложение , Рис. S7 и S8 показывают комплексы секвестосома: фагофор, рис. 5 и приложение SI, приложение , рис. S10 и S11 показывают аутофагосомы, а фиг. 6 и SI Приложение , фиг. S12 показывают аутофагические вакуоли. Опять же, для ясности и простоты, эти панели рисунков следуют последовательному шаблону: первая панель показывает наложение флуоресцентного изображения с желтым каналом (показывающее расположение YFP-rhTRIM5α) на срезе xy крио-томограммы, вторая На панели показан тот же срез крио-томограммы без флуоресценции, на третьей панели показана цветовая сегментация трехмерной клеточной ультраструктуры, выявленной на криотомограмме, а на четвертой панели показан увеличенный вид ключевых структур, представляющих интерес, иногда меняют на более полезную перспективу.В некоторых случаях показаны дополнительные панели или рисунки, чтобы выделить другие важные выводы. Два фильма, показывающие процесс корреляции, с криотомограммами и трехмерными сегментами событий, показанными на рис. 3 и SI Приложение , рис. S6 и S9 и рис. 7 представлены как фильмы S1 и S2 соответственно. Мы также включили девять дополнительных фильмов для поддержки Рис. 4 (Фильмы S3 и S4), Рис. 5 (Фильм S5), Рис. 6 (Фильм S6), SI Приложение , Рис. S5 (Фильм S7), SI Приложение , рис.S7 (Фильм S8), SI Приложение , Рис. S8 (Фильм S9), SI Приложение , Рис. S10 (Фильм S10), SI Приложение , Рис. S11 (Фильм S11). Предварительный рисунок на рис. 3 иллюстрирует цветовой код, используемый в сегментах для маркировки различных органелл.

Рис. 2.

Хранилища комплексов. ( A ) Крио-CLEM, показывающий флуоресцентные тельца YFP-rhTRIM5α, локализующиеся около комплексов хранилища. Зеленая стрелка в B указывает на комплекс хранилищ. (Масштаб: 150 нм.) ( B ) ( Врезка ) Увеличенный вид хранилища вместе с кристаллической структурой (идентификационный код 4V60 банка данных белка [PDB]) (49) комплекса хранилища.(Масштаб: 30 нм.)

Рис. 3.

Секвестосомы коррелируют с флуоресцентными тельцами YFP-rhTRIM5α в клетках HeLa, обработанных MG-132. ( A ) Крио-CLEM-сигнал YFP-rhTRIM5α, наложенный на срез крио-томограммы, показывающий соответствующее местоположение. ( B ) Тот же срез крио-томограммы, что и в A , с границей секвестосомы, выделенной черной пунктирной линией. Красная стрелка выделяет границу цитоплазма: секвестосома, оранжевая стрелка выделяет границу митохондрия: секвестосома, а синяя стрелка выделяет ER в непосредственной близости от секвестосомы.(Масштабные полосы в A и B : 200 нм.) ( C ) Трехмерная сегментация функций, выделенных в B . См. Предварительную настройку для цветовой схемы. Две белые стрелки указывают на гексагональный клатрин на плазматической мембране. ( D ) Увеличенный вид области, обозначенной белой пунктирной рамкой в ​​ C , выделяющей ER, секвестосому и гексагональный клатрин, без актиновых филаментов. Здесь и на всех последующих рисунках и рисунках SI Приложение клеточные структуры обозначены следующим образом: ER, эндоплазматический ретикулум; М - митохондрия; AV, аутофагическая вакуоль; МВБ, мультивезикулярное тело; V - пузырек; MT, микротрубочка; Р - фагофор; А, актиновые филаменты; F, филоподий; и AP, аутофагосома.

Рис. 4.

Cryo-CLEM выявляет флуоресцентные тельца YFP-rhTRIM5α, локализованные в цитозольном комплексе секвестосома: фагофор в тесной связи с ER и гексагональной сеткой. ( A ) Крио-CLEM-сигнал YFP-rhTRIM5α, наложенный на криотомографический срез, показывающий соответствующее местоположение в клетке, обработанной MG132. ( B ) Тот же криотомографический срез, выделяющий фагофор и секвестосому. Синие стрелки указывают на тесную близость между крайними концами фагофора и ER.( C ) Трехмерная сегментация объектов в B . ( D ) Увеличенный вид отверстия фагофора, прикрепленного к мембране ЭР тросами с обеих сторон (красная изоповерхность). ( E и G ) Различные криотомографические срезы, показывающие увеличенные виды области, обозначенной зеленой пунктирной рамкой в ​​ B , с выделением отверстия фагофора, прикрепленного к мембране ER несколькими тросами (белые двуглавые стрелки). Красные стрелки выделяют связи между внешней поверхностью фагофора и мембраной ER.Указаны размеры плотностей. ( F и H ) Немаркированные виды срезов в E и G. (шкалы: 100 нм.) ( I , K и M ) Криотомографические срезы фагофор, показывающий гексагональные сети TRIM5α, обнаруженные внутри просвета фагофора. Шестиугольники выделены звездочками, чтобы помочь идентифицировать многоугольники в решетке. ( J , L и N ) Непомеченные виды одних и тех же срезов.(Масштаб: 100 нм.)

Рис. 5.

Cryo-CLEM выявляет флуоресцентные тельца YFP-rhTRIM5α, локализованные на аутофагосоме, содержащей хранилище. ( A ) Крио-CLEM-сигнал YFP rhTRIM5α, наложенный на криотомографический срез, показывающий соответствующее местоположение в необработанной клетке. ( B ) Тот же криотомографический срез без наложенной флуоресценции. Желтой стрелкой выделено хранилище. (Масштаб: 250 нм.) ( C ) Трехмерная сегментация элементов в B с наложенной кристаллической структурой хранилища (код PDB ID 4V60).( D ) Увеличенный вид аутофагосомы, показанной на C .

Рис. 6.

Cryo-CLEM выявляет флуоресцентные тельца YFP-rhTRIM5α, локализованные в аутофагических вакуолях, а аутофагические вакуоли содержат своды. ( A ) Крио-CLEM-сигнал YFP-rhTRIM5α, наложенный на криотомографический срез, показывающий соответствующее местоположение в необработанной клетке. ( B ) Тот же криотомографический срез без наложенной флуоресценции. Граница охваченной секвестосомы выделена синей линией.(Масштаб: 250 нм.) ( C ) Трехмерная сегментация элементов в B . ( D ) Увеличенный вид аутофагической вакуоли, обведенной синим цветом, с наложенными кристаллическими структурами комплекса хранилища (код PDB ID 4V60).

Рис. 7.

Фагофоры в ассоциации с гексагональной решеткой TRIM5α коррелируют с флуоресцентными телами YFP-rhTRIM5α. ( A ) Криотомографический срез, показывающий основание фагофора. Синие стрелки подчеркивают близость между крайними концами фагофора и ER.( B ) Другой криотомографический срез, показывающий кончик фагофора. (Масштабные полосы в A и B: 250 нм.) ( C ) Трехмерная сегментация функций, выделенных в B . ( D ) Увеличенный вид гексагональной решетки TRIM5α, показанной на C . ( E ) Криотомографический срез, показывающий гексагональную сетку TRIM5α, расположенную в цитоплазме. Красная стрелка выделяет цитоплазму: поверхность гексагональной сети TRIM5α, а оранжевая стрелка выделяет митохондрию в непосредственной близости от гексагональной сети TRIM5α.(Масштаб: 100 нм.) ( F ) Преобразование Фурье цитозольного гексагонального TRIM5α. ( G ) Увеличенное изображение области, обозначенной желтыми пунктирными прямоугольниками в A , B и D , на котором выделены крайние концы фагофора, привязанного к мембране ER посредством плотностей белков, подобных плечу TRIM5α. ( H ) Увеличенный вид области, обозначенной красной пунктирной рамкой в ​​ G , подчеркивающей отверстие фагофора, прикрепленного к мембране ER двумя тросами.Указаны размеры рычажных плотностей. (Масштаб: 100 нм.)

Этап 1: Совместная локализация субстрата.

На 5 из 45 крио-томограмм флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α не было обнаружено ни одного из вышеупомянутых признаков аутофагии, и сцена была просто типичной цитоплазмой (как в контроле). Наша интерпретация этого открытия состоит в том, что аутофагия начинается с колокализации субстрата, достаточной для образования флуоресцентной точки, но без структурных особенностей, распознаваемых крио-ET.

Этап 2: Комплексы-хранилища.

Хранилища с их уникальной и легко узнаваемой морфологией были замечены на 8 из 45 полных крио-томограмм. Поскольку на контрольных криотомограммах клеток HeLa, не экспрессирующих YFP-rhTRIM5α, своды не наблюдались, мы пришли к выводу, что своды являются признаком пути аутофагии, а не просто повсеместно присутствуют в цитоплазме. Своды были видны только на крио-томограммах (без каких-либо видимых признаков аутофагии) и на всех других стадиях (с секвестосомами, фагофорами и аутофагосомами и внутри аутофагических вакуолей).Учитывая очень значимое обнаружение хранилищ, появляющихся только в двух случаях (показано на рис. 2 и SI, приложение , рис. S3), и не на контрольных криотомограммах, но и на всех других стадиях аутофагии ( P <0,004) , мы интерпретируем эти две крио-томограммы как отражающие ранние стадии аутофагии и заключаем, что хранилища рекрутируются до образования видимых секвестосом.

Стадия 3: префагофорные секвестосомы.

Восемнадцать из 45 флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α, совместно локализованных с дезорганизованными белковыми агрегатами посреди неструктурированной цитоплазмы, которые можно было распознать как по их уникальной структуре плотностей, напоминающих точки, так и по исключению органелл и везикул.Мы применили сверточную нейронную сеть для объективной идентификации и аннотирования рибосом и микротрубочек и обнаружили, что они были исключены из агрегатов (рис. 3 B , красная стрелка и SI, приложение , рис. S4 и S5, а также видеоролики S1 и S7. ). Агрегаты не были окружены мембранами, хотя другие органеллы находились поблизости. Хранилища были замечены встроенными в агрегаты ( SI Приложение , рис. S4). Более ранние корреляционные иммунофлуоресцентные / ЭМ-анализы фиксированных и окрашенных клеток HeLa выявили YFP-rhTRIM5α-связанный белок p62 (26) в безмембранных компартментах (16), а центральный агрегатоподобный компонент структуры был назван секвестосомой.По этой причине мы также называем наши агрегаты секвестосомами.

Предыдущая работа показала, что микротрубочки необходимы для подвижности TRIM5α (11), и мы обнаружили микротрубочки в тесной ассоциации с секвестосомами на наших криотомограммах. В некоторых случаях микротрубочки были параллельны большему размеру секвестосом, как если бы секвестосомы, возможно, двигались вдоль микротрубочек и формировались за счет столкновений с другим материалом (Рис. 3). Во многих случаях секвестосомы также были окружены структурами F-актина (рис.3, SI, приложение , рис. S5 и Movie S7) или содержали эти структуры ( SI, приложение , рис. S6 и Movie S1). Пять из этих секвестосом также оказались очень близко к канальцам и митохондриям ER (Рис. 3 и SI Приложение , Рис. S5 B , синие стрелки). Однако, учитывая, что все криотомограммы были записаны на периферии клетки, неудивительно, что мы обнаружили кортикальный актин, микротрубочки, ER и митохондрии. Действительно, примерно 50% наших контрольных криотомограмм содержали кортикальный актин, микротрубочки, ER и митохондрии.Поэтому не исключено, что секвестосомы оказались рядом с этими структурами просто случайно.

Стадия 4: фагофорные комплексы.

Пять из 45 визуализированных флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α коррелировали с секвестосомами с фагофорами поблизости (рис. 4, SI, приложение , рис. S7 и S8, и фильмы S3, S4, S8 и S9). Мы идентифицировали фагофоры на наших криотомограммах как уплощенные везикулы вблизи флуоресценции YFP-rhTRIM5α с размерами, аналогичными или меньшими, чем у секвестосом.Только на одной контрольной криотомограмме клеток HeLa, не экспрессирующих YFP-rhTRIM5α, была обнаружена подобная уплощенная структура, подобная фагофору. Различные морфологии и размеры фагофоров, визуализированные на наших криотомограммах, предполагают, что они представляют разные стадии биогенеза фагофоров. Некоторые из наблюдаемых нами фагофоров обладали архитектурой, подобной структуре омегасом, предложенной Axe et al. (27) (рис. 4 и 7 и приложение SI, приложение , рис. S8). Секвестосомы в этих фагофорных комплексах были подобны по текстуре и размеру префагофорным секвестосомам.Опять же, хранилища присутствовали, встроенные в секвестосому ( SI Приложение , рис. S7 и S8). Мы также наблюдали предполагаемые фагофоры без четких секвестосом поблизости (рис. 7). Все наши фагофоры находились в непосредственной близости от ER, и, что удивительно, в некоторых случаях мембрана ER прилегала к большой площади внешней мембранной поверхности фагофора (рис.4 и 7 и приложение SI, приложение , рис. S8). ). Однако мы не наблюдали какой-либо ультраструктуры, в которой мембрана фагофора является продолжением субдомена ER или сидит между двумя цистернами ER в архитектуре, подобной «колыбели» (28, 29).Однако в двух криотомографических примерах на рис. 4 и 7, мы наблюдали четыре отдельные точки контакта между концами фагофоров и мембраной ER, три из которых были соединены двумя четкими палочками плотностей длиной от 16 до 21 нм (рис. 4 E и F , белые двойные стрелки и 7 G и H ). В криотомографическом примере, показанном на рис.4, мы также наблюдали три плотности длиной около 18 нм, привязанные между внешней поверхностью фагофора и мембраной ER (рис.4 E - H , красные двойные стрелки).

На трех криотомограммах фагофорных комплексов в цитоплазме вблизи фагофора наблюдались гексагональные сетки с шагом решетки ~ 29 нм (центр одного шестиугольника к центру следующего). Самая большая сетка покрывала площадь поверхности ~ 500 нм 2 и была хорошо упорядочена (рис. 7 и Movie S2). Эта сеть возникла в непосредственной близости не только от секвестосомы, но и от митохондрий, ЭПР и концов мембраны фагофоров.Шаг решетки этой сетки и сетки, образованной очищенными гексамерами TRIM5α (4), был очень похож: ~ 29 нм in vivo и ~ 33 нм in vitro (рис. 8). В другом случае мы наблюдали меньшую гексагональную решетку внутри просвета (рис. 4 и видеоролики S3 и S4). Опять же, шаг решетки этой сетки и сетки, образованной очищенными гексамерами TRIM5α (4), был очень похожим: ~ 29 нм in vivo и ~ 33 нм in vitro. В некоторых случаях мы также наблюдали гексагональные решетки с большим шагом, ∼35 нм, расположенные на внутренней поверхности плазматической мембраны (рис.3, SI Приложение , рис. S9, черные кружки и фильм S1). На основании шага их решетки и расположения на плазматической мембране, которые соответствуют гексамерам трискелионов, которые мы визуализировали на плазматической мембране в предыдущем исследовании (рис. 8 G - L ) (30), мы интерпретируем эти структуры как клатрин. В отличие от клатрина, меньшие 29-нм сети, которые мы наблюдали в сигналах флуоресценции YFP-rhTRIM5α, были зажаты между клеточным материалом, таким как рибосомы и микротрубочки, а не на плазматической мембране (Movie S2).Сети 29 нм также не были в окружающих пузырьках, как можно было бы ожидать для внутриклеточного клатрина, а скорее находились в цитоплазме, либо не связанные с какой-либо мембраной, либо обнаруженные между канальцами ER. Поскольку их шаг решетки совпадает с решетками TRIM5α in vitro, и они совместно локализованы с флуоресценцией YFP-rhTRIM5α, мы заключаем, что они являются YFP-rhTRIM5α.

Рис. 8.

Гексагональный клатрин и TRIM5α имеют разный период решетки. ( A и D ) Криотомографические срезы, показывающие цитоплазматический гексагональный TRIM5α внутри клетки HeLa и двумерную гексагональную решетку очищенного TRIM5α-21R, соответственно.( B и E ) Соответствующие преобразования Фурье. Расстояния между тремя пиковыми пикселями были измерены для вычисления среднего шага решетки, показанного в C и F . Подробности приведены в разделе "Методы". Точность измерения составляет ± 2 нм, что соответствует размеру пикселя криотомограммы. ( G и J ) Криотомографические срезы, показывающие гексагональный клатрин внутри клетки HeLa и клетки адипоцита, соответственно. ( H и K ) Соответствующие преобразования Фурье.Расстояния между тремя пиковыми пикселями были измерены для расчета среднего расстояния, показанного в I , и двух пиковых пикселей для среднего расстояния в L. (шкала: 50 нм.) Синие круги в B , E , H и K соответствуют плоскостям решетки с самым низким разрешением, обозначенным синими линиями в C , F , I и L . Оранжевые кружки в E и K соответствуют векторам, указанным в F и L .Эти пики отсутствовали в B и H . ( J ) Изображение получено с крио-томограммы, ранее записанной в лаборатории Дженсена и описанной в исх. 30.

Этап 5: Аутофагосомы.

Семь флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α, совместно локализованных в двухмембранные везикулы (Рис. 5, SI Приложение , Рис. S10 и S11, и Фильмы S10 и S11). Только одна контрольная криотомограмма показала аналогичную структуру. Мы интерпретируем их как аутофагосомы, органеллы, образованные расширением и слиянием крайних концов фагофора.Мембраны аутофагосом демонстрируют различные межмембранные пространства, некоторые из которых имеют большие промежутки, лишенные макромолекулярного материала, такие как рибосомы или микротрубочки ( SI Приложение , Рис. S10). Текстура материала внутри аутофагосом была такой же, как у цитоплазматических секвестосом, описанных ранее, за исключением отсутствия филаментов. Своды также были замечены внутри аутофагосом (рис. 5).

Стадия 6: аутофагические вакуоли.

На двух криотомограммах мы видели большие (~ 700 нм) везикулы, включающие три или более везикулы среднего размера (~ 300 нм) и различные клеточные остатки, такие как филаменты и маленькие (~ 40 нм) везикулы (рис.6). В этих двух случаях флуоресценция YFP-rhTRIM5α локализовалась специфически в одной из везикул среднего размера. Внутренние части этих конкретных пузырьков (которые коррелировали с YFP-rhTRIM5α) имели ту же текстуру, что и цитоплазматические секвестосомы, и они содержали своды (Рис. 6, SI Приложение , Рис. S12 и Movie S6). Мы интерпретируем большие везикулы как аутолизосомы или амфисомы, а заполненные YFP-rhTRIM5α везикулы среднего размера как остатки аутофагосом после того, как их внешние мембраны слились с лизосомами или ранними / поздними эндосомами, соответственно.

Discussion

Используя cryo-CLEM / cryo-ET, мы обнаружили, что экзогенный YFP-rhTRIM5α колокализуется с шестью различными стадиями аутофагических структур. Сделав это наблюдение, мы затем искали и нашли существенные доказательства этого в литературе (31). SI Приложение , Таблица S1 суммирует многочисленные статьи, которые документируют ассоциацию белков TRIM5α с белками, связанными с аутофагией.

Мы обнаружили, что хранилища рекрутируются на ранней стадии аутофагии и что YFP-rhTRIM5α может формировать протяженные гексагональные сети in vivo.Мы показываем, что неповрежденные хранилища можно увидеть внутри пути аутофагии. Мы подозреваем, что эти хранилища, вероятно, содержат MVP, TEP1 и сводную поли (ADP-рибозу) полимеразу и функционируют как специализированные регуляторные отсеки высвобождения для воздействия на путь аутофагии некодирующих РНК хранилища (20).

Наши результаты относятся к нескольким различным работам в литературе. Во-первых, наши результаты подтверждают недавний отчет Fletcher et al. (32), демонстрирующие существование двух популяций цитоплазматических тельцов TRIM5α внутри клеток: гексагональных сигнальных решеток и несигнальных агрегатов.Мы видели как протяженные гексагональные решетки, так и агрегаты. Fletcher et al. показали, что единичная точечная мутация в B-бокс-домене (R119E) huTRIM5α предотвращает его образование цитоплазматических флуоресцентных телец или ограничение ретровирусной инфекции, предполагая, что предварительно сформированные тримерные комплексы внутри цитоплазматических флуоресцентных телец необходимы для ограничения вируса (32, 33). Наши данные подтверждают эту модель, потому что здесь мы доказываем прямым отображением, что TRIM5α на самом деле может образовывать протяженные гексагональные решетки внутри ячеек.

Хотя были видны только три прозрачные шестиугольные сети, технические ограничения могли помешать нам распознать другие шестиугольные сети, которые присутствовали. Например, поскольку сети являются гибкими, если они слишком искажены, их может быть трудно распознать. Точно так же, если сети не плоские, их трудно распознать, потому что мы можем смотреть глазами только на одну плоскость на экране компьютера, а 3D-сегментация не всегда работает хорошо из-за скопления людей и размытия в направлении. недостающего клина.Наконец, четкость крио-томограмм уменьшается с увеличением толщины образца, что затрудняет распознавание сеток в толстых областях ячейки. Некоторые из этих ограничений могут быть смягчены в будущем за счет использования более тонких типов клеток или создания более тонких образцов внутри тела клетки путем измельчения крио-сфокусированным ионным пучком.

К сожалению, наши изображения не показывают, что именно делают шестиугольные сети. Исследования флуоресценции показали, что сверхэкспрессированный GFP-меченый человеческий TRIM5α (GFP-huTRIM5α) локализуется с DFCP1 и ULK1, двумя ранними регуляторами инициации аутофагии, и LC3B, ключевым игроком в биогенезе фагофоров (34, 35).Недавно была решена кристаллическая структура B-бокса TRIM5α и областей coiled-coil в комплексе с LC3B, предполагая, что этот контакт является специфическим и функциональным (36).

Множество различных рецепторов используется для распознавания и секвестрации материала, который должен быть разрушен макроаутофагией (37, 38). Одним из таких рецепторов является убиквитин-связывающий секвестосомный белок p62, также известный как SQSTM1. Интересно, что TRIM5α, как было показано, образует комплексы и локализуется с p62 внутри клеток (26, 31, 35).Mandell et al. недавно продемонстрировали, что около 50% TRIMs модулируют аутофагию не только действуя как рецепторы, но также формируя молекулярный каркас, названный TRIMosome (35, 39, 40). Наша локализация флуоресцентных телец YFP-rhTRIM5α в сайтах биогенеза фагофоров согласуется со всеми этими находками, и наши находки, что TRIM5α может образовывать гексагональные сети вокруг этих сайтов, поддерживает представление о том, что он может действовать как каркас. Следовательно, мы считаем, что причина, по которой мы не видим гексагональные решетки на стадиях 1, 2, 3, 5 или 6 и видим их только на стадии 4, заключается в том, что олигомеризованная форма TRIM5α существует только во время образования фагофоров, когда она активна.Тем не менее, мы хотели бы отметить, что этот вывод все еще является спекулятивным, поскольку он исходит из небольшого числа наблюдений сверхэкспрессированного / сконструированного белка TRIM5α. Дальнейшие исследования, чтобы подтвердить это и отобразить больше гексагональных решеток на сайтах образования фагофоров, могут включать использование физиологически релевантных уровней YFP-TRIM5α с многоцветным крио-CLEM для специфического нацеливания на стадию 4 с использованием колокализованных точек YFP-TRIM5α и LC3B-RFP.

Что касается агрегатов, то в клетках млекопитающих различают по крайней мере два типа компартментов агрегации: агресома (41, 42) и агресомоподобная индуцированная структура (ALIS) (43, 44).В отличие от наших агрегатов YFP-rhTRIM5α, агресомы сохраняются только в одной или двух копиях на клетку в центре организации микротрубочек рядом с ядром и окружены виментином. Было показано, что ALIS формируется путем агрегации вновь синтезированных убиквитинированных белков и индуцируется различными клеточными стрессорами, включая пуромицин и окислительный стресс (44). ALIS также временны и обнаруживаются по всей клетке. Предыдущие сообщения показали, что p62 необходим для их образования (44⇓-46), и больше ALIS формируется, когда p62 активируется (47).Действительно, ALIS неотличимы от секвестосом p62 (45). Следовательно, основываясь на этих сходствах, мы предполагаем, что наши агрегаты YFP-TRIM5α, скорее всего, являются ALIS, а не агресомами. Точечные плотности в наших агрегатах предположительно представляют собой неправильно свернутый белок, включая YFP-rhTRIM5α (32).

Наши данные содержат трехмерные изображения предполагаемых фагофоров на разных стадиях их роста. Поразительно, что на наших крио-томограммах мы не увидели ультраструктуру, подобную ранее описанной колыбели субдомена ER (28).Отсутствие колыбели омегасом на наших криотомограммах указывает на то, что либо мы визуализировали другой путь макроаутофагии, либо омегасома была артефактом традиционных препаративных методов (48). Будущая работа cryo-CLEM с мечеными белками, специфичными для образования омегасом, такими как DFCP1 (27), должна прояснить этот вопрос.

Материалы и методы

Клетки HeLa (клеточная линия 25) поддерживали в увлажненном инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2 , затем культивировали в среде DMEM без фенолового красного (Gibco), содержащей 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.Для крио-CLEM и крио-ET клетки высевали на покрытые фибронектином золотые сетки R2 / 2 London Finder Quantifoil с размером 200 меш (Quantifoil Micro Tools) при плотности 2 × 10 5 клеток / мл. После 12-часовой инкубации культуры обрабатывали MG-132 (1 мкг / мл) в течение 2–3 часов или оставляли без обработки перед погружением в жидкую смесь этан / пропан с использованием FEI Vitrobot Mark IV (21). Непосредственно перед замораживанием погружением на решетки наносили 3 мкл суспензии шариков. Суспензию шариков получали путем разбавления голубых (345/435 нм) полистирольных флуоросфер (Phosphorex) с размером 500 нм коллоидным раствором 20 нм золотых меток (Sigma-Aldrich), предварительно обработанных BSA.Золото служило реперными маркерами для реконструкции криотомограммы, а синие флуоросферы служили ориентирами для регистрации изображений флуоресцентной световой микроскопии (ФСМ) из разных каналов, а также крио-ЭМ изображений (24). Затем замороженные решетки загружали в картриджи FEI Polara EM. ЭМ-картриджи, содержащие замороженные сетки, хранили в жидком азоте и поддерживали при температуре ≤ -150 ° C на протяжении всего эксперимента, включая крио-ФСМ-визуализацию, крио-ЭМ-визуализацию, хранение и перенос.

Флуоресцентная визуализация и обработка изображений.

EM-картриджи были перенесены в крио-FLM-столик (FEI Cryostage), модифицированный для удержания картриджей Polara EM (14, 50), а затем установлены на инвертированный микроскоп Nikon Ti. Сетки получали с помощью воздушного объектива со сверхбольшим рабочим расстоянием 60 × (Nikon CFI S Plan Fluor ELWD 60 ×, NA 0,7, WD от 2,62 до 1,8 мм). Изображения были записаны с помощью камеры Neo 5.5 sCMOS (Andor Technology) с использованием модуля двумерной (2D) деконволюции deblur в реальном времени в программном обеспечении NIS Elements от AutoQuant (Nikon Instruments).Алгоритм двумерной деконволюции в реальном времени оценивает функцию рассеяния точки с использованием нескольких факторов, таких как толщина образца, уровни шума в изображении, вычитание фона и повышение контрастности. Все флуоресцентные изображения (отдельные каналы) были сохранены в 16-битном формате шкалы серого. YFP-rhTRIM5α визуализировали с помощью фильтра YFP, синие флуоросферы визуализировали с помощью фильтра DAPI, а красную автофлуоресценцию отображали с помощью фильтра mCherry.

Иммунофлуоресцентная визуализация и анализ изображений.

Для иммунофлуоресцентной визуализации клетки высевали на покрытые фибронектином золотые сетки R2 / 2 London Finder Quantifoil с размером 200 меш (Quantifoil Micro Tools) с плотностью ∼4 × 10 5 клеток / мл, помещенных на предметное стекло в 10-сантиметровые чашки Петри для культур клеток в течение 16 ч. Клетки фиксировали 3% формальдегидом в буфере PIPES и промывали PBS. Затем сетки и клетки переносили на новые стеклянные предметные стекла, и мембраны были проницаемы в увлажненном контейнере с блокирующей сывороткой осла с Triton-X100, окруженной кругами ручки PAP ∼4 мм в течение 20 мин.Инкубация с первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре в той же блочной сыворотке осла с последующими тремя промывками в PBS и инкубацией вторичных антител против Rb-TRITC в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем клетки трижды промывали PBS, содержащим краситель Hoechst. Монтажную среду Vectashield (VectorLabs) добавляли поверх сеток с последующим нанесением покровного стекла # 1.5H на сетки для визуализации.

Первичные антитела были следующими (разведение 1/100): SQSTM1 / p62 (Abcam; ab109012) и клон LC3B 12k5, ZooMAb (Sigma-Aldrich; ZRK100).Контролем служили антитело DCP1A (Abcam; ab183709) и RAB11 (Thermo Fisher Scientific; 71-5300). Вторичные антитела (разведение 1/500) представляли собой родамин (TRITC) AffiniPure goat anti-rabbit IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch).

Изображения были получены с помощью Nikon Ti-e2 с широким полем поля, оснащенного светодиодным источником света (Spectra X) и камерой PCO edge 4.2BI с использованием стандартных полихроичных и эмиссионных фильтров Chroma DAPI / GFP / TRITC / Cy5 для DAPI / GFP / TRITC. Изображения были деконволюционны с помощью FlowDec (https: // github.com / hammerlab / flowdec), а Z-проекции были проанализированы с помощью Icy версии 2.0.3 с использованием точечного детектора, студии колокализации и плагинов / модулей HK-means.

EM Imaging.

Крио-ЭМ сетки, ранее полученные с помощью крио-LM, были впоследствии получены с помощью крио-ЭТ с использованием просвечивающего электронного микроскопа FEI G2 Polara 300 кВ с ФЭГ, оснащенного энергетическим фильтром (ширина щели 20 эВ для большего увеличения; Gatan) и 4 k × 4 k K2 Прямой детектор Summit (Gatan) в режиме счета. Криотомограммы были также получены с использованием просвечивающего электронного микроскопа с автоэмиссионной пушкой FEI Titan Krios 300 кВ, оснащенного энергетическим фильтром Gatan, прямым детектором Gatan K3 в режиме счета и фазовой пластиной FEI Volta.

Во-первых, клеточные области, содержащие интересующие флуоресцентные тела в областях, которые обычно имели толщину от 200 до 500 нм, были обнаружены в ПЭМ с использованием методов, описанных ранее (24). Затем были записаны серии наклона этих областей с использованием программного обеспечения UCSF Tomography (51) или SerialEM (52) при увеличении 18000 × (Polara), 34000 × (Polara) или 34000 × (Titan Krios). Это соответствует размеру пикселя 6,167 Å, ​​3,260 Å и 2,678 Å соответственно на уровне образца и оказалось достаточным для данного исследования.Каждую серию наклона собирали от -60 ° до + 60 ° с шагом 1 ° или 2 ° в автоматическом режиме при недофокусировке от 5 до 10 мкм (Polara) и от 3 до 5 мкм (Titan Krios). Кумулятивная доза одной серии наклона составляла от 80 до 200 e - / Å 2 . Ряды наклона были выровнены и разделены на 4 в 1 k × 1 k с использованием программного пакета IMOD (53), а 3D-реконструкции были рассчитаны с использованием метода одновременной реконструкции, реализованного в программном пакете TOMO3D (54), или взвешенной обратной проекции с использованием IMOD. .Снижение шума выполнялось с использованием метода нелинейной анизотропной диффузии в IMOD (53), обычно с использованием значения K от 0,03 до 0,04 с 10 итерациями.

Анализ преобразования Фурье гексагональных сетей.

Fiji использовался для измерения расстояния между атомными плоскостями (синие линии на рис.8 C , F , I и L ), соответствующих пикам самого низкого разрешения (синие кружки) в шкале Фурье. преобразовать. Расстояние от исходной точки до центральных пикселей трех [полная сеть внутри клетки, полная сеть in vitro в Li et al.(4) и клатрин, изображенный в этом исследовании] или два [клатрин внутри клетки в Azubel et al. (30)] пики низкого разрешения в каждом преобразовании Фурье были измерены и усреднены для получения среднего значения. Индивидуальные значения составляли (28,92, 28,47, 28,65) для TRIM5α внутри клетки, (32,91, 32,29, 32,65) для очищенного TRIM5α-21R, (33,95, 35,15, 34,89) для клатрина внутри клетки HeLa и (34,19 и 35,09) для клатрин внутри клетки адипоцита. Если гексагональную решетку разбить на треугольники, как показано на рис.5 C , то это расстояние между плоскостями с самым низким разрешением соответствует 3 с. Расстояние между центрами двух соседних шестиугольников (2 h) можно рассчитать следующим образом: hs = cos 30 ° = 3/2 = 0,8662 h = 3 с

Эти расстояния, округленные до ближайшего целого числа, представлены на рис. 8.

Сегментация и построение изоповерхностей.

Сегментация и рендеринг изоповерхностей были выполнены в Amira (FEI). ER, фагофоры, аутофагосомы, аутофагические вакуоли, митохондрии и везикулы были сегментированы вручную с использованием порогового значения.Актиновые филаменты сегментировали с помощью Amira XTracing Extension в Amira (55, 56). Микротрубочки и рибосомы были сегментированы с использованием модуля машинного обучения tomoseg в EMAN2 (57, 58). Последовательности изображений фильмов были сгенерированы в формате JPEG в Amira (FEI) и IMOD, а затем преобразованы в фильмы с помощью QuickTime Player 7. Adobe Photoshop CS6 был затем использован для создания окончательных версий фильмов.

Доступность данных.

Все данные исследования включены в статью SI и Приложение .

Благодарности

Мы благодарим Сару Спид (Отдел биологии и биологической инженерии Калифорнийского технологического института) за ценную помощь в сегментировании криотомограмм и Кэтрин Ойконому (Отдел биологии и биологической инженерии Калифорнийского технологического института) за идеи и комментарии на рукописи. Эта работа была частично поддержана грантом NIH AI150464 (для G.J.J. и T.J.H.).

Сноски

  • Автор: С.D.C., J.I.M., T.J.H. и G.J.J. спланированное исследование; S.D.C. и J.I.M. проведенное исследование; S.D.C., J.I.M., T.J.H. и G.J.J. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; S.D.C., J.I.M., T.J.H. и G.J.J. проанализированные данные; и S.D.C. и G.J.J. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073 / pnas.13117 / - / DCSupplemental.

  • Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Коллекционная трубка Meeschaum с классической решетчатой ​​отделкой для яблока от Tobacco Paykoc M02041 L-трубка

Коллекционная трубка Meeschaum с классической решетчатой ​​отделкой для яблока от Tobacco Paykoc M02041 L-трубка
  1. Home
  2. Коллекционные предметы
  3. Tobacciana
  4. Трубки
  5. Meerschaum
  6. Meeschaum Classic Lattice Finish Apple Pipe от Tobacco Paykoc M02041 L

L Meeschaum Classic Lattice Finish Apple Pipe, Бесплатная доставка много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на трубку Meeschaum Classic Lattice Finish Apple Pipe от Tobacco Paykoc M02041 (L) по лучшим онлайн-ценам в, Покупайте в Интернете сейчас, Повышайте продажную цену, Наслаждайтесь возвратом в течение 365 дней, Покупайте часы в Интернете, Бесплатно Политика доставки и возврата 365 дней.Трубка Apple от Tobacco Paykoc M02041 L с классической решетчатой ​​отделкой Meeschaum, трубка с классической решеткой Meeschaum Apple Pipe от Tobacco Paykoc M02041 L.








: Торговая марка:: KOC IMPORTS, MPN:: M02041, Состояние :: Новое: Совершенно новый, неоткрытый, по лучшим онлайн-ценам на L, L, см. Подробную информацию в списке продавца . включая изделия ручной работы, Найдите много новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на трубку Meeschaum Classic Lattice Finish Apple Pipe от Tobacco Paykoc M02041, неиспользованную, UPC:: Не применяется, См. все определения условий: Страна / регион производства:: Турция , Бесплатная доставка для многих товаров, неповрежденный товар.

Трубка Meeschaum с классической решетчатой ​​отделкой из яблока от Tobacco Paykoc M02041 L


Трубка Meeschaum с классической решетчатой ​​отделкой из яблока от Tobacco Paykoc M02041 L


pawstrails.com Бесплатная доставка для многих продуктов. Найдите много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на трубку Meeschaum Classic Lattice Finish Apple Pipe от Tobacco Paykoc M02041 (L) по лучшим онлайн-ценам на сайте, Купить в Интернете сейчас, По цене со скидкой , Наслаждайтесь возвратом в течение 365 дней, покупкой часов в Интернете, бесплатной доставкой и политикой возврата в течение 365 дней.

Изготовление микрометрических суспендированных мембранных решеток из фотолюминесцентных и нефотолюминесцентных полимеров с помощью шаблона с помощью капиллярного испарения растворителя: применение для микротегирования , б представлена ​​двумерная решетка зеленых флуоресцентных суспендированных полимерных мембран размером ~ 4 мкм

2 , толщиной ~ 300 нм и плотностью 6.25 · 10 6 мембран / см 2 . Мембраны были приготовлены путем заливки 10 мкл раствора 1 мас.% F8BT 31, 32 в толуоле поверх кремниевого микроструктурированного шаблона, представляющего собой двумерный массив неплоскостных микротрубок с открытым концом со стороной ~ 2 мкм. , шаг 4 мкм, глубина 50 мкм (рис. 1д-1). Подробности изготовления шаблона приведены в дополнительной информации (рис. S1).

Рис. 1

Получение решеток высокой плотности микрометрических суспендированных мембран F8BT путем капиллярного испарения растворителя.( a , b , f , g ) Оптические изображения в светлом поле ( a ) и флуоресценции ( b , f , g ), показывающие вид сверху подвешенного F8BT мембранные решетки приготовлены путем капельного литья 10 мкл 1 мас.% раствора полимера на кремниевые микроструктурированные шаблоны с двумерными массивами микротрубок с открытым концом с шагом 8 ( f ), 4 ( a , b ) и 3 мкм. ( г ), со вставками, выделяющими область 10 × 10 мкм 2 .( c , d ) СЭМ-микрофотографии, показывающие вид с высоты птичьего полета ( c ) мембранной решетки, описанные в ( a , b ), со вставкой, выделяющей одиночную подвешенную мембрану при большем увеличении, и вид в разрезе ( d ), полученный в процессе фрезерования FIB, вдоль красной пунктирной линии в ( c ). ( e ) Эскиз, показывающий фазы формирования мембраны: (e-1) заполненные полимером микротрубки с открытым концом, возникающие в результате капиллярного потока, развивающегося вдоль труб от входа (вверху) к выходу (внизу), после заливки методом капельного литья. осаждение, (e-2) образование непрерывного полимерного слоя, покрывающего кремниевую микроструктуру, при испарении растворителя из раствора поверх микроструктуры, (e-3) поток менисков, движущихся назад при испарении растворителя из раствора внутри труб, (e -4) образование суспендированной полимерной мембраны на входе в открытые трубы после полного испарения растворителя.( h ) Флуоресцентное оптическое изображение, показывающее типичные μQR суспендированных мембран F8BT, полученных путем капельного литья 5 мкл 1 мас.% Раствора полимера, и вставка, показывающая увеличение одного μQR.

Испарение толуола из массива микротрубок при комнатной температуре и атмосферном давлении приводит к формированию фотолюминесцентных мембран F8BT на входе в трубу с помощью темплатов. Подвешенные мембраны хорошо различимы в виде ярко-зеленых квадратов на рис.1б (флуоресцентные изображения). Сильный контраст с областями, в которых F8BT покрывает микроструктуру кремния, обусловлен тушением фотолюминесценции (ФЛ) F8BT кремнием. Микрофотография вида с высоты птичьего полета на сканирующем электронном микроскопе двумерной решетки мембран F8BT на фиг. 1a, b представлена ​​на фиг. 1c. Мембраны кажутся гладкими и плоскими, равномерно закупоривая входной патрубок трубы на глубине прямо под верхней поверхностью кремния, которая соответствующим образом покрыта полимером. На вставке к рис.1c показывает одиночную мембрану F8BT при большем увеличении. СЭМ-микрофотография поперечного сечения образца на рис. 1c, полученная в процессе измельчения сфокусированным ионным пучком (FIB) после распыления хрома, показана на рис. 1d. Хорошо видны подвешенные мембраны, закупоривающие трубы на входе, с сопоставимой толщиной (~ 300 нм) и положением (~ 1000 нм сверху). Мембраны имеют форму двойного полумесяца с плоской центральной областью, прикрепленной к боковым стенкам трубы роговидными концами, направленными как вверх, так и вниз.Тонкий полимерный слой толщиной в несколько нанометров соответственно покрывает внутреннюю поверхность трубы.

Фазы образования мембраны схематически показаны на рис. 1e для случая F8BT, хотя можно предположить, что это справедливо для различных полимеров, как показано ниже. После капельного литья полимерного раствора поверх кремниевого микроструктурированного шаблона устанавливается полный режим смачивания благодаря хорошей смачиваемости органических растворителей на высокоэнергетических поверхностях, таких как кремний 33 .Все трубы в массиве полностью заполнены полимерным раствором по всей своей длине благодаря капиллярному потоку, который развивается вдоль труб с открытым концом от их входа (вверху) к выходу (внизу) и останавливается на выходе трубы (внизу). ), где мениски потока встречаются с внезапным увеличением поперечного сечения трубы (Рис. 1e-1). Это явление, хорошо известное в плоской микрофлюидике, типично для пассивных капиллярных запорных клапанов, где барьер давления, возникающий при резком расширении поперечного сечения канала, используется для остановки потока жидкости 34, 35, .В данном случае шаблон был разработан таким образом, чтобы иметь двухмерное расположение пассивных капиллярных запорных клапанов, работающих в направлении вне плоскости, таким образом расширяя концепцию от единственного капиллярного запорного клапана, установленного в плоскости, до множества неплоскостных запорных клапанов. капиллярные запорные клапаны. Эта конструкция вне плоскости не влияет на работу запорного клапана, поскольку в микрофлюидике эффекты поверхностного натяжения (т.Одним из основных недостатков капиллярных запорных клапанов является отсутствие барьера, препятствующего испарению жидкости, что становится проблемой в длительных экспериментах или если нагревание является частью процесса. 37 . И наоборот, в предлагаемом способе приготовления мембраны испарение растворителя представляет собой решающий важный этап.

Общий объем массива трубок (~ 1 мкл) значительно меньше, чем объем капельного литья, и большая часть раствора покрывает верхнюю часть кремниевого шаблона после литья (рис.1e-1). Граница раздела жидкость-воздух, представляющая поверхность обмена, доступную для испарения растворителя, с одной стороны, является непрерывной и такой же шириной, как вся микрообработанная область наверху шаблона, с другой стороны, она состоит из двумерного массива менисков, прикрепленных к выход (низ) труб с открытым концом (рис. 1д-1). Из-за большей протяженности границы раздела жидкость-воздух в верхней части микроструктуры по сравнению с нижней частью испарение растворителя происходит с большей скоростью на первой. Это приводит к тому, что полимерные цепи с произвольной ориентацией плотно упаковываются и образуют непрерывный полимерный слой, покрывающий микроструктурированную поверхность, как только толуол полностью испаряется сверху (желтый слой на рис.1e-2). На этом этапе допускается испарение раствора, оставшегося внутри труб, как из выходов (внизу), так и из входов (вверху), происходящее в последних через плотные сетки полимерных цепей, закупоривающих, по крайней мере, частично, вход в трубу. Скорость испарения теперь выше внизу и заставляет мениски потока двигаться назад от выхода к входу труб, оставляя полимерное покрытие на стенках трубы (рис. 1e-3). По мере испарения растворителя концентрация полимера в растворе, оставшемся внутри труб, увеличивается, и, в конечном итоге, полное испарение растворителя приводит к образованию суспендированной полимерной мембраны на входах труб с открытым концом, таким образом обнаруживая двумерную решетку полимера. мембраны (рис.1e-4).

Основным элементом формования суспендированных полимерных мембран с помощью темплата оказывается капиллярный запорный клапан. Для подтверждения этого утверждения были проведены как отрицательные (массив труб с закрытым концом, рис. S1a-3), так и положительный (массив, объединяющий как сквозные трубы с открытым концом, так и трубы с закрытым концом, рис. S1a-4ii) контрольные эксперименты. Трубы в контрольных экспериментах имели такие же размер, шаг и длину, что и на рис. 1, и были отлиты с использованием таких же (объем и концентрация) растворов полимера F8BT.Что касается отрицательного контроля, испарение растворителя не приводит к образованию мембран. Фактически, в трубах с закрытым концом растворитель может испаряться только через входное отверстие (вверху) через сетку полимерной цепи, так что мениски потока раствора полимера постепенно перемещаются сверху вниз. В конечном итоге полное испарение растворителя приводит к образованию толстого полимерного слоя на дне труб с закрытым концом. Фазы испарения растворителя во время экспериментов с отрицательным контролем схематически изображены на рис.S2a. На рис. S2b – e показаны вид сверху и поперечное сечение оптического микроскопа как в светлом поле (рис. S2b, c, соответственно), так и при флуоресценции (рис. S2d, e, соответственно) решетки труб с закрытым концом после F8BT. капельное литье и последующее испарение растворителя. На изображениях вида сверху суспендированные полимерные мембраны не видны, на что также указывает отсутствие флуоресценции, тогда как толстый полимерный слой остается на дне труб с закрытым концом, что видно на изображениях поперечного сечения. Что касается положительного контроля, испарение растворителя приводит к образованию решетки из суспендированных полимерных мембран только на входе в проходные трубы с открытым концом.Фазы образования мембраны во время экспериментов с положительным контролем схематически показаны на рис. 2а. На рис. 2b, c показаны изображения вида сверху как в светлом поле (рис. 2b), так и при флуоресценции (рис. 2c) с помощью оптического микроскопа двумерного массива подвешенных мембран F8BT, сформированных на входе сквозных труб с открытым концом. На рис. 2d, e показаны изображения вида сверху как в светлом поле (рис. 2d), так и при флуоресценции (рис. 2e) при помощи оптического микроскопа пограничной области между сквозным проходом с открытым концом (справа) и закрытым концом (слева). сторона) трубы.Как уже наблюдалось в экспериментах с отрицательным контролем, в трубках с закрытым концом, встроенных в силиконовый шаблон, не наблюдается образования мембран (рис. 2d, слева) и, как следствие, эмиссии флуоресценции (рис. 2e, слева). рядом с открытыми проходными трубами.

Рисунок 2

Приготовление микрометрических подвешенных решеток мембраны F8BT на открытых проходных микротрубках. ( a ) Схема, показывающая фазы формирования мембраны в кремниевых микроструктурированных шаблонах, включающих как закрытые, так и открытые сквозные микротрубки, приводящие к образованию взвешенных мембран только на этих последних (образцы положительного контроля): (a-1) полимер картина инфильтрации в результате капельного осаждения 10 мкл раствора полимера с 1 мас.% F8BT на кремниевые микроструктурированные шаблоны с двумерным массивом сквозных микротрубок как с закрытым, так и с открытым концом, что также подчеркивает принцип работы запорного клапана. место в сквозных микротрубках с открытым концом и полное заполнение микротрубок с закрытым концом, (а-2) образование сплошного полимерного слоя поверх кремниевого микроструктурированного шаблона при испарении растворителя из раствора поверх шаблона, ( а-3) испарение растворителя, вызывающее движение менисков потока либо вниз в микротрубках с закрытым концом, либо назад в сквозных микротрубках с открытым концом, (а-4) суспендированная полимерная мембрана f образование на входе микротрубок с открытым концом и толстый полимерный слой, осаждающийся на дне микротрубок с закрытым концом после полного испарения растворителя.( b - e ) Светлопольные ( b , d ) и флуоресцентные ( c , e ) оптические изображения вида сверху, полученные в области с открытыми проходными микротрубками (b , c) и на границе между микротрубками с открытым концом (справа) и микротрубками с закрытым концом (слева) (d, e) показаны суспендированные мембраны F8BT, сформированные на входе микротрубок с открытым концом после сброса. литье осаждения 10 мкл раствора полимера с 1% масс. F8BT на кремниевый шаблон, как показано в ( a ).

Формирование суспендированных полимерных мембран также с использованием шаблонов с массивами сквозных труб, которые полностью открыты на своем дне, позволяет исключить возможные эффекты кремниевой подложки под трубами, в то же время расширяя область применения предлагаемого метода приготовления, например на фильтрацию и освещение 38, 39 .

Характеристика решеток высокой плотности микрометрических подвешенных мембран F8BT

Гибкость, надежность и производительность процесса формирования мембран исследованы путем изготовления массивов суспендированных мембран F8BT с различной плотностью и размером мембран с использованием кремниевых микроструктурированных шаблонов с двумерными массивами трубы открытого типа с шагом от 8 до 3 мкм (рис.S1b). Капельное литье 10 мкл 1 мас.% F8BT в толуоле и последующее испарение растворителя приводят к образованию двумерных решеток фотолюминесцентных полимерных мембран с разницей примерно на один порядок величины (то есть в 7 раз) в обеих плотностях, от 1,5 · 10 6 до 11 · 10 6 мембран / см 2 и размер одной мембраны от ~ 14 до ~ 3 мкм 2 . Флуоресцентные изображения подвешенных решеток мембраны F8BT (при увеличении 50 × на рис. 1b, f, g и 20 × на рис. S3a – c) показывают высокую однородность процесса приготовления на больших площадях, независимо от плотности и размера полимера. мембраны.На вставках к рис. 1b, f, g показаны детали суспендированных мембран F8BT на площади 10 × 10 мкм 2 . Примечательно, что излучение ФЛ кажется хорошо локализованным в соответствии с мембранами F8BT с высоким отношением сигнал / шум (S / N ~ 255 в соотношении уровней пикселей) благодаря тому факту, что излучение полимера на кремнии полностью подавляется кремнием. Выход процесса подготовки приближается к 100%, рассчитанный как количество образованных мембран по отношению к количеству труб, имеющихся на площади 900 × 900 мкм 2 и рассчитанный для 3 различных образцов (средние значения и стандартное отклонение (sd) 97 ± 2%, 96 ± 4% и 98 ± 1% для решеток с шагом 8, 4 и 3 мкм соответственно).

Дальнейшие эксперименты были проведены на решетках мембран F8BT с шагом 3 мкм, которые имеют меньший размер мембраны и более высокую плотность мембраны, чтобы исследовать возможное влияние различных объемов капельного литья на процесс приготовления. Помимо 10 мкл, были протестированы объемы 20 мкл и 5 мкл раствора полимера. Примечательно, что процесс приготовления подтвержден как высокоэффективный как для увеличения, так и для уменьшения объема капли, что приводит к выходу приготовления ~ 100% мембран, сформированных на площади 900 × 900 мкм 2 и рассчитанных на 3 различных образцах.На рисунке S3d – f показаны флуоресцентные изображения при 50-кратном увеличении решеток мембран F8BT, сформированных путем капельного литья различных объемов раствора полимера на кремниевые микроструктурированные шаблоны с решетками микротрубок с шагом 3 мкм.

Была проведена тщательная оптическая характеристика решеток мембран F8BT с шагом 3 мкм, образованных каплями 10 мкл раствора полимера, с целью исследования эмиссии ФЛ как в зависимости от угла сбора (от 0 ° до 70 °), так и рабочей температуры ( от 10 ° С до 150 ° С).В качестве контроля использовалась пленка F8BT толщиной 300 нм, нанесенная на плоский кремний. На рис. 3а показаны нормированные спектры фотолюминесценции в зависимости от угла сбора (рис. 3а-1, -2) и относительные контурные графики (рис. 3а-3, -4) пленок (рис. 3а-1, -3) и решетки мембран (рис. 3a-2, -4) вместе с графиком, сравнивающим спектрально интегрированные значения PL в зависимости от угла сбора как для пленок, так и для решеток мембран (рис. 3a-5). Очевидной разницы в форме линий спектров ФЛ между пленками и решетками мембран не наблюдается.Однако значительное и внезапное падение интенсивности света, собранного под углами ≥50 °, очевидно для решеток мембран по отношению к пленкам при сравнении как цветовых контурных графиков, так и спектров ФЛ. Рудиментарные элементы пирамидальной формы на входе в трубы, расположенные под углом 54,7 ° по отношению к поверхности кремниевой пластины 40 , обусловлены стадией травления гидроксидом калия (КОН) во время изготовления шаблона (рис. S1a-2). ), теневой свет, излучаемый под углом более 50 °. Соответственно, тогда как спектрально интегрированная ФЛ, возникающая от пленок F8BT (красные точки), лучше всего подходит (R 2 = 0.99) с функцией Ламберта (красная линия), возникающая из решеток мембран (синие квадраты), отклоняется от закона Ламберта при углах сбора больше 40 °. Следовательно, хотя изготовление решеток мембраны F8BT высокой плотности не влияет на форму линии излучения F8BT, оказывается, что он является подходящим инструментом для проектирования распределения светового излучения при изготовлении, например, высоконаправленных источников света 41 .

Рис. 3

Оптические характеристики микрометрических подвесных мембранных решеток F8BT.( a ) Излучение ФЛ как функция угла сбора: нормированные спектры ФЛ как функция угла сбора (a-1, a-2) и относительные контурные графики (a-3, a-4), относящиеся к Подвесные мембранные решетки F8BT с шагом 3 мкм, полученные методом капельного литья 10 мкл 1% раствора полимера (a-2, a-4) и пленок F8BT (a-1, a-3), вместе с графиком, сравнивающим спектрально интегрированные PL в зависимости от угла сбора для обоих наборов образцов (а-5). ( b ) Излучение ФЛ как функция температуры: нормированные спектры ФЛ как функция температуры (b-1, b-2) и графики относительных контуров (b-3, b-4), относящиеся к F8BT решетки мембран с шагом 3 мкм, полученные путем капельного литья 10 мкл 1 мас.% раствора полимера (b-2, b-4) и пленок F8BT (b-1, b-3), вместе с графиком, сравнивающим длину волны пика излучения от рабочей температуры для обоих наборов образцов (б-5).

Влияние температуры на эмиссионные свойства F8BT как пленок, так и решеток мембран показано на рис. 3b. Слева направо на рис. 3б показаны нормированные спектры фотолюминесценции в зависимости от рабочей температуры (рис. 3б-1, -2) и относительные контурные графики (рис. 3б-3, -4) пленок (рис. 3б). -1, -3) и решеток мембран (рис. 3b-2, -4) вместе с графиком, сравнивающим длину волны пика излучения в зависимости от рабочей температуры как для пленок, так и для решеток мембран (рис.3б-5). Из спектров ФЛ и контурных графиков можно заметить, что излучение имеет тенденцию к синему смещению и расширяется при повышении температуры, что согласуется с литературными данными 42 .

Это уширение более заметно для решеток мембран, чем для пленок. В обоих случаях заметен синий сдвиг пика излучения с температурой 43 , что опять же более существенно для решеток мембран (4 нм), чем для пленок (<1 нм). Синий сдвиг дает четкое указание на уменьшение средней длины сопряжения в материале в результате заселения более высокоэнергетических колебательных уровней, а наблюдение разницы между пленками и мембранами позволяет предположить, что материал менее плотный. упакованы в последний, с последующим большим свободным объемом и последующим (большим) облегчением возбуждения колебательных мод, при этом цепи приводятся в движение в менее сопряженной (средней) конфигурации.Интересно, что несмотря на то, что суспендированные полимерные мембраны с субмикрометрической толщиной могут выглядеть хрупкими и более подверженными термической нестабильности по сравнению с пленками такой же толщины, мы не наблюдали значительных изменений эмиссионных свойств в зависимости от температуры в исследованном интервале (10 ° C –150 ° С).

Применение капиллярного испарения растворителя для приготовления суспендированных мембранных решеток с использованием как конъюгированных (MDMO-PPV), так и неконъюгированных (PS) полимеров

Помимо F8BT, других фотолюминесцентных и нефотолюминесцентных полимеров, таких как MDMO-PPV и ПС, были успешно использованы для изготовления подвесных решеток мембран.MDMO-PPV представляет собой сопряженный полимер, широко используемый для изготовления органических светодиодов (OLED) 44 , тогда как PS является одним из наиболее часто используемых термопластичных полимеров, используемых для различных применений, от упаковки и пищевых контейнеров 45 до изоляционных пен. 46 и взрывчатые вещества на полимерной связке 47 . Растворы толуола с концентрацией полимера ~ 1 мас.% Были приготовлены с использованием как полимеров, так и методом капельного литья (10 мкл) на кремниевом шаблоне с двумерным массивом труб с открытым концом с шагом 4 мкм и глубиной 50 мкм.Испарение растворителя приводит к образованию мембран как MDMO-PPV, так и PS с выходом ~ 100%, как для F8BT. Это демонстрирует, что процесс получения имеет общее применение как для конъюгированных, так и для неконъюгированных полимеров, что значительно расширяет области применения предлагаемого подхода.

На рис. 4 показаны СЭМ-вид сверху и оптические изображения при 50-кратном увеличении кремниевого микроструктурированного шаблона до литья полимера в каплю (пустая микроструктура, рис. 4а) и после формирования MDMO-PPV (рис.4б) и ПС (рис. 4в) решеток мембран. Вставки на рис. 4b и c позволяют лучше оценить мембраны MDMO-PPV и PS, соответственно. Примечательно, что все решетки мембран демонстрируют высокую однородность независимо от используемого полимера с точки зрения как образования мембраны, так и, в случае люминесцентного полимера, светового излучения. Мы утверждаем, что, поскольку разные полимерные растворы были приготовлены с использованием одного и того же растворителя с низким поверхностным натяжением (например, толуола), никаких особых изменений ни с точки зрения условий смачивания кремния, ни с точки зрения скорости испарения растворителя не возникло в результате использования разных полимеров, при по крайней мере, в диапазоне исследованных молекулярных масс и концентраций.

Рис. 4

Приготовление как регулярных, так и нестандартных (коды μQR) микрометрических подвешенных мембранных решеток MDMO-PPV и PS. ( a - c ) СЭМ-изображение вида сверху ( a , c ) и 50-кратное оптическое ( b ) изображения кремниевого шаблона с двумерными массивами микротрубок с открытым концом с шагом 4 мкм перед капельное литье полимера ( a ) и после образования подвешенных решеток мембран в МДМО-ППВ ( b ) и ПС ( c ) со вставками с большим увеличением.( d - f ) СЭМ-вид сверху ( d , f ) и 20-кратное оптическое ( e ) изображение кремниевого микроструктурированного шаблона, состоящего из двумерных повторений квадратных решеток с QR-кодом. подобная картина микротрубок с открытыми концами размером 2 мкм до литья полимера в каплю ( d ) и после формирования фотолюминесцентных и нефотолюминесцентных микрокартонов взвешенных MDMO-PPV ( e ) и PS ( f ) мембраны, соответственно, со вставками большего увеличения.

Приготовление фотолюминесцентных и нефотолюминесцентных микро-QR (μQR) для приложений микротегирования с помощью капиллярного испарения растворителя

В конце концов, мы использовали наш подход для приготовления фотолюминесцентных и нефотолюминесцентных микро-QR (μQR) для приложений микротегирования. Это также позволяет продемонстрировать, что предложенный подход подходит для изготовления нерегулярных 2D массивов суспендированных полимерных мембран.

Кремниевые микроструктурированные шаблоны, состоящие из двумерных повторений квадратных отверстий размером 2 мкм, расположенных в решетке 81 мкм × 81 мкм с кодированием рисунка, подобным QR-коду, для веб-сайта Пизанского университета (https: // www.unipi.it) были спроектированы и изготовлены таким образом, чтобы получить массив труб с открытым концом, как показано на рис. S1a-1, -2, -3, -4i. Микроструктура кремния, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, показана на рис. 4d, на вставке показан один код μQR. Объем 5 мкл раствора полимера, содержащего ~ 1 мас.% Полимера (например, F8BT, MDMO-PPV и PS) в толуоле, заливали по капле поверх силиконовой матрицы и давали испариться при комнатной температуре. На рисунках 1h и 4e показаны флуоресцентные изображения вида сверху при 20-кратном увеличении μQR в F8BT и MDMO-PPV, соответственно, в то время как μQR в PS показаны на изображении вида сверху SEM, представленном на рис.4f. Вставки позволяют лучше оценить качество одного мкКР, приготовленного с каждым типом полимера. Независимо от используемого полимера образование полимерной мембраны достигается, несмотря на неравномерность рисунка. Фактически, неравномерность рисунка может привести к образованию больших плоских участков кремния между микротрубками, что может повлиять на испарение растворителя и, в свою очередь, на распределение полимера поверх кремния между соседними трубками. Тем не менее, процесс образования мембраны, по-видимому, не подвергается значительному влиянию, по крайней мере, для модели, протестированной в этой работе.

Шаблон μQR хорошо сформирован и обнаруживается с помощью считывателей QR-кода с открытым исходным кодом, благодаря внутренней устойчивости кода, несмотря на несколько отсутствующих мембран. Расположение дефектов в μQR похоже для разных образцов и независимо от используемого полимера. Мы утверждаем, что отсутствующие мембраны в кодах μQR идентифицируют изолированные трубы с закрытым концом в сети труб с открытым концом, подчеркивая локализацию дефектов, связанных с шаблоном, влияющих на изготовление шаблона μQR с помощью техники микроструктурирования, используемой в этой работе.Несмотря на это, декодирование QR-кода было достигнуто с эффективностью ~ 80% для массивов μQR F8BT и MDMO-PPV путем считывания изображений флуоресцентного микроскопа, полученных при 50-кратном увеличении с помощью приложения QR Code Reader на смартфоне.

Модельное образование вихревой решетки в конденсате Бозе – Эйнштейна

Конденсация Бозе – Эйнштейна - это квантово-механическое явление, при котором макроскопическое количество бозонов, таких как фотоны или гелий-4, занимает одно и то же квантовое состояние, что приводит к таким эффектам, как сверхтекучесть , сверхпроводимость и лазеры - и совсем недавно были достигнуты в захваченных разбавленных холодных атомах.Когда такие системы подвергаются вращательному возмущению, а не вращаются как целое, образуется вихревая решетка. Здесь мы представляем модель для моделирования увлекательного процесса образования вихревой решетки, доступную в версии 5.6 программного обеспечения COMSOL Multiphysics®.

Физический интерфейс уравнения Шредингера

Физический интерфейс Schrödinger Equation доступен в модуле Semiconductor Module, который является дополнением к COMSOL Multiphysics. В простейших случаях использования он описывает динамику нерелятивистской частицы под влиянием ландшафта потенциальной энергии.(Ссылка 1) Используя приближение огибающей функции, его можно использовать для моделирования квантово-ограниченных твердотельных систем, таких как квантовые ямы, проволоки и точки. (Ссылка 2) Путем преобразования в форму уравнения Гросса – Питаевского (ссылки 3 и 4) его также можно использовать для моделирования бозе-конденсированной системы, как мы показываем в этом сообщении в блоге.

Эксперимент по формированию вихревой решетки

Мэдисон, Чеви, Бретин и Далибард опубликовали свою экспериментальную работу в 2001 году (ссылка 5), показав серию поразительных изображений (рис.3 статьи), наглядно демонстрирующие зарождение и формирование вихревой решетки в захваченном облаке атомов бозе-эйнштейновского конденсата, перемешиваемом вращающимся лазерным полем. На том же рисунке они также построили временную эволюцию эллиптичности | \ tilde \ alpha | (см. уравнение (7) ниже), показывающее начальное колебание, за которым следует коллапс | \ tilde \ alpha | приближается к нулю, когда система проходит период динамической нестабильности перед установкой в ​​низкоэнергетическое состояние вихревой решетки.2) / 2} = \ omega_t \ sqrt {(2+ \ epsilon_X + \ epsilon_Y) / 2}

в качестве эталона для частоты вращения \ Omega: \ Omega \ Equiv \ tilde \ Omega \ bar \ omega.

Например, рис. 3 в работе. 1 получается с \ tilde \ Omega = 0,7. Кроме того, \ bar \ omega также используется для количественной оценки эллиптичности | \ tilde \ alpha |, что вскоре будет подробно описано ниже. Однако эксперимент проводился с увеличением и уменьшением соотношения сторон \ epsilon с течением времени. Таким образом, значение \ bar \ omega также будет меняться вверх и вниз во время эволюции, если определение (4) используется для любой комбинации \ epsilon_X и \ epsilon_Y.

Чтобы поддерживать постоянное значение \ bar \ omega в качестве твердой ссылки для частоты вращения \ Omega и эллиптичности | \ tilde \ alpha |, мы используем постоянные значения 0,03 и 0,09 для \ epsilon_X и \ epsilon_Y при оценке \ bar \ омега в модели. {1/5}
\ end {align *}

где N - количество атомов в конденсате.

Моделирование образования вихревой решетки

Параметры модели

Уравнение Гросса – Питаевского (8) может быть реализовано напрямую с помощью физического интерфейса Schrödinger Equation в модуле полупроводников. При построении модели мы уделили особое внимание согласованию параметров модели с реальными условиями эксперимента в [5]. 1, что дает хорошее согласие смоделированной временной эволюции с опубликованными данными.

Согласно тезису Бретина, перемешивающее лазерное поле включалось мгновенно, после чего соотношение сторон \ epsilon увеличивалось на 20 мс, а затем сохранялось постоянным в течение 300 мс.Поэтому в модели мы делаем перемешивающее лазерное поле всегда включенным и делаем соотношение сторон \ epsilon зависимым от времени. Чтобы использовать те же формулы для зависимых от времени и стационарных исследований, мы определяем временной параметр, используя одно и то же имя t в качестве встроенного временного параметра для зависимых от времени исследований. Длительность линейного нарастания 20 мс и время выключения 300 мс определены как параметры tau и t_off соответственно. Затем мы определяем ступенчатую функцию для увеличения и уменьшения соотношения сторон \ epsilon, предполагая тот же период времени замедления, равный 20 мс.Формула для

epst = 0,032 * шаг1 ((t + tau) / tau) * (1-шаг1 ((t-t_off) / tau))

настроен таким образом, что нарастание начинается с -20 мс и заканчивается в момент времени t = 0. Величина \ epsilon установлена ​​на 0,032, что основано на тексте в обоих Ref. 1 и тезис Бретина.

Из документа не ясно, как именно большая и малая полуоси лазерного поля меняются в зависимости от соотношения сторон \ epsilon. Однако кажется разумным предположить, что площадь эллипса остается постоянной во время подъема.2)) / (1 + epst) .

Когда эти параметры соотношения сторон готовы, параметры треппинга вводятся, как описано в разделе экспериментов. Число атомов в конденсате выбрано равным 1,5e5, что согласуется с диапазоном эксперимента и наилучшим образом соответствует количеству вихрей в эксперименте. Для оценки коэффициента демпфирования \ gamma используется температура 100 нК, основанная на [5]. 1.

Поскольку мы используем 2D-модель для аппроксимации 3D-конденсата, мы используем формулу Томаса – Ферми (10) для вычисления разумной толщины вне плоскости.2 в стационарном исследовании полная энергия масштабируется с помощью химического потенциала Томаса – Ферми \ mu_ {TF}, так что решаемая глобальная переменная имеет порядок единицы.

На рисунке ниже сравнивается результирующий профиль плотности частиц на оси X с профилем из приближения Томаса – Ферми. Они согласны, как и ожидалось.


Вычисленное стационарное решение профиля плотности частиц на оси X (синий) и в приближении Томаса – Ферми (зеленый).

Вращающаяся рамка, рассеивание и нормализация

После получения стационарного решения добавляются дополнительные физические функции для исследования, зависящего от времени. В частности, используются две функции, доступные в COMSOL Multiphysics версии 5.6. Одна из них - это функция Rotating Frame , как показано на снимке экрана ниже.


Окно настроек функции Rotating Frame .

Для такой двухмерной модели, как эта, ось вращения зафиксирована вне плоскости.Для 3D-моделей пользователь может выбирать оси в произвольных направлениях.

Другой - это свойство Dissipation для феноменологического затухания, которое имеет решающее значение для релаксации системы в низкоэнергетическое состояние вихревой решетки. Смотрите скриншот ниже.


Окно настроек функции Dissipation .

После Ref. 2 и аналогично стационарному исследованию, глобальное уравнение используется для поддержания числа атомов в конденсате путем корректировки химического потенциала, а глобальная переменная, для которой решается, масштабируется до порядка единицы с энергетической шкалой Томаса– Химический потенциал Ферми \ mu_ {TF}.

Динамическая нестабильность

Система проходит период динамической нестабильности, прежде чем перейти в низкоэнергетическое состояние вихревой решетки. Стохастический характер этого физического процесса приводит к значительному изменению моделируемой истории времени от запуска к запуску. Количество вихрей в полученной решетке также может варьироваться. Для улучшения числовой сходимости в настройки решателя внесены некоторые изменения. Поскольку начальное условие является физическим решением из стационарного исследования, согласованную инициализацию можно отключить.Это часто помогает исключить алгебраические состояния из контроля ошибок. Автоматический метод Ньютона с большим количеством итераций помогает пережить нестабильный период, когда нелинейность велика.

Анимация ниже показывает рассчитанный профиль плотности частиц как функцию времени. После начального периода колебания / вращения конденсата на периферии начинают формироваться вихри. Затем следует период динамической неустойчивости со случайным движением вихрей. (В это время анимация замедляется.В итоге система переходит в низкоэнергетическое состояние вихревой решетки. Наслаждайтесь представлением!

Расчетный профиль плотности частиц как функция времени.

На графике ниже показано несколько снимков из анимации.


Расчетный профиль плотности частиц как функция времени.

Из-за практических ограничений системы оптического изображения в экспериментальной установке невозможно получить изображения профиля плотности, как показано на графике выше, пока атомы все еще находятся в ловушке.Вместо этого в эксперименте атомы высвобождаются из ловушки, и облако может свободно расширяться в течение 25 мс до размера около 300 мкм. Соотношение сторон облака также резко меняется до и после свободного расширения. Первоначальная форма сигары становится окончательной формой блина, при этом длинные и короткие размеры меняются местами до и после расширения. Вы должны иметь это в виду при сравнении смоделированного профиля плотности в ловушке с опубликованными изображениями атомного облака после расширения.

Анализ результатов

Процесс эволюции во времени, показанный на анимации и на графике выше, может быть сведен к одному параметру эллиптичности | \ tilde \ alpha |, который получается путем подгонки профиля плотности частиц к простой функции для извлечения большой и малой осей эллипса. R_X и R_Y, а затем применяя уравнение. (7). Для смоделированных профилей плотности в ловушке, показанных на графике выше, приближение Томаса – Ферми обеспечивает хорошую функцию соответствия. Подгоняя его к профилю плотности в каждый момент времени, мы можем вычислить параметр эллиптичности | \ tilde \ alpha | как функция времени.На графике ниже показан результат (синие точки). Временные масштабы начального колебания и возможного коллапса | \ tilde \ alpha | хорошо согласуются с данными, приведенными на рис. 3 работы [5]. 1. Величина немного отличается, но это понятно, учитывая возможное изменение формы до и после свободного расширения, как обсуждалось выше.


Параметр эллиптичности и угловой момент на атом (единица измерения \ hbar).

Еще одним важным параметром, который характеризует переход от колеблющегося / вращающегося полного облака к вихревой решетке, является угловой момент, который также показан на графике выше (зеленая кривая).Общее поведение начальных колебаний и возможного получения определенного углового момента пропорционально количеству вихрей согласуется с результатами моделирования Цуботы и др. (Рис. 3 в Ссылке 2). Однако здесь временной масштаб нашего результата намного ближе к экспериментальным данным.

Оптимизация

Модуль оптимизации используется для подбора профиля плотности частиц. Чтобы проверить качество подгонки, мы можем построить контуры подгоночных данных (смоделированный профиль плотности) и контуры подгоночной функции (профиль плотности Томаса – Ферми) и сравнить их, как показано на графике ниже.


Подгоночные данные (смоделированный профиль плотности, оттенки серого) и функция подбора (профиль плотности Томаса – Ферми, цвет).

Настройка схемы оптимизации начинается с определения подходящих параметров, как показано на снимке экрана ниже.


Параметры подгонки для схемы оптимизации.

Это первая ось RXfit , вторая ось RYfit , угол наклона thetafit и пиковая плотность rho0fit для профиля плотности посадки.Также определены индексный параметр index для ссылки на решение и значение соответствия для параметра эллиптичности alphafit , вычисленное с использованием параметров соответствия и уравнения. (7).

Функция соответствия, основанная на профиле плотности Томаса – Ферми, определяется как переменная fit_fn . Затем разница между вычисленными данными и функцией подбора возводится в квадрат и усредняется по области моделирования, чтобы служить целью, которая должна быть минимизирована с помощью исследования оптимизации.Чтобы не допустить, чтобы величина цели стала слишком большой для оптимизатора, мы масштабируем разницу по пиковой плотности Томаса – Ферми (\ rho_0 в уравнении (10)) так, чтобы результирующая цель была близка к порядку единства. Это определено как переменная q0 на скриншоте ниже.


Соответствующий профиль плотности и цель должны быть минимизированы с помощью исследования оптимизации.

Цель q0 и 4 подгоночных параметра затем используются в настройках исследования оптимизации.Каждому из подгоночных параметров дается соответствующее начальное значение, масштаб и границы с использованием значения из приближения Томаса – Ферми. Смотрите скриншот ниже.


Настройки исследования оптимизации.

Решение в каждый момент времени выбирается для подгонки, сначала настраивая параметрический анализ с параметром , индекс , а затем на этапе фиктивного стационарного исследования настраиваются значения переменных, не решенных для раздела , для использования параметр index для выбора решения, зависящего от времени на каждом временном шаге.Смотрите скриншоты ниже.


Параметрическая развертка с параметром , индекс .


Dummy Стационарный этап исследования со значениями переменных, не решенных для раздела, настроенного для использования параметра index для выбора решения, зависящего от времени, на каждом временном шаге.

Заключительные замечания

Мы продемонстрировали физический интерфейс Schrödinger Equation с моделью динамического процесса образования вихревой решетки в конденсате Бозе – Эйнштейна, образованном захваченными холодными атомами.Мы хотели бы услышать о том, как вы используете этот физический интерфейс для других интересных явлений, в комментариях ниже!

Попробуйте сами

Попробуйте смоделировать образование вихревой решетки во вращающемся конденсате Бозе – Эйнштейна, нажав кнопку ниже, которая перенесет вас в галерею приложений, где вы можете скачать MPH-файл.

Список литературы

  1. Л. И. Шифф, Quantum Mechanics , McGraw-Hill, ed. 3, 1968.
  2. P. Harrison, Quantum Wells, Wires and Dots , Wiley, ed.3, 2009.
  3. E.P. Гросс, “Структура квантованного вихря в бозонных системах”, Il Nuovo Cimento , vol. 20, нет. 3. С. 454–457, 1961.
  4. .
  5. Л. П. Питаевский, “Вихревые линии в несовершенном бозе-газе”, Докл. Phys. ЖЭТФ , т. 13, вып. 2. С. 451–454, 1961.
  6. .
  7. К. В. Мэдисон, Ф. Чеви, В. Бретин и Дж. Далибард, «Стационарные состояния вращающегося конденсата Бозе-Эйнштейна: пути к зарождению вихрей», Phys. Rev. Lett. , 86, 4443, 2001.
  8. М.Цубота, К. Касамацу, М. Уэда, “Формирование вихревой решетки во вращающемся конденсате Бозе-Эйнштейна”, Phys. Ред., А 65, 023603 (2002).
  9. С. Чой, С. А. Морган и К. Бернетт, “Феноменологическое затухание в захваченных атомных конденсатах Бозе-Эйнштейна”, Phys. Ред. , A 57, 4057, 1998.

Подвесной светодиодный держатель для вывесок для бизнеса и промышленности A4 Пейзаж 3 шт. Для колонны Принадлежности для изготовления вывесок

Подвесной светодиодный держатель для вывесок для бизнеса и промышленности A4 Пейзаж 3 шт. Для колонны Принадлежности для изготовления вывесок
  • Дом
  • Бизнес и промышленность
  • Полиграфия и графика
  • Принадлежности для изготовления вывесок
  • Прочие принадлежности для изготовления вывесок
  • Подвесной светодиодный держатель для вывесок из натурального дерева A4 Пейзаж 3 шт. Для колонны

держатель A4 Пейзаж 3 шт. Для подвесной светодиодной вывески из натурального стекла на колонне. Используйте высококачественный светодиодный источник света с эффективной защитой изображения, который позволяет избежать пожелтения с возрастом и увеличения срока службы. В LGP используется технология трехмерной лазерной гравировки, которая увеличивает срок службы и равномерно распределяет освещение, Цена за 3 шт., висящие со всеми комплектами для подвешивания (3 шт. в партии), Убедитесь, что вы уже имеете его, Покупки в аутлетах, наши опытные сотрудники по продажам будут рады вам помочь! Пейзаж 3 шт. Для колонны Подвесной держатель для светодиодной вывески А4, Подвес для витрины А4 Пейзаж 3 шт. Для колонны.






3 шт. Для столбца, См. Все определения условий: Торговая марка:: HKSIGN. UPC:: Не применяется, Состояние :: Новое: Совершенно новый, Цвет границы:: Черный цвет: Страна / регион производства:: Китай, Размер рамы:: A4, Цена за 3 шт. Подвешивания со всеми комплектами для подвешивания, LGP Используется технология 3D-лазерной гравировки. Подробную информацию см. в списке продавца. 3шт много, А4, Размер плаката: Международный стандарт А4. Пейзаж, неиспользованный, неоткрытый, который продлевает срок службы и равномерно распределяет освещение, настоящий подвесной светодиодный держатель для окон.если применима упаковка, например, коробка без надписи или полиэтиленовый пакет. = 11, используйте высококачественный светодиодный источник света с эффективной защитой изображения, предотвращающей пожелтение с возрастом и увеличивающий срок службы, 4 "X 14, 290 мм X 377 мм,: MPN:: Не применяется, 210 мм X 290 мм, 8": Модель: 0650, если товар не изготовлен вручную или не был упакован производителем в нерызничную упаковку. неповрежденный товар в оригинальной упаковке. Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине.

### FLAGCSS0 ###

Подвесной держатель для светодиодных вывесок на окнах А4 Пейзаж 3шт для колонны


сказкавостока.com Используйте высококачественный светодиодный источник света с эффективной защитой изображения, который предотвращает пожелтение с возрастом и увеличивает срок службы, LGP использует технологию 3D-лазерной гравировки, которая увеличивает срок службы и равномерно распределяет освещение. 3 шт. Много), убедитесь, что он у вас уже есть, магазины, наши опытные сотрудники по продажам будут рады вам помочь!

двери и окна пвх на шри-ланке

люминесцентных домов

Lumin Двери и окна производятся в соответствии с высочайшими международными производственными стандартами и качеством нашей сетью сертифицированных фабрик с использованием алюминиевых профилей от Sri Lanka - главного производителя - ALUMEX.Alumex PLC является дочерней компанией Hayleys PLC - одного из самых динамично диверсифицированных конгломератов голубых фишек Sri Lanka . узнать больше 【Получить цену】

uPVC Шри-Ланка - ORETA uPVC

ORETA HI-TECH WINDOWS PVT LTD является ведущим производителем ПВХ окон и дверей в Шри-Ланке Ланка . Кроме того, мы сертифицированы по стандарту ISO 9001: 2015. 【Получить цену】

AL

Двери и Окна - Бесплатная торговая площадка в Шри-Ланке Ланка

Купить фанеру двери сталь двери алюминий двери ванная комната двери от поставщиков и окна в Шри-Ланке Ланка .Посетите surplus.lk сегодня. 【Получить цену】

UPVC Fabri ion Sri Lanka Коммерческие двери Окна ...

Alumatek Lanka Pvt Ltd fabri es складные раздвижные двери окна ненесущие перегородки и витрины по очень конкурентоспособным ценам. Alumatek - UPVC - Еще один сайт Alumatek ЭКОНОМИЯ ЭНЕРГИИ С 【Получить цену】

Двери и окна Шри Ланка Двери и окна Поставщики...

Шри Ланка Двери И Окна Двери И Окна от Шри Ланка Поставщик - Найдите разнообразие Двери Окна 8 Окна 8 из алюминия двери окна алюминий двери и окна Окна Поставщики Lo ed в Шри-Ланке Ланка Купить Двери И окна Сделано в Шри-Ланке Ланка на Alibaba.com 【Получить цену】

Цена

ПВХ на Шри-Ланке wedabima.com

Алюминий Двери и окна в Шри-Ланке Ланка цена в Шри-Ланке Ланка . Прайс-лист на алюминий / ПВХ в Шри-Ланке Ланка . Алюминиевые буфеты для кладовых в Шри-Ланке Ланка Алюминий Двери и окна в Шри-Ланке Ланка Поручень в Шри-Ланке Ланка стальные перила в Шри-Ланке cladding 908 Lanka Алюминиевая перегородка из Sr и т. Д... 0773895777/0714406200 【Получить цену】

Шри Ланкийский Двери Окна Gates Поставщики Производители ...

Высушенный кокос, органическое кокосовое масло, органическое кокосовое молоко, органический кокосовый порошок, органические кокосовые чипсы и поджаренные чипсы. массив дерева тик двери лежаки из массива дерева тик и полы из массива тика с гребнем и пазом. KN95 Маски для лица и маска для лица.Наша компания является надежной торговой компанией из Шри Ланка по ценам FOB.【Получить цену】

Антон Дверные окна из ПВХ - трубы ПВХ

Антон предлагает ассортимент дверей из ПВХ , окон и продуктов. uPVC двери и окна и упругие, прочные и простые в установке. 【Получить цену】

uPVC

Windows Производитель - ваша цена Windows

Выберите свою цену Windows в качестве производителя ваших окон uPVC Если вам нужно заменить окно или вам нужен новый поставщик стеклопакетов, мы можем помочь.Окна будут адаптированы к вашей цветовой отделке и спецификациям остекления и будут идеально подогнаны для обеспечения максимальной безопасности и энергоэффективности вашей собственности. 【Получить цену】

Найти деревянные двери

и окна в Шри-Ланке Ланка Surplus.lk

Деревянные двери , включая все виды деревянных изделий для дверей , двери и окна доступны по излишку. lk. Ваш универсальный рынок.【Получить цену】

Windows SENOK

Senok Windows Pvt. ООО было зарегистрировано в 2005 году как дочернее предприятие комбината «Сенок Трейд». Все материалы Seven Trust поставляются ведущими немецкими производителями профилей из ПВХ для окон и дверей . Первыми продуктами, которые были сброшены на рынок и , продавались в Шри-Ланке , были двери из ПВХ и окна . 【Получить цену】

Шрила Прабхупада Ведущий производитель алюминиевых профилей на Ланке

Шрила Прабхупада Ведущий производитель алюминиевых профилей на Ланке .Как ведущий поставщик лучших в своем классе экструзионных профилей для коммерческих помещений, жилых и архитектурных сооружений, которые формируют промышленность по всему миру, Alumex PLC предлагает ряд революционных инноваций благодаря экспертным возможностям в мире производства алюминия. 【Получить цену】

Роликовые двери

производитель и поставщик в Шри-Ланке Ланка

Роликовые двери производитель и поставщик в Шри-Ланке Ланка : Производство роликовых Двери Роликовые ворота Рольставни Двери сопротивление ставни Азия.The Ultimate Roller Door Experts Он открывается плавно и идеально подходит для вашей жизни 94 777 597 748 94 7 ... 【Получить цену】

Anton

PVC Трубы и фитинги Ассортимент

Anton PVC трубы и фитинги используются для транспортировки жидкостей легкий ветерок. Неважно, жарко или холодно, потому что у Anton есть широкий ассортимент прочных и надежных труб и фитингов PVC , способных справиться с прохождением любых жидкостей. Также доступен полный ассортимент труб и фитингов PVC для переносных систем холодного водоснабжения и отвода сточных вод.Сюда входят фитинги для канализации ... 【Получить цену】

Upvc -

Windows Sri Lanka : Upvc Windows

Upvc- Windows Sri Lanka в 2:48 утра. Отправить этот блог по электронной почте ... Окна и Двери Феникс с двойным остеклением Окна . Ответить Удалить. Ответы. Отвечать. квадраты 27 сентября ... 【Получить цену】

Антон

ПВХ Производители труб и фитингов из ХПВХ

Как один из ведущих производителей ХПВХ в Шри-Ланке Ланка Антон разработал новую линейку труб и фитингов из ХПВХ для горячего вода под брендом Anton Thermo Alpha.Линия Anton Thermo Alpha обладает высокими антикоррозийными свойствами и выдерживает высокие температуры и суровые условия эксплуатации. 【Получить цену】

Senok Windows Pvt Ltd - 1004 фотографии - Обслуживание окон дома ...

Senok Windows Pvt Ltd Colombo Шри-Ланка . 2К лайков. Senok Windows pvt Ltd производит и продает новую линейку дверей и окон из ПВХ .... 【Получить цену】

Upvc -

Windows Шри Lanka

Upvc - Windows Шри Ланка Пятница, 28 октября 2011 г... Мы в Windoor PVT Ltd. можем помочь вам с двойными стеклопакетами / дверьми окнами , а также зимними садами ... 【Узнать цену】

uPVC

Окна и Двери Поставщик и производитель

Антрацит / Белые двухцветные окна через 24 часа и недавно появившиеся в продаже антрацитовые гладкие окна из ПВХ Ваша цена Окна рады быть единственным поставщиком стеклопакетов, который предлагает круглосуточные варианты для наших двухцветных антрацитовых и белых окон .【Получить цену】

Euro

Двери и Windows Pte Ltd - Мировые производители

EURO PVC / UPVC ДВЕРИ и WINDOWS EURO DOORS и WINDOWS - единственная компания PTE . Шри-Ланка производит UPVC с материалами International Seven Trust, используя глобальный опыт, и специализируется на производстве в , производя UPVC Doors Windows и PVC Doors .Мы используем бренд EURO. 【Получить цену】

Alugrow - Алюминиевые аксессуары для дверей

и Windows

Alugrow Pvt Ltd - продавцы и поставщики качественных алюминиевых профилей и аксессуаров Seven Trust для Door и оконного рынка Sri Lanka . Являясь плодотворным партнером в области экологичного строительства, мы в основном ориентируемся на поставку дверей и оконных изделий качества Seven Trust , уделяя особое внимание обширному опыту и подтвержденным техническим знаниям.【Получить цену】

uPVC

Windows Архивы - ORETA uPVC

ORETA HI-TECH WINDOWS PVT LTD имеет сертификат ISO 9001: 2015, получивший сертификат uPVC , окна и двери , , производственная компания в Шри-Ланке, . ඔරේටා හයි ටෙක් වින්ඩෝස් ISO 9001: 2015 තත්ව සහතිකය හිමි ... 【Получить цену】

Цена на двери и окна в Шри-Ланке wedabima.com

Алюминий Двери и окна цена в Шри-Ланке Ланка . Дверь и Прайс-лист на окна в Шри-Ланке Ланка . Мы занимаем лидирующие позиции в области инженерии, чтобы предложить любой дизайн интерьера для напольных покрытий в строительной отрасли. Двери Окна и аксессуары ...

NS Aluminium является полностью интегрированным производителем алюминиевых профилей в Шри-Ланке Ланка с 1986 года.Мы разрабатываем и производим алюминиевые профили для широкого спектра применений, например, для производства дверей окон витрин витрин и других специализированных коммерческих приложений. 【Получить цену】

Kandy

Окна

В Kandy Windows мы проектируем производство и устанавливаем высококачественные окна и двери из ПВХ для коммерческих и жилых домов, специализируясь на в раздвижных створках и .Наши элегантные прочные и прочные окна и двери специально разработаны, чтобы выдерживать Шри Ланкийские погодные условия и имеют гарантию от деформации и растрескивания. и обесцвечиваются. 【Получить цену】

Алюминиевый завод в Шри-Ланке Коммерческие двери Окна ...

Alumatek Lanka Pvt Ltd складные двери раздвижные двери окна перегородки и витрины по очень конкурентоспособным ценам.Alumatek - Корпоративный - Еще один сайт Alumatek 【Получить цену】

Stylish

Окна Lanka

Stylish Stylish была основана в 2012 году в Коломбо Sri Lanka с солидным 15-летним опытом в производстве окон приносит качество Алюминиевая система навесных перегородок и раздвижных окон и дверей также при стратегической поддержке Access Projects Pvt Ltd. Лидер в производстве оконной системы Alu-k в Шри-Ланке Ланка .【Получить цену】

Senok

Windows Pvt Ltd - 1004 Фотографии - Служба окон дома ...

Senok Windows Pvt Ltd Colombo Шри-Ланка . 2К лайков. Senok Windows pvt Ltd производит и Маркетинг новой линейки дверей и окон из ПВХ .... 【Узнать цену】

Двери и окна с рамой - Продажа - Sri Lanka ...

Получите лучшие предложения на Doors And Windows With Frame ads in Sri Lanka .У нас есть 18 Двери и Окна с рамными объявлениями в разделе "Продажа". 【Получить цену】

Требуются:

двери и окна . Покупатель из Шри Ланка . Идентификатор свинца ...

Укажите следующие оптовые требования к продукту - Название продукта: Двери и окна Спецификации: Тип: Дверь Материал окна: Алюминий Размер: Настроить согласно требованиям Формы: Различные условия упаковки: Требуемое стандартное количество: 100 - 1000 шт. Условия доставки: CIF или CNF Порт назначения: Коломбо Шри-Ланка Ланка Условия оплаты: T / T Ищем поставщиков из мира.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *