Сталь ст2 характеристики: Сталь СТ2 по ГОСТ – характеристики, химический состав

alexxlab | 07.03.1996 | 0 | Разное

Содержание

Сталь СТ2 по ГОСТ – характеристики, химический состав

Сталь СТ2 – поставка со склада на Урале, цена, характеристики. Отгрузка проката в день оплаты партиями любого объема.

Характеристики

В маркировке, которая обозначает углеродистые стали обыкновенного качества групп Б и В, соответственно присутствуют буквы Б и В, тогда как сталь обыкновенного качества группы А такого буквенного обозначения не имеет. Для указания степени раскисления используют индексы: для спокойных сталей – «сп», для полуспокойных – «пс», для кипящих – «кп», а категорию нормируемых свойств (кроме категории 1) указывают последующей цифрой. Стали Ст1 – Ст6 всех трех групп относят к спокойным и полуспокойным, стали Ст1 – Ст4 – к кипящими, разделения стали Ст0 по степени раскисления нет. 

Марка : Сталь СТ2
Классификация : Сталь для рельсового транспорта
Применение:
для изготовления катаных, кованых или литых безбандажных колес

Наша продукция

Технологические характеристики стали СТ2

Свариваемость стали СТ2: без ограничений
 Флокеночувствительность: не чувствительна
 Склонность к отпускной хрупкости: не склонна
 
  • без ограничений – сварка производится без подогрева и без последующей термообработки
  • ограниченно свариваемая – сварка возможна при подогреве до 100-120 град. и последующей термообработке
  • трудносвариваемая – для получения качественных сварных соединений требуются дополнительные операции: подогрев до 200-300 град. при сварке, термообработка после сварки – отжиг

Химический состав в %

 Si

Mn  Ni S P Cr  Cu   As

0.09 – 0.15

0.05 – 0.15

 0.25 – 0.5

 до 0.3

 до 0.05

до 0.04

 до 0.3

 до 0.008

 до 0.3

 до 0.08

Ст2сп сталь: характеристики и расшифовка, применение и свойства стали

Страна Стандарт Описание
Россия ГОСТ 380-2005 Сталь углеродистая обыкновенного качества. Марки
Россия ГОСТ 535-2005 Прокат сортовой и фасонный из стали углеродистой обыкновенного качества. Общие технические условия
Россия ГОСТ 13663-86 Трубы стальные профильные. Технические требования
Россия ГОСТ 14637-89 Прокат толстолистовой из углеродистой стали обыкновенного качества. Технические условия

Сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества Ст2пс – характеристики, свойства, аналоги

На данной страничке приведены технические, механические и остальные свойства, а также характеристики стали марки Ст2пс.

Классификация материала и применение марки Ст2пс

Марка: Ст2пс
Классификация материала: Сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества
Применение: неответственные детали, требующие повышенной пластичности или глубокой вытяжки- маланагруженные элементы сварных конструкций, работающие при постоянных нагрузках и при положительных температурах

Химический состав материала Ст2пс в процентном соотношении


CSiMnNi SPCr NCuAs
0.09 – 0.150.05 – 0.150.25 – 0.5до 0.3до 0.05до 0.04до 0.3до 0.008до 0.3до 0.08

Механические свойства Ст2пс при температуре 20

oС
СортаментРазмерНапр.sвsTd5yKCUТермообр.
ммМПаМПа%%кДж / м2
Трубы, ГОСТ 8696-7433422524
Трубы, ГОСТ 10705-8033320624
Прокат, ГОСТ 535-2005335-430195-22529-32
Лист толстый, ГОСТ 14637-89320-410185-21530-33
Катанка, ГОСТ 30136-95420-47060

Технологические свойства Ст2пс


Свариваемость: без ограничений.
Флокеночувствительность: не чувствительна.
Склонность к отпускной хрупкости: не склонна.

Расшифровка обозначений, сокращений, параметров


Механические свойства :
sв– Предел кратковременной прочности , [МПа]
sT– Предел пропорциональности (предел текучести для остаточной деформации), [МПа]
d5– Относительное удлинение при разрыве , [ % ]
y– Относительное сужение , [ % ]
KCU– Ударная вязкость , [ кДж / м2]
HB– Твердость по Бринеллю , [МПа]

Физические свойства :
T – Температура, при которой получены данные свойства , [Град]
E– Модуль упругости первого рода , [МПа]
a– Коэффициент температурного (линейного) расширения (диапазон 20o– T ) , [1/Град]
l– Коэффициент теплопроводности (теплоемкость материала) , [Вт/(м·град)]
r– Плотность материала , [кг/м3]
C– Удельная теплоемкость материала (диапазон 20o– T ), [Дж/(кг·град)]
R– Удельное электросопротивление, [Ом·м]

Свариваемость :
без ограничений– сварка производится без подогрева и без последующей термообработки
ограниченно свариваемая– сварка возможна при подогреве до 100-120 град. и последующей термообработке
трудносвариваемая– для получения качественных сварных соединений требуются дополнительные операции: подогрев до 200-300 град. при сварке, термообработка после сварки – отжиг

Другие марки из этой категории:

Обращаем ваше внимание на то, что данная информация о марке Ст2пс, приведена в ознакомительных целях. Параметры, свойства и состав реального материала марки Ст2пс могут отличаться от значений, приведённых на данной странице. Более подробную информацию о марке Ст2пс можно уточнить на информационном ресурсе Марочник стали и сплавов. Информацию о наличии, сроках поставки и стоимости материалов Вы можете уточнить у наших менеджеров. При обнаружении неточностей в описании материалов или найденных ошибках просим сообщать администраторам сайта, через форму обратной связи. Заранее спасибо за сотрудничество!

Сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества Ст2сп – характеристики, свойства, аналоги

На данной страничке приведены технические, механические и остальные свойства, а также характеристики стали марки Ст2сп.

Классификация материала и применение марки Ст2сп

Марка: Ст2сп
Классификация материала: Сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества
Применение: неответственные детали, требующие повышенной пластичности или глубокой вытяжки- маланагруженные элементы сварных конструкций, работающие при постоянных нагрузках и при положительных температурах

Химический состав материала Ст2сп в процентном соотношении


td> N

Механические свойства Ст2сп при температуре 20

oС
CuAs
0.09 – 0.150.15 – 0.30.25 – 0.5до 0.3до 0.05до 0.04до 0.3до 0.008до 0.3до 0.08
СортаментРазмерНапр.sвsTd5yKCUТермообр.
ммМПаМПа%%кДж / м2
Трубы, ГОСТ 8696-7433422524
Трубы, ГОСТ 10705-8033320624
Прокат, ГОСТ 535-2005335-430195-22529-32
Лист толстый, ГОСТ 14637-89330-430195-22529-32
Катанка, ГОСТ 30136-95420-47060

Технологические свойства Ст2сп


Свариваемость: без ограничений.
Флокеночувствительность: не чувствительна.
Склонность к отпускной хрупкости: не склонна.

Расшифровка обозначений, сокращений, параметров


Механические свойства :
sв– Предел кратковременной прочности , [МПа]
sT– Предел пропорциональности (предел текучести для остаточной деформации), [МПа]
d5– Относительное удлинение при разрыве , [ % ]
y– Относительное сужение , [ % ]
KCU– Ударная вязкость , [ кДж / м2]
HB– Твердость по Бринеллю , [МПа]

Физические свойства :
T – Температура, при которой получены данные свойства , [Град]
E– Модуль упругости первого рода , [МПа]
a– Коэффициент температурного (линейного) расширения (диапазон 20o– T ) , [1/Град]
l– Коэффициент теплопроводности (теплоемкость материала) , [Вт/(м·град)]
r– Плотность материала , [кг/м3]
C– Удельная теплоемкость материала (диапазон 20o– T ), [Дж/(кг·град)]
R– Удельное электросопротивление, [Ом·м]

Свариваемость :
без ограничений– сварка производится без подогрева и без последующей термообработки
ограниченно свариваемая– сварка возможна при подогреве до 100-120 град. и последующей термообработке
трудносвариваемая– для получения качественных сварных соединений требуются дополнительные операции: подогрев до 200-300 град. при сварке, термообработка после сварки – отжиг

Другие марки из этой категории:

Обращаем ваше внимание на то, что данная информация о марке Ст2сп, приведена в ознакомительных целях. Параметры, свойства и состав реального материала марки Ст2сп могут отличаться от значений, приведённых на данной странице. Более подробную информацию о марке Ст2сп можно уточнить на информационном ресурсе Марочник стали и сплавов. Информацию о наличии, сроках поставки и стоимости материалов Вы можете уточнить у наших менеджеров. При обнаружении неточностей в описании материалов или найденных ошибках просим сообщать администраторам сайта, через форму обратной связи. Заранее спасибо за сотрудничество!

Сталь марки ст2кп характеристики, расшифровка, химический состав, описание

Расшифровка

Цифра 2 — указывает порядковый номер марки, а не среднее содержание углерода в ней
кп — кипящая (индекс кп обозначает степень раскисления)
Если после буквенного индекса не указана цифра, то сталь 1-й категории. Нормируемые показатели: временное сопротивление при растяжении и относительное удлинение.

Вид поставки

Cортовой прокат, в том числе фасонный: ГОСТ 2590—88, ГОСТ 2591-88, ГОСТ 8239-89, ГОСТ 19772-93, ГОСТ 19771-93, ГОСТ 8278-83, ГОСТ 8281-80,
ГОСТ 8283-93, ГОСТ 380-94, ГОСТ 8509-93, ГОСТ 8510-86, ГОСТ 8240-89, ГОСТ 535-88, ГОСТ 2879-88.
Лист толстый ГОСТ 19903-74.
Лист тонкий ГОСТ 19903-74, ГОСТ 16523-89.
Лента ГОСТ 503-81.
Полоса ГОСТ 103-76, ГОСТ 82-70.
Проволока ГОСТ 3282-74, ГОСТ 17305-91.
Трубы: ГОСТ 10705—80, ГОСТ 10706-76, ГОСТ 3262-75.

Назначение

Неответственные детали повышенной пластичности, малонагруженные элементы сварных конструкций, работающие при постоянных нагрузках и положительных
температурах.

Температура критических точек, °С

Ac1Ac3Ar3Ar1
735854835682



Химический состав, % (ГОСТ 380-94)

C, углеродMn, марганецSi, кремнийP, фосфорS, сераCr, хромNi, никельCu, медьAs, мышьяк
не более
0,09-0,150,25-0,500,070,040,050,300,300,300,08

Механические свойства

ГОСТСостояние поставкиСечение, ммσ0,2, МПаσв, МПаδ54), %
не менее
380-94Прокат горячекатанный До 20
Св. 20 до 40
Св. 40 до 100
Св. 100
215
205
195
185
320-410 33
32
30
30
16523-89 (Образцы поперечные)Листы горячекатанные

Листы холоднокатанные

До 2,0 вкл.
Св. 2,0 до 3,9 вкл.
До 2,0 вкл.
Св. 2,0 до 3,9 вкл.
320-410 (21)
(23)
(24)
(26)
к содержанию ↑

Ударная вязкость KCU

Состояние поставкиKCU, Дж/см2, при температуре, °C
+200-20-40
Пруток горячекатанный диаметром до 150 мм24-6413-1688

ПРИМЕЧАНИЕ. При σв = 323-412 МПа предел выносливости σ-1 = 176-196 МПа

Технологические характеристики

Температура ковки, °С: начала 1300, конца 750. Охлаждение на воздухе.

Свариваемость — сваривается без ограничений; способы сварки: РДС, АДС под флюсом и газовой защитой, ЭШС и КТС. Для толщины более 36 мм рекомендуется подогрев и последующая термообработка.

Обрабатываемость резанием — Кνб. ст = 1,6 и Кνтв. спл = 2,0 в горячекатаном состоянии при НВ 137.

Флокеночувствительность — не чувствительна.

Склонность к отпускной хрупкости — не склонна.

Раздел: Углеродистые стали Метки: конструкционные стали, стали, углеродистые

Навигация по записям

← Сталь Ст0 — углеродистая обыкновенного качества Сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества общего назначения →

конструкционная углеродистая сталь обыкновенного качества

Характеристика стали марки Ст2сп

Ст2сп – Сталь конструкционная углеродистая обыкновенного качества, хорошо сваривается, сварка осуществляется без подогрева и без последующей термообработки, способы сварки: ручная дуговая сварка, автоматическая дуговая сварка под флюсом и газовой защитой, КТС, ЭШС. Для толщины более 35 миллиметров рекомендуется подогрев и последующая термообработка, не склонна к флокеночувствительности, склонность к отпускной хрупкости отсутствует. Обрабатываемость резанием в горячекатаном состоянии при НВ 137 Kυ тв.спл. = 2,0 и Kυ б.ст. = 1,6, нашла свое применение в производстве неответственных деталей конструкций и механизмов, требующих повышенной пластичности или глубокой вытяжки; применяется в маланагруженных элементах сварных конструкций, работающих при постоянной нагрузке и при плюсовых температурах; сталь Ст2сп имеет относительно высокие показатели вязкости и пластичности, немного выше, чем у стали Ст2пс. Ковка при температурном режиме от 1300 до 750 0С, охлаждение производят на воздухе. Сталь марки Ст2пс не склонна к отпускной хрупкости и магнитна.

Расшифровка стали марки Ст2сп

Расшифровка стали: Буква стоящая в начале обозначает группу стали котороя опреедляет кретерии предела прочности для химсостава, если буквы нет, тогда такая сталь относится к группе А, поставляется потребителям по механическим свойствам (такая сталь может иметь повышенное содержание серы или фосфора). Буквы Ст. обозначают, что сталь обыкновенного качества, хотя большинство сталей – высококачественные. Цифры от 0 до 6 это условный номер марки в зависимости от химсостава и механических свойств. Обычно, чем больше цифра, тем больше углерода и больше прочность. В нашем случае 2 обозначает содержание углерода в сплаве 0,09–0,15%. Буквы после номера марки обозначают степень раскиcления: сп — спокойная. По цене спокойные стали стали дороже чем полуспокойные и кипящие. Спокойная сталь – это сталь полученная в результате раскисления. Получается при раскислении алюминием, марганцем и кремнием. В ней настолько снижен уровень кислорода, что в процессе обработки металла между углеродом и кислородом никакой реакции не возникает а наличие неметаллических шлаков и их включение свидено к минимому. Спокойная сталь отличается плотной структурой, у нее хорошие механические свойства. Она менее склонна к отрицательным реакциям  на нагревание при сварке и к старению. Особенности однородной гомогенной микроструктуры придают сплаву максимальную устойчивость к коррозии и пластичность.

Поставка Ст2сп

Поставляется в виде сортового проката, в том числе и фасонного по регламенту ГОСТ 2590-88 Прокат стальной горячекатаный круглый, ГОСТ 2591-88 Прокат стальной горячекатаный квадратный, ГОСТ 8239-89 Двутавры стальные горячекатаные, ГОСТ 19771-93 Уголки стальные гнутые равнополочные, ГОСТ 19772-93 Уголки стальные гнутые  неравнополочные, ГОСТ 8278-83 Швеллеры стальные гнутые равнополочные, ГОСТ 8281-80 Швеллеры стальные гнутые неравнополочные, ГОСТ 8283-93 Профили стальные гнутые корытные равнополочные, ГОСТ 380-94 Сталь углеродистая обыкновенного качества, ГОСТ 8509-93 Уголоки стальные горячекатаные равнополочные, ГОСТ 8510-86 Уголки стальные горячекатаные неравнополочные, ГОСТ 8240-97 Швеллеры стальные горячекатаные, ГОСТ 535-88 Прокат сортовой и фасонный из углеродистой стали обыкновенного качества, ГОСТ 2879-88 Прокат стальной горячекатаный шестигранный, ГОСТ 19903-2015 Прокат листовой горячекатанный, ГОСТ 19904-90 Прокат листовой холоднокатанный, ГОСТ 16523-97 Прокат тонколистовой из углеродистой стали качественной и обыкновенного качества общего назначения, ГОСТ 503-81 Лента холоднокатаная из низкоуглеродистой стали, ГОСТ 103-76 Полоса стальная горячекатаная, ГОСТ 82-70 Прокат стальной горячекатаный широкополосный универсальный, ГОСТ 3282-74 Проволока стальная низкоуглеродистая общего назначения, ГОСТ 17305-71 Проволока из углеродистой конструкционной стали, ГОСТ 10705-80 Трубы стальные электросварные, ГОСТ 10706-76 Трубы стальные электростварные прямошовные, ГОСТ 3262-75 Трубы стальные водогазопроводные.

Классификация, номенклатура и общие нормы  ГОСТ  380-2005;
Сортовой и фасонный прокат  ГОСТ  2590-2006;   ГОСТ  535-2005;   ГОСТ  5422-73;   ГОСТ  8239-89;   ГОСТ  8240-97;   ГОСТ  8510-86;   ГОСТ  8509-93;   ГОСТ  30136-95;   ГОСТ  9234-74;   ГОСТ  2879-2006;   ГОСТ  2591-2006;   ГОСТ  11474-76;   ГОСТ  30565-98;   ГОСТ  19425-74;   ГОСТ  19240-73;
Листы и полосы  ГОСТ  14918-80;   ГОСТ  14637-89;   ГОСТ  16523-97;   ГОСТ  19903-74;   ГОСТ  8568-77;   ГОСТ  103-2006;
Ленты  ГОСТ  6009-74;   ГОСТ  3560-73;
Ленты  ГОСТ  19851-74;
Трубы стальные и соединительные части к ним  ГОСТ  24950-81;   ГОСТ  53383-2009;   ГОСТ  8642-68;   ГОСТ  20295-85;   ГОСТ  8644-68;   ГОСТ  12132-66;   ГОСТ  8646-68;   ГОСТ  8696-74;   ГОСТ  8645-68;   ГОСТ  10706-76;   ГОСТ  13663-86;   ГОСТ  3262-75;   ГОСТ  8639-82;   ГОСТ  8731-87;   ГОСТ  8732-78;   ГОСТ  9567-75;   ГОСТ  10707-80;   ГОСТ  8638-57;   ГОСТ  10705-80;
Проволока стальная низкоуглеродистая  ГОСТ  3282-74;

Химический состав стали Ст2сп

CSiMnNiSPCrNCuAs
0.09 – 0.150.15 – 0.30.25 – 0.5до 0.3до 0.05до 0.04до 0.3до 0.008до 0.3до 0.08

Температура критических точек Ст2сп

Критическая точка Температура
Ac1735
Ac3(Acm)854
 Ar3(Arcm835
Ar1682

Ударная вязкость стали Ст2сп

Вид поставки, термическая обработка200-20-40
Круг горячекатаный диаметром до 150 мм24-6413-1688

Физические свойства стали Ст2сп

TемператураE 10– 5a 10 6lrCR 10 9
ГрадМПа1/ГрадВт/(м·град)кг/м3Дж/(кг·град)Ом·м
20   7850  

При температуре +20 0С плотность стали составляет 7850 кг/м3

Предел выносливости стали марки Ст2сп

σ-1 , МПаσ (временное сопротивление разрыву), МПа
176-196323-412

Твердость Ст2сп

   Марка стали Ст2спHB 10 -1 = 116 МПа

Механические свойства Ст2сп при нормальной температуре

Вид поставкиРазмерНапр.sвsTd5yKCUТермообработка
ммМПаМПа%%кДж / м2
Трубы, ГОСТ 8696-74  33422524   
Трубы, ГОСТ 10705-80  33320624   
Прокат, ГОСТ 535-2005  335-430195-22529-32   
Лист толстый, ГОСТ 14637-89  330-430195-22529-32   
Катанка, ГОСТ 30136-95  420-470  60  

Зарубежные аналоги стали марки Ст2сп

СШАA192, K02502
Германия1.0034, RSt34-2, S185, St35, St37-2
ФранцияA34-2, A34-2NE
Англия1449-3420HR,, 3420HS, S360
ЕвросоюзE195, S235JR
ИталияFe330BFN
КитайQ215, Q215A, Q215A-Z, Q215B, Q215B-Z
БолгарияASt0, BSt2sp, WSt2ps, WSt2sp
ВенгрияFe310O
ПольшаSt0S
РумынияOL34.1
Чехия10000

Сталь конструкционная Ст2пс – Металлургическая компания

Краткие обозначения:
σв— временное сопротивление разрыву (предел прочности при растяжении), МПаε— относительная осадка при появлении первой трещины, %
σ0,05— предел упругости, МПаJк— предел прочности при кручении, максимальное касательное напряжение, МПа
σ0,2— предел текучести условный, МПаσизг— предел прочности при изгибе, МПа
δ5,δ4,δ10— относительное удлинение после разрыва, %σ-1— предел выносливости при испытании на изгиб с симметричным циклом нагружения, МПа
σсж0,05 и σсж— предел текучести при сжатии, МПаJ-1— предел выносливости при испытание на кручение с симметричным циклом нагружения, МПа
ν— относительный сдвиг, %n— количество циклов нагружения
sв— предел кратковременной прочности, МПаR и ρ— удельное электросопротивление, Ом·м
ψ— относительное сужение, %E— модуль упругости нормальный, ГПа
KCU и KCV— ударная вязкость, определенная на образце с концентраторами соответственно вида U и V, Дж/см2T— температура, при которой получены свойства, Град
sT— предел пропорциональности (предел текучести для остаточной деформации), МПаl и λ— коэффициент теплопроводности (теплоХотСтилость материала), Вт/(м·°С)
HB— твердость по БринеллюC— удельная теплоХотСтилость материала (диапазон 20o — T ), [Дж/(кг·град)]
HV— твердость по Виккерсуpn и r— плотность кг/м3
HRCэ— твердость по Роквеллу, шкала Са— коэффициент температурного (линейного) расширения (диапазон 20o — T ), 1/°С
HRB— твердость по Роквеллу, шкала ВσtТ— предел длительной прочности, МПа
HSD— твердость по ШоруG— модуль упругости при сдвиге кручением, ГПа

Шины Hercules | Геркулес Power ST2

Выберите год выпуска автомобиля Year2023202220212020201
20172016201520142013201220112010200200720062005200420032002200120001991997199619951994199319119198719861985198419831982198119801971977197619751974197319721971197019619671966196519641963196219611960195195719561955195419531952195119501949

Выберите марку автомобиля Сделать

Выберите модель автомобиля Модель

Выберите стиль отделки автомобиля Стиль отделки

Выберите тип размера метрической или флотационной шины

Метрика
(т.г., 205/55R16)

Плавающая
(например, 35X12,50R20)

Выберите ширину профиля шины Ширина секции255175185195205215225235245255265275285295305315

Выберите соотношение сторон шины Соотношение сторон

Выберите высоту шины Высота шины 28303132333537

Выберите ширину шины Ширина шины

Выберите диаметр обода шины Диаметр обода

TGF-β индуцирует ST2 и программирует развитие ILC2

Передача сигналов TGF-β необходима для развития ILC2

Сначала мы определили экспрессию мРНК рецепторов TGF-β I (TβR1) и II (TβR2) во всех зрелых подмножествах ILC в печени и собственной пластинке (LP), а их предшественники — в костном мозге нормальных мышей C57BL/6 (дополнительная таблица 1).Все подмножества ILC и их предшественники экспрессировали мРНК Tgfbr1 и Tgfbr2 . Оказалось, что предшественники ILC2 (ILC2p) экспрессировали относительно более высокие уровни мРНК Tgfbr1 и Tgfbr2 среди других предшественников, при этом зрелые ILC2 были самыми высокими среди трех зрелых подмножеств ILC (дополнительный рисунок 1).

Чтобы изучить, влияет ли передача сигналов TGF-β на развитие ILCs из их предшественников BM, мы создали смешанных химерных мышей BM, у которых CD45.2 + клеток BM из тамоксифен- ( Tgfbr2 -/- ) или обработанных маслом (контроль) Tgfbr2 f/f ER-Cre + летально облученных мышей в равных количествах вводили в летально облученных CD45 .1 + хозяев вместе с нормальными клетками КМ CD45.1 + в соотношении 1:1 соответственно ( Tgfbr2 -/- /45,1 против контроля/45,1). До переноса клеток костного мозга мы не обнаружили существенной разницы в составе костного мозга между 5-дневными мышами, получавшими масло, и мышами, получавшими тамоксифен (дополнительная рис.2). Шесть недель спустя лимфоидные клетки из селезенки, кишечника, легких и печени были собраны и подсчитаны, и было обнаружено, что они одинаковы у всех химерных мышей. Однако проточный цитометрический анализ подмножеств ILC (стратегии селекции показаны на дополнительных рисунках 3a, b и 4b, c) в LP, полученном из Tgfbr2 -/- /45.1 химер, выявил значительное снижение частоты и общего количество CD45.2 + Lin CD127 + GATA3 + ILC2 (рис.1а, б). Однако частота, но не общее количество, CD45.2 + Lin CD127 + RORγt + ILC3 значительно увеличилась по сравнению с ILC3, полученными из химер Control/45.1 (дополнительный рисунок 4a). Точно так же, ILC2S в легких (CD45.2 + LIN CD127 + CD25 + CD25 + GATA3 + ) от TGFBR2 – / – /45.1 Chimeras значительно более низкая частота и общее количество, чем CD45.2 + ILC2 из химер Control/45.1 (рис. 1c, d). Частота и общее количество CD45.2 + Lin CD127 + Tbet + ILC1 в LP были одинаковыми в этих двух химерах (дополнительная рис. 4b). Соответственно, не наблюдалось значительных изменений в частоте и общем количестве клеток CD45.2 + Lin NK1.1 + NKp46 + ILC1/NK в печени (дополнительный рисунок 4c). Данные предполагают специфический дефект в генерации ILC2 в отсутствие передачи сигналов TGF-β от предшественников BM.

Рис. 1: Передача сигналов TGF-β необходима для развития ILC2.

a Репрезентативные графики FACS для GATA3 + ILC2 и RORγt + ILC3 среди CD45.2 + Lin CD127 + клеток проприиа (CD5.4LP/lapropria) Tgfbr2 -/- /CD45.1 Химеры BM воссозданы на 6 недель. b Резюме частоты и общего количества CD45.2 + ILC2 в LP Control/CD45.1 и Tgfbr2 -/- /CD45.1 химеры ВМ ( n  = 3–4 мыши на группу). C Представитель подсветки CD45.2 + LIN CD127 + CD27 + CD25 + GATA3 + ILC2S в легкое управление / CD45.1 и TGFBR2 / /CD45.1 Химеры БМ, воссозданные в течение 6 недель. d Сводная информация о частоте и общем количестве CD45.2 + ILC2 в легких контрольной группы/CD45.1 и Tgfbr2 /- /CD45.1 химеры ВМ ( n  = 3–4 мыши на группу). e Репрезентативные FACS-графики ILC2 и ILC3 в CD45.2 + Lin CD127 + клеток в LP Tgfbr2 f/f 15-BMer-Cre postchimer ER-Cre 9004 лечение тамоксифеном или маслом. f Сводка по частоте и общему количеству CD45.2 + ILC2 в LP Tgfbr2 f/f ER-Cre + /45.1 Химеры BM после обработки тамоксифеном или маслом ( n  = 3 4 мыши на группу). г Внутриклеточное окрашивание IL-5 и IL-22 среди CD45.2 + Lin CD127 + клеток в LP Tgfbr2 f/f /15.4BM-Cre 9004 химеры после обработки тамоксифеном или маслом. h Резюме частоты и общего количества IL-5-продуцирующих CD45.2 + ILC2 в LP Tgfbr2 f/f ER-Cre + /45.1 Химеры BM после обработки тамоксифеном или маслом ( n  = 3–4 мыши на группу). I Представитель Главные участки GATA3 + ILC2S и RORγT + ILC3S среди CD45 + CD127 CD127 клетки в LP TGFBR2 F / F ER-CRE + Химеры предшественников ILC/CD45.1 BM после обработки тамоксифеном или маслом. j Резюме частоты и абсолютного количества CD45.2 + ILC2 в LP Tgfbr2 f/f ER-Cre + ILC предшественник/CD45.1 Химеры BM после обработки тамоксифеном или маслом ( n  = 3–4 мыши на группу). Цифры указывают процент клеток в указанных воротах. Все данные являются репрезентативными как минимум для двух независимых экспериментов. Данные представлены как среднее ± ± стандартное отклонение; значимость определяли по критерию Стьюдента t (* p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001, нс, значимости нет).

Чтобы исключить возможность того, что дефект ILC2 в химерах, упомянутых выше, был связан с исходной разницей в количестве предшественников BM ILC2, вызванной лечением тамоксифеном, мы вводили CD45.2 + Tgfbr2 f/f ER-Cre + клеток ВМ вместе с нормальными клетками ВМ CD45.1 в равных соотношениях в летально облученных мышей CD45.1, и немедленно обрабатывали эти химеры тамоксифеном или маслом в течение пяти дней подряд. Шесть недель спустя мышей собирали, и анализ подмножеств ILC выявил значительно сниженную частоту и общее количество CD45.2 + ILC2 и увеличение ILC3 в LP химер, обработанных тамоксифеном, по сравнению с таковыми у химер, обработанных маслом. (рис.1д, е). IL-5 и IL-22 являются характерными цитокинами ILC2 и ILC3 соответственно 30 . Мы обнаружили, что как частота, так и общее количество IL-5 + ILC2 в LP были значительно снижены в химерах, обработанных тамоксифеном, тогда как IL-22 + ILC3 показали повышенную частоту, но не общее количество в химерах, обработанных тамоксифеном. (Рис. 1g, h и дополнительный рис. 4a).

Для дальнейшего подтверждения того, что передача сигналов TGF-β в предшественниках ILC играет контролирующую роль в развитии ILC без побочных эффектов со стороны других гемопоэтических предшественников, а также для достижения большей ILC-ограниченной делеции TβR2 на примитивной стадии, CD45.2 + LIN CD127 + FLT3 α 4 β 7 β 7 + клетки (содержащие ILC-преданные предшественники с ограниченным потенциалом линии для всех ILCS 31 ) отсортированы от BM Tgfbr2 f/f ER-Cre + мышей адоптивно переносили в смертельно облученных хозяев CD45.1 + вместе с достаточным количеством нормальных клеток BM CD45.1 + . Затем химерных мышей лечили тамоксифеном или маслом в течение 5 дней.ILC в LP затем анализировали через 6 недель. Мы обнаружили, что обработанные тамоксифеном Tgfbr2 f/f ER-Cre + ILCP давали едва обнаруживаемые ILC2 в LP смешанных химер BM (рис. 1i, j). В совокупности эти данные предоставляют убедительные доказательства того, что передача сигналов TGF-β была внутренне необходима для развития ILC2, но не для ILC1/NK или ILC3. Таким образом, мы сосредоточились на клеточном и молекулярном механизме передачи сигналов TGF-β при развитии ILC2.

Делеция Tgfbr2 снижает ILC2p в BM

ILC2 развиваются из предшественников ILC2, связанных с линией (ILC2p) в BM 32 .ILC2p разработаны компанией CHILP. Затем мы изучили, была ли неэффективная генерация ILC2 в отсутствие передачи сигналов TGF-β следствием дефекта ILC2p в BM. Для этого мы проанализировали клетки CHILP и ILC2p в химерах Tgfbr2 -/- /45.1 BM (стратегия селекции для ILC2p и CHILP показана на дополнительном рисунке 3c, e). Мы обнаружили, что дефицит TβR2 существенно не изменяет частоты клеток-предшественников α4β7 + Flt3 и α4β7 + Flt3 CD25 (в основном CHILP) клеток-предшественников среди CD45.2 + Lin CD127 + клеток в костном мозге (дополнительный рис. 4d). Однако было значительное сокращение клеток CD45.2 + ILC2P клетки (CD45.2 + LIN CD127 + FLT3 CD25 CD117 SCA1 + Gata3 + Gata3 + ), полученный из Tgfbr2 -/- BM в химере Tgfbr2 -/- /CD45.1, по сравнению с клетками ILC2p из контрольного BM в контроле/CD45.1 химеры (рис. 2a, b), хотя без различий в экспрессии GATA3 в остальных клетках Tgfbr2 -/- ILC2p (дополнительный рисунок 4e). Соответственно, количество клеток ILC2p также было значительно снижено в BM из обработанных тамоксифеном смешанных химер BM, созданных с использованием очищенных клеток Tgfbr2 f/f ER-Cre + ILCPs/45.1 BM (рис. 2c). Мы не наблюдали существенной разницы в пролиферации ILC2p между контролем и химерами Tgfbr2 -/- BM (дополнительная рис.4д). Таким образом, дефицит передачи сигналов TGF-β предотвращает образование клеток ILC2p в BM. Мы предположили, что дифференцировке ILC2p от CHILP препятствует дефицит передачи сигналов TGF-β.

Рис. 2: Делеция TβR2 снижает уровень предшественника ILC2, связанного с клоном (ILC2p), в костном мозге.

Представитель Представитель CD117 SCA1 CD25 + GATA3 + Gata3 + ILC2P Gating на CD45.2 + LIN CD127 + FLT3 клетки в BM контроля/CD45.1 и Tgfbr2 -/- /CD45.1 BM химеры. b Сводка по частоте и общему количеству клеток ILC2p в костном мозге Control/CD45.1 и Tgfbr2 /- /CD45.1 химеры костного мозга ( n  = 3–4 мыши в группе ). c Резюме частоты и общего количества клеток ILC2p в костном мозге Tgfbr2 f/f ER-Cre + химер предшественников ILC/CD45.1 BM, обработанных тамоксифеном или маслом ( n = 3–4 мыши на группу).Цифры указывают процент клеток в указанных воротах. Все данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. Данные представлены как среднее ± ± стандартное отклонение; * p  < 0,05, ** p  < 0,01 (критерий Стьюдента t ).

Дефицит Smad3 не влияет на образование ILC2

Затем мы изучили, участвует ли Smad-опосредованный канонический путь в контролируемом TGF-β развитии ILC2. Мы сосредоточились на роли Smad3, поскольку он является одним из наиболее важных Smads, чувствительных к TGF-β нижестоящим рецепторам (R-Smads) 33 .Мы создали смешанные Smad3 -/- /45.1 или контроль/45.1 химеры BM, в которых клетки CD45.2 + BM от Smad3 -/- или однопометные контрольные мыши были инъецированы летально облученным CD45.1 + хозяев вместе с таким же количеством клеток дикого типа (WT) CD45.1 + клеток BM. Неожиданно химеры Smad3 -/- /45.1 показали сопоставимые частоты и общее количество зрелых ILC2 в клетках LP и ILC2p в BM по сравнению с контролем/45.1 химеры (дополнительная рис. 5a, b), что указывает на то, что TGF-β программирует развитие ILC2 через Smad3-независимый путь.

Анализ секвенирования РНК

Tgfbr2 -/- Клетки ILC2 и ILC2p

Неспособность делеции Smad3 влиять на развитие ILC2 побудила нас изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе дефекта ILC2 в отсутствие передачи сигналов TGF-β. Сначала мы провели анализ секвенирования РНК (RNA-seq) для сравнения глобального транскриптома между свежевыделенными Tgfbr2 -/- ILC2 от получавших тамоксифен мышей Tgfbr2 f/f ER-Cre + и WT ILC2. от обработанных маслом мышей Tgfbr2 f/f ER-Cre + (рис.3а, б). Мы обнаружили, что сотни генов были изменены в Tgfbr2 -/- ILC2 по сравнению с ILC2 дикого типа (FDR < 0,1 и кратность изменения > 1,5). Некоторые связанные с ILC2 гены, включая Gata3, Il1rl1 (ST2), Il-5, Atxn1 (Sca1) и Ccr4 34 , были снижены в Tgfbr2 -/- 900 РНК, последовательный анализ (рис. 3а). Напротив, гены, связанные с ILC3, такие как Rorc, Il22, Upp1 и Ccl5 34 , были увеличены в Tgfbr2 -/- ILC2 (рис.3а). Точно так же сигнатурные гены , такие как Zbtb16 (PLZF), Ncr1, Il2rb, Ctla4 и Klrb1b для ILC1/NKs 34 , также были усилены в Tgfbr2 -/- , хотя (рис. 3a. ILCa 9004s). у этих мышей с нокаутом не было значительных изменений в ILC1 / NK и ILC3 (дополнительная рис. 4a, b, c).

Рис. 3: Передача сигналов TGF-β поддерживает экспрессию генов, критических для программы ILC2.

a Анализ секвенирования РНК отсортированного ILC2 (CD45.2 + LIN SCA1 + CD25 + KLRG1 + KLRG1 + ) В LP Tamoxifen- ( TGFBR2 – / – ) или обработанные маслом (контроль) TGFBR2 F / f ER-Cre + мышей. Данные представлены в виде графика рассеяния log2 FPKM (фрагментов на килограмм базы транскриптов на миллион сопоставленных прочтений) от Tgfbr2 -/- и WT ILC2. Синие точки представляют гены с подавленной регуляцией, а красные точки представляют гены с повышенной регуляцией в Tgfbr2 /- ILC2.Интересующие гены указаны и отмечены фиолетовым (пониженная регуляция) и зеленым (активная регуляция). b Тепловая карта экспрессии выбранных генов (левое поле) у WT и Tgfbr2 -/- ILC2, сгруппированных в соответствии с функцией их продуктов (левое поле). NS, не значимо (значение q ,  ≥ 0,2) (критерий Стьюдента t , поправка Бенджамини и Хохберга для множественных тестов). c Количественный ОТ-ПЦР-анализ мРНК указанных генов, экспрессированных в очищенных Tgfbr2 -/- и WT ILC2 в LP.Показанные данные представляют собой объединенные данные трех независимых экспериментов и представлены как среднее  ± SEM (** p  < 0,01, нс, не имеет значения).

Однако, ранее зарегистрированные ILC2 связанные факторы транскрипции, включая GFI1 35 , RORA 36 , BCL11B 37 , ETS1 38 , и TCF7 39 не показать значительная разница в экспрессии генов у Tgfbr2 -/- ILC2 по сравнению с WT ILC2. Sox4 , нижестоящая мишень TGF-β, которая ингибирует GATA-3-индуцированные ILC2 24 , не показал никаких изменений в Tgfbr2 -/- ILC2. Id2 40 и Nfil3 41 , которые имеют решающее значение для разработки всех подмножеств ILC, остались неизменными в Tgfbr2 -/- ILC2. Напротив, Zbtb16 , Tbx21 и Rorc , которые являются ключевыми факторами транскрипции для спецификации клеток ILC1/NK и ILC3, соответственно, были усилены в Tgfbr2 -/- ILC2 (рис.3б). Однако, несмотря на изменения, наблюдаемые при анализе секвенирования РНК, проверка генов, связанных с ILC2, с помощью количественной ОТ-ПЦР показала, что только ll1rl1 было значительно снижено в Tgfbr2 -/- ILC2 (рис. 3c).

Чтобы предоставить прямые доказательства того, что передача сигналов TGF-β имеет решающее значение для развития ILC2, мы затем изучили глобальный транскриптом BM ILC2p. Поразительно, но анализ секвенирования РНК в клетках ILC2p постоянно выявлял значительное снижение экспрессии Il1rl1 в клетках Tgfbr2 -/- ILC2p (дополнительная рис.6а, б). Этот вывод также был подтвержден количественным анализом ОТ-ПЦР (дополнительный рисунок 6c). В соответствии с профилем генов в ILC2, некоторые гены, связанные с ILC3, включая Il1r2, Gda , Capg 34 , и уникальные гены ILC1/NK, такие как Sell , Mmp9 6 3cr 9 , x x x, x и Itgam 34 также активировались в клетках Tgfbr2 -/- ILC2p (дополнительная фиг. 6a). Другие гены транскрипции, связанные с ILC2, такие как Gata3, Ets1, Bcl11b, Rora и Tcf7 , остались неизменными в клетках Tgfbr2 -/- ILC2p (дополнительная рис.6б). Данные в совокупности указывают на то, что отсутствие передачи сигналов TGF-β ограничивало экспрессию генов, связанных с ILC2, в предшественниках, при этом ll1rl1 подвергался наибольшему влиянию.

TGF-β активирует ST2 и генерирует ILC2 из предшественников BM

Наши предыдущие результаты показывают, что дефицит Tgfbr2 влияет на образование BM ILC2p, но не клеток CHILP (рис. 2, дополнительная рис. 4d) и экспрессия Il1rl1 была наиболее значительно снижена в клетках Tgfbr2 -/- ILC2p (дополнительная фиг.6). Поскольку IL-33/ST2 был предложен в развитии ILC2 из CLP 35,36 , мы предположили, что передача сигналов TGF-β может быть необходима для развития ILC2 из CHILP, и этот процесс был связан с регуляцией ST2. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели серию анализов развития ILC2 in vitro путем совместного культивирования предшественников BM со стромальными клетками OP9, которые экспрессируют лиганд Notch DL1 (клетки OP9-DL1). Клетки культивировали в поляризующей среде ILC2 в присутствии цитокинов IL-7 и IL-33 36 .Во-первых, мы очищали LIN CD127 + α 4 β 7 CD25 CD25 CHILP-клетки Chilp Chilp 42 (Сортировочная стратегия, показанная в дополнении на фиг. 3E) из BM Tamoxifen -мыши, получавшие лечение ( Tgfbr2 -/- ), или контрольные мыши, получавшие масло (WT). Клетки CHILP совместно культивировали с монослоями OP9-DL1 в течение 13 дней в поляризующей среде ILC2 с TGF-β1 или без него. Мы наблюдали, что стимуляция IL-7 и IL-33 без экзогенного TGF-β1 генерировала небольшое количество ILC2, определяемых как CD45.2 + Lin CD127 + GATA3 + (содержащие как клетки ST2 + , так и клетки ST2 ) из клеток WT CHILP, который был существенно снижен при включении ингибитора TGF-β рецептора2 SB431542 культуры (клетки ST2 + ILC2 почти полностью элиминировались) (рис. 4а). Напротив, добавление экзогенного TGF-β1 в культуры CHILP дикого типа генерировало гораздо больше клеток ILC2 и дополнительно увеличивало их экспрессию ST2, но лишь немного увеличивало GATA3 (фиг.4а). Примечательно, что среди этих клеток ILC2 субпопуляция ST2 + доминировала как по частоте, так и по абсолютному количеству (рис. 4а). Соответственно, гораздо меньшее количество ILC2 (почти все ST2 ) было получено из Tgfbr2 -/- культур CHILP, независимо от того, добавляли ли экзогенный TGF-β или нет (рис. 4a). Мы получили аналогичные результаты, используя клетки Tgfbr1 -/- CHILP (дополнительная рис. 7).

Рис. 4: TGF-β способствует развитию in vitro ILC2 из предшественников BM и повышает экспрессию ST2.

A WT или TGFBR2 – / – Chilp-клетки (LIN CD127 + FLT3 α 4 β 7 + CD25 ) были сокрушительными с клетками OP9-DL1 в присутствии IL-7 (20 нг/мл) и IL-33 (20 нг/мл) или TGF-β (2 нг/мл) или ингибитора TβR1 SB431542 (5 мкМ) в течение 13 дней и анализировали с помощью проточной цитометрии. Левая панель: репрезентативные графики FACS отображают частоту клеток ILC2, полученных из WT и Tgfbr2 -/- CHILP, соответственно.Две средние панели: гистограммы показывают репрезентативную экспрессию GATA3 и ST2 в клетках WT и Tgfbr2 -/- LC2. Цифры указывают среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Правая верхняя панель показывает частоту обоих LIN CD127 + Gata3 + st2 + и lin CD127 + Gata3 + ST2 среди CD45 + живых клеток в Chilp культуры (день 13) WT и Tgfbr2 -/- клеток.Правая нижняя панель показывает общее количество как LIN CD127 + Gata3 + st2 + и lin CD127 + Gata3 + ST2 среди живых клеток CD45 + Культуры CHILP (день 13) клеток WT и Tgfbr2 -/- . Показанные данные объединены из трех ( Tgfbr2 -/- CHILP) и пяти (WT CHILP) независимых экспериментов. Статистический анализ выполнялся с использованием однофакторного ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Тьюки (* p  < 0.05; ** p  < 0,01). B WT ILC2 Предшественники (ILC2P; Lin CD127 CD127 FLT3 α 4 β 7 + CD25 + ) культивируют с op9-dl1 Стромальные клетки с IL-7 и IL -33, в присутствии (черная сплошная линия) или в отсутствие (серая сплошная линия) TGF-β1, анализировали на CD127 + GATA3 + ILC2 на 13-й день культивирования, предварительно гейтировали живым CD45.2 + Линь кл. Цифры выше указывают частоту, а цифры ниже обозначают количество событий указанного стробирования соответственно.Оценивали уровни экспрессии GATA3 и ST2 в этих культивируемых ILC2. c Репрезентативные графики FACS отсортированных клеток WT ILC2p, совместно культивируемых со стромальными клетками OP9-DL1 плюс IL-7 и IL-33, в присутствии (черная сплошная линия) или в отсутствие (серая сплошная линия) экзогенного TGF-β, или с добавлением SB431542 (черная пунктирная линия) на 13 дней. Репрезентативные графики FACS, показывающие экспрессию GATA3 и ST2 среди живых клеток CD45 + Lin CD127 + . Данные в b и c являются репрезентативными для двух независимых экспериментов.

Затем мы исследовали роль передачи сигналов TGF-β на BM ILC2p в тех же условиях поляризующего ILC2 культивирования, поскольку ILC2p является непосредственным предшественником ILC2 32 . Хотя клетки WT ILC2p, выделенные из костного мозга, экспрессируют высокий уровень ST2 (почти 100%) (дополнительный рисунок 3e), клетки WT ILC2p, культивируемые в присутствии цитокинов IL-7 и IL-33 в течение нескольких дней, показали снижение экспрессии ST2. Добавление экзогенного TGF-β1 в культуру клеток WT ILC2p существенно повышало экспрессию их ST2 и увеличивало субпопуляцию клеток ST2 + без значительных изменений GATA3 (фиг.4б, в). И наоборот, блокада эндогенной передачи сигналов TGF-β с помощью SB431542 существенно снижала образование клеток ST2 + ILC2, а также экспрессию ST2 в культурах ILC2p (рис. 4c). В совокупности эти данные показали, что передача сигналов TGF-β необходима для индукции ST2 из CHILP, что защищает развитие клеток ST2 + ILC2p из предшественников CHILP; и TGF-β также необходим для предотвращения подавления ST2 на клетках ST2 + ILC2p.

TGF-β увеличивает

Il1rl1 в предшественниках ILC2 через путь MEK

Затем мы изучили молекулярные механизмы, лежащие в основе опосредованной TGF-β активизации ST2 в клетках BM CHILP и ILC2p.Поскольку дефицит Smad3 не влиял на развитие ILC2 (дополнительный рисунок 5), мы определили, что обработка TGF-β1 вызывает аналогичное (или даже более сильное) повышение уровня мРНК Il1rl1 у Smad3 -/- CHILP и Клетки ILC2p по сравнению с их контрольным однопометным диким животным (рис. 5а), что свидетельствует о независимом от Smad3 пути активации ST2.

Рис. 5: TGF-β увеличивает мРНК Il1rl1 в предшественниках BM ILC2 частично посредством MEK-зависимого пути.

a Количественный ОТ-ПЦР-анализ экспрессии гена IL1rl1 в очищенных ILC2p и CHILP от WT и Smad3 -/- мышей, культивируемых в среде, содержащей IL-7 и IL-33, проведенный в течение 24 ч. после обработки TGF-β1 или TGF-β1 и указанными ингибиторами и нормализовали до экспрессии Hprt1 . b IL1rl1 Экспрессия мРНК в очищенных WT или TAK1-дефицитных ILC2p и CHILP, культивированных в условиях, содержащих IL-7 и IL-33, проведенная через 24 часа после обработки TGF-β1 или TGF-β1 и указанными ингибиторами, нормализованная до Hprt1 выражение. c Il1rl1 Экспрессия мРНК в WT ILC2p и CHILP, культивируемых в среде, содержащей только IL-7, проведенная через 24 ч после обработки TGF-β1 или TGF-β1 и указанными ингибиторами, и нормализована до экспрессии Hprt1 .В каждом эксперименте клетки КМ собирали у десяти мышей в каждой группе перед культивированием. Данные объединены из двух независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001, **** p  < 0,0001 (критерий Стьюдента

t).

Затем мы исследовали неканонические нижележащие пути передачи сигналов TGF-β, участвующие в индукции ST2 у предшественников ILC2. TGF-β-activated kinase (TAK1) и MEK являются двумя важными медиаторами запускаемых TGF-β Smad-независимых путей -33-.Мы культивировали предшественников WT CHILP и ILC2p с клетками OP9-DL1 в поляризационных условиях ILC2 в присутствии и отсутствии экзогенного TGF-β1 в течение 24 часов. Кроме того, мы включили SB431542, 5z-7-окзозеаенол или U0126 для блокирования передачи сигналов TβR1, пути, опосредованного TAK1, или пути MEK-1/2 соответственно. Экспрессии родственных ILC2 генов Gata3, Tcf7, Gfi1, Bcl11b, Rora, Ets1, и Il1rl1 определяли с помощью количественной ПЦР. Только экспрессия гена Il1rl1 была значительно увеличена как в клетках CHILP, так и в клетках ILC2p в ответ на обработку TGF-β1 (фиг.5а). Gata3, Tcf7, Ets1, Gfi1, Bcl11b , и Rora не претерпели существенных изменений в предшественниках ILC2p в ответ на стимуляцию TGF-β, хотя некоторые из них слегка активизировались в клетках CHILP при обработке TGF-β1 (дополнительная фиг. 8). Как и ожидалось, включение SB431542 полностью устраняло опосредованную TGF-β1 индукцию мРНК Il1rl1 как в клетках ILC2p, так и в клетках CHILP (рис. 5a). Блокада неканонического пути, опосредованного TAK1, с помощью 5z-7oxozeaenol не смогла изменить активацию IL1rl1 , индуцированную TGF-β1 (фиг.5а). Кроме того, клетки Tak1 -/- ILC2p и CHILP продемонстрировали увеличение мРНК Il1rl1 , сравнимое с таковым у их аналогов WT, в ответ на TGF-β1 (рис. 5b). Индукция Il1rl1 в предшественниках Tak1 -/- действительно была обусловлена ​​передачей сигналов TGF-β, поскольку SB431542 полностью отменял индуцированную TGF-β1 активацию ll1rl1 (рис. 5b). Неожиданно ингибирование пути MEK1/2 с помощью U0126 значительно подавляло индуцированную TGF-β1 экспрессию Il1rl1 как в клетках WT ILC2p, так и в клетках CHILP (фиг.5a), предполагая роль MEK1/2-опосредованного пути в активации IL1rl1 . Важно отметить, что блокада MEK1/2 в предшественниках Smad3 -/- ILC2p и CHILP также частично блокировала TGF-β1-индуцированное увеличение мРНК Il1rl1 (рис. 5a). Поскольку известно, что IL-33 является важным цитокином, усиливающим экспрессию ST2 , 43, , далее мы исследовали, является ли TGF-β-опосредованное увеличение экспрессии ST2 независимым от IL-33. Поразительно, но индуцированная TGF-β1 активация IL1rl1 в предшественниках ILC2p и CHILP не зависела от IL-33, поскольку TGF-β1 был способен индуцировать аналогичный или даже более высокий рост мРНК IL1rl1 в культурах без экзогенного IL-33. 33 (рис.5в). Соответственно, как ингибиторы MEK1/2, так и TβR1 эффективно блокировали TGF-β-опосредованное увеличение экспрессии ll1rl1 в культурах с дефицитом IL-33 (рис. 5c). Эти данные в совокупности указывают на то, что TGF-β активирует экспрессию Il1rl1 как в клетках BM ILC2p, так и в клетках CHILP, по крайней мере, частично посредством MEK-зависимого, но Smad3- и TAK1-независимого пути.

TGF-β увеличивает ST2 и поддерживает зрелые ILC2

Поскольку передача сигналов IL-33/ST2 участвует в экспансии зрелых ILC2 на периферии 44 , мы затем исследовали, играет ли передача сигналов TGF-β роль в гомеостазе зрелые ILC2.Сообщалось, что KLRG1 является специфическим маркером для зрелых ILC2 32 . Мы сортировали зрелые TGFBR2 – / – и WT ILC2S (CD45 + LIN CD127 + CD127 + CD25 + KLRG1 + ) (дополнительный фиг. 3D) от LP Тамоксифен или лечение маслом TGFBR2 F / F ER-CRE + мышей, соответственно, и усыновлены эти ILC2S в ILC-дефицит Rag2 – / IL2RG / – – мышей 4,5,45 в равных количествах.Двенадцать дней спустя были проанализированы частоты ILC2 в LP мышей-реципиентов. Дефицит передачи сигналов TGF-β приводил к значительному снижению частоты и общего количества зрелых ILC2 в LP (рис. 6a, b). Дальнейший анализ показал, что пролиферация Tgfbr2 -/- ILC2, как показано Ki67, была снижена по сравнению с ILC2 дикого типа (рис. 6a, b). Соответственно, пролиферация Tgfbr2 -/- ILC2 в смешанных химерах BM, как описано на рис.1a был ниже, чем в контрольных ILC2, без изменений апоптоза (дополнительный рисунок 9a, b). Данные предполагают, что TGF-β также поддерживает гомеостаз зрелых ILC2 на периферии. Затем мы исследовали CD127 (IL-7R), который, как известно, связан с гомеостазом и поддержанием ILC2, но обнаружили, что Tgfbr2 -/- ILC2 демонстрируют нормальные уровни поверхностного CD127 (дополнительная рис. 9a). Соответственно, анализ РНК-секвенций показал, что экспрессия гена Il7r оставалась неизменной в Tgfbr2 -/- зрелых ILC2 по сравнению со зрелыми ILC2 WT (фиг.3б), исключая участие в этом эффекте передачи сигналов IL-7. Однако экспрессия мРНК ll1rl1 была значительно снижена в Tgfbr2 -/- ILC2 (рис. 3c). Кроме того, анализ проточной цитометрии подтвердил снижение белка ST2 в Tgfbr2 -/- ILC2, хотя эти клетки экспрессировали нормальный уровень GATA3 (рис. 6c, дополнительная рис. 9a). Данные предполагают, что уменьшение Tgfbr2 -/- зрелых ILC2 может быть связано с уменьшением ST2, а не GATA3 в этих нокаутных клетках на периферии.Чтобы предоставить дополнительные доказательства роли TGF-β1 в зрелых ILC2, мы культивировали зрелые ILC2, выделенные из LP, с IL-7 и различными концентрациями рекомбинантного TGF-β1, и обнаружили, что даже низкие концентрации TGF-β1 (например, 0,02–0,2 нг/мл) повышали уровни белка ST2 (рис. 6d) и мРНК Il1rl1 (рис. 6e). Примечательно, что те же концентрации TGF-β1 не смогли значительно изменить уровни белка GATA3 (рис. 6d) или мРНК Gata3, Bcl11b, Gfi1 и Rora (рис.6д). Таким образом, эти данные указывают на то, что передача сигналов TGF-β важна для поддержания зрелых клеток ILC2 на периферии посредством активации ST2.

Рис. 6: Передача сигналов TGF-β поддерживает зрелые ILC2 на периферии.

Сортированные зрелые ILC2S (CD45.2 + LIN CD127 + CD127 + CD25 + KLRG1 + ) в LP Tamoxifen- ( TGFBR2 – / – ) или обработанных маслом (контроль) мышей Tgfbr2 f/f ER-Cre + адоптивно пересаживали мышам Rag2 -/- Il2rg -4 6.Частоты и экспрессия Ki67 клеток GATA3 + KLRG1 + ILC2 среди клеток CD45.2 + Lin CD127 + в LP этих реципиентов оценивали с помощью проточной цитометрии через 12 дней. b Частота, общее количество и Ki67-положительный процент в LP ILC2, включенных в a ; n  = 3 мыши на группу. c Репрезентативные гистограммы FACS экспрессии ST2 с помощью ILC2 в легких Control/CD45.1 и Tgfbr2 -/- /CD45.1 БМ химеры. d Репрезентативные гистограммы FACS сортированных WT CD45.2 + Lin CD127 + Sca1 + CD25 + KlRG1 + в присутствии сплошной линии ILC или отсутствие (серая пунктирная линия) TGF-β1 и анализировали экспрессию GATA3 и ST2 среди живых клеток CD45 + Lin CD127 + через 3 дня. e Количественный анализ ОТ-ПЦР относительной экспрессии мРНК выбранных генов в очищенных ILC2 WT дикого типа, культивируемых в течение 24 ч в среде IL-7 отдельно или IL-7 плюс TGF-β1.В каждом эксперименте отсортированные клетки LP ILC2 объединяли от шести мышей в каждой группе перед культивированием. Данные двух независимых экспериментов объединены и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. * p  < 0,05, нс, не значимо (тест Стьюдента t ).

Тгфбр2 -/- ILC2 являются функционально дефицитными по отношению к HDM-индуцированному воспалению дыхательных путей

Хотя более раннее исследование показало, что эпителиальный TGF-β усиливает функцию ILC2 в легких, действуя в качестве хемоактивного фактора для ILC2 24 , внутреннее влияние дефицита TβR2 о функции клеток ILC2 еще полностью не изучено. Tgfbr2 -/- ILC2 в смешанных химерах BM снижали свою способность продуцировать сигнатурные цитокины ILC2 при повторной стимуляции PMA/иономицином по сравнению с контрольными ILC2 (рис. 1g, h). И наоборот, обработка TGF-β увеличивала выработку IL-5 и IL-13 с помощью ILC2, полученных из культур ILC2p дикого типа in vitro (дополнительная фигура 10). Затем мы предположили, что передача сигналов TGF-β также влияет на функцию ILC2. Чтобы проверить это, мы отсортировали WT и Tgfbr2 -/- ILC2 и усыновлено перенесли в Rag2 /- Il2rg -/- -/- -/- аллергическое воспаление дыхательных путей клещом домашней пыли (ВПВ) 19 (схема эксперимента представлена ​​на рис.7а). Гистологический анализ легких мышей, получавших HDM, выявил значительное снижение воспалительных инфильтратов и продукции слизи у мышей Rag2 -/- Il2rg / 9 Tgff . /− ILC2 по сравнению с WT ILC2 (рис. 7b). Более того, приемная передача TGFBR2 – / – ILC2 значительно снизилось количество эозинофилов как в легких, так и в бронхоальвеолярных жидкостях Lavage (Balf) в Rag2 – / – IL2RG /- мышей по сравнению с мышами дикого типа, перенесшими ILC2 (фиг.7в). Важно отметить, что частота и общее количество IL-5 + и IL-13 + ILC2 были значительно снижены в легких обработанных HDM Rag2 / − Il2rg – мышей, получивших Tgfbr2 / ILC2 (рис. 7d). Мы не смогли сравнить вышеупомянутые факторы между TGFBR2 / и WT ILC2S в легких безразличных Rag2 – / IL2RG / – мышей из-за недостаточное количество клеток, выделенных от мышей.Данные в целом указывают на то, что потеря передачи сигналов TGF-β приводит к уменьшению аллергического воспаления легких из-за снижения способности продуцировать цитокины ILC2. Таким образом, передача сигналов TGF-β также влияет на функцию ILC2, регулируя их сигнатурные цитокины.

Рис. 7: TβR2 –/– ILC2 функционально дефицитны в ответ на HDM-индуцированное воспаление дыхательных путей.

a Отсортированные зрелые ILC2 Tgfbr2 f/f ER-Cre + мышей, предварительно обработанных тамоксифеном ( Tgfbr2 -/- 9004 (контроль) 5 на мышь) в Rag2 -/- Il2rg -/- мышей.Двенадцать дней спустя мышам-реципиентам интраназально инъецировали 100 мкг HDM в 50 мкл PBS в дни 0–2 и дополнительно подвергали эвтаназии на 3 день. Собирали ЖБАЛ и рассекали легкие для анализа. b Воспалительные инфильтраты (черные стрелки) и секрецию слизи (красные стрелки) анализировали с помощью окрашивания H&E фиксированных формалином и залитых парафином срезов легких реципиента, получавшего HDM мышей. Шкала баров соответствует 200 мкм. c Общее количество эозинофилов в легком и/или ЖБАЛ у мышей, получавших HDM Rag2 -/- Il2rg -/- мышей, пересаженных с Tgfbr2 -/-LCs -/-LCs Контрольные ILC2 ( n  = 4 на группу). D Противодействие цитометрии Профили и резюме частоты и общее количество IL5 + ILC2S, IL-13 + ILC2S Gated As CD45.2 + LIN CD127 + CD25 + SCA1 + в легких обработанных HDM мышей Rag2 -/- Il2rg -/- мышей, которым перенесли Tgfbr2 -/- ILC2 и контрольные ILC2.Цифры указывают частоту событий проточной цитометрии ( n  = 4 на группу). Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. Данные представлены как среднее  ± SD; * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001 (тест Стьюдента t ).

Мужские часы Raymond Weil Tango 300 Diver 42 мм из нержавеющей стали 8280-ST2-20001

Бесплатная доставка доступна для заказов по Великобритании на сумму более 30 фунтов стерлингов –

Для товаров, перечисленных как имеющиеся на складе, ваш заказ должен быть выполнен до 16:00 (с понедельника по пятницу), чтобы мы отправили его в тот же день или до 11:30 в субботу для доставки в понедельник.Обратите внимание, что все заказы должны пройти нашу политику безопасности, прежде чем они будут отправлены, и мы должны быть в состоянии успешно принять платеж, если это невозможно, мы отправим электронное письмо или отправим SMS с дальнейшими инструкциями. По вопросам и вопросам доставки, пожалуйста, звоните нам по телефону 01926 298499.

Для других предметов по возможности будет показана оценка доставки. Если мы почувствуем, что не можем придерживаться графика после того, как вы разместите свой заказ, мы свяжемся с вами, чтобы сообщить вам и позволить вам изменить свой заказ, если это необходимо.Товары будут отправлены выбранным вами способом доставки, как только они вернутся на склад, и оплата не будет взиматься до тех пор, пока товары не будут отправлены (примечание. Заказы PayPal и Amazon оплачиваются немедленно).

Политика возврата

Мы стремимся к тому, чтобы вы были в полном восторге от своей покупки, и поэтому предлагаем вам 30 дней, чтобы передумать в отношении любого товара, приобретенного на этом веб-сайте. Вы можете сделать это, используя форму, прилагаемую к вашему заказу, или иным образом.Мы вернем все полученные платежи (не включая обновления доставки), как правило, в течение 48 часов с момента получения продукта. Это будет сделано для исходного метода оплаты. Для большинства способов оплаты потребуется 3-5 рабочих дней, чтобы это появилось в вашей выписке.

Пожалуйста, убедитесь, что товары из вашего заказа подходят, прежде чем надевать их, так как мы не можем принять товары, которые были надеты в соответствии с нашей политикой возврата.

Для заказов в Великобритании на сумму менее 1000 фунтов стерлингов вы можете создать бесплатную этикетку для отслеживаемого и застрахованного возврата на веб-сайте Royal Mail (откроется в новом окне).Вы можете бесплатно распечатать эту этикетку и отправить ее обратно в любое местное почтовое отделение. Также можно распечатать этикетку в почтовом отделении, используя QR-код из электронного письма с подтверждением. Пожалуйста, сохраните подтверждение почтовой квитанции. К сожалению, мы не можем возместить почтовые расходы при возврате другими способами, поэтому мы рекомендуем распечатать предоставленную бесплатную почтовую этикетку. Для заказов на сумму более 1000 фунтов стерлингов, пожалуйста, обратитесь к квитанции для получения подробной информации о том, как вернуть. При международном возврате вам необходимо будет оплатить почтовые расходы по возврату.Пожалуйста, убедитесь, что часы возвращены нам в неношеном, новом состоянии со всей оригинальной упаковкой (руководство производителя и гарантия, если применимо). Пожалуйста, убедитесь, что товары из вашего заказа подходят, прежде чем надевать их, так как мы не можем принять товары, которые были надеты в соответствии с нашей политикой возврата. Мы оставляем за собой право делать вычеты за ненужный ущерб, причиненный продукту вами.

При необходимости мы также можем предложить обмен на другой товар, укажите это при возврате товара.

Если неисправность возникает в часах, срок возврата которых превышает 30 дней, или они больше не находятся в новом состоянии, часы могут быть возвращены производителю в соответствии с условиями гарантии (мы являемся официальным британским дилером всех марок на наш веб-сайт), чтобы они могли исправить любые проблемы. Для получения дополнительной информации см. нашу страницу политики возврата.

Первое впечатление: Ducati ST2 – Motorcycle.com


Долгожданное появление Ducati в одном из самых быстрорастущих сегментов мотоциклетного спорта наконец-то было представлено U.S.S. на рынок в этом месяце, когда в Санта-Барбаре, штат Калифорния, состоялось официальное открытие спортивно-туристического автомобиля ST2 1998 года выпуска.

Ducati ST2 призван взять лучшее из традиционного высокопроизводительного наследия итальянской фирмы, наряду с их отличительными элементами стиля, и превратить их в непревзойденную, но в то же время удобную спортивно-туристическую машину. Оснащенный одним из последних 90-градусных десмо V-образных твинов Ducati, ST2 оснащен обычным набором удобств для туристических существ: приподнятый руль, более мягкие пружины и демпфирование, а также увеличенное двойное седло с улучшенной набивкой.

Шасси ST2 представляет собой одну из знакомых трубчатых рам Ducati, аналогичную шасси 916 по жесткости на кручение и легкости. К рулевой колонке прикреплена пара 43-миллиметровых перевернутых вилок Showa с полной регулировкой, а задняя часть поддерживается одним амортизатором, позаимствованным у 916 и переработанным для статуса ST2 как двухместной туристической машины.

Передние тормоза оснащены двойными 320-миллиметровыми плавающими дисками Brembo и четырехпоршневыми суппортами, обеспечивающими отличное ощущение и мощность.Сзади вы найдете один 245-миллиметровый диск с двухпоршневым суппортом, который, как мы обнаружили, дает плохую обратную связь. На ST2 устанавливаются новейшие спортивные радиальные колеса Metzeler MEZ4 размером 120/70 ZR17 спереди и 170/60 ZR17.

В этой стальной паутинной раме расположилась новейшая версия 90-градусного V-образного двигателя Ducati с жидкостным охлаждением, увеличенного до 944 см³ для использования в ST2. SOHC, 2-клапанные десмо-головки, аналогичные установке, используемой на ранних моделях Ducati Paso, используются на мельнице ST2. В сочетании с компрессией 10,2:1 и электронным впрыском топлива Marelli Ducati развивает мощность 83 л.с. при 8500 об/мин.

Помимо мощной силовой установки V-twin, еще одной сильной стороной ST2 является эргономика. Его немного выдвинутая вперед посадка, более низкое расположение подножек и более высокий руль, кажется, обеспечивают хороший баланс между спортивной ездой и комфортом в туре. Двойное седло довольно большое, и мы обнаружили, что в нем достаточно места для путешествий вдвоем. Запираемые жесткие сумки, казалось, предлагают достаточно места для багажа для поездки на выходные на двоих, но мы не смогли поместить полнолицевой шлем ни в одну из сумок, как утверждает Ducati.

Подходящие по цвету сумки крепятся с помощью системы, похожей на туристический багаж BMW, и могут быть легко сняты с велосипеда. Ducati применила конструктивную особенность мешков, которая позволяет поднять выхлопные трубы для увеличения дорожного просвета, когда мешки сняты. Приятное прикосновение. Ducati заявила, что ST2 должен стоить около 12 000 долларов и поступит в продажу в США к 1 октября (за исключением Калифорнии, где ожидаемая доступность ожидается не раньше декабря).

Наша короткая поездка на ST2 по узким, извилистым городским улицам Санта-Барбары показала быстрый управляемый байк, который можно было легко перевернуть, несмотря на дополнительный вес его туристического снаряжения.Конечно, было то безошибочное ощущение и крутящий момент Duc desmo V-twin с чрезвычайно удобной посадкой для двоих, которая должна хорошо подходить для спортивно-туристических поездок. У нас не было возможности использовать большую мощность двигателя, но мы планируем вскоре получить тестовый мотоцикл ST2, чтобы испытать его темпы и сразиться с парой других двухцилиндровых спорт-туристов. Следите за обновлениями.

   Технические характеристики   
 Производитель: Ducati
Модель: СТ2
Цена: 12 000 долларов США
Двигатель: с жидкостным охлаждением, SOHC, 2-клапанный, 90-градусный V-Twin
Отверстие x Ход: 94 мм x 68 мм
Рабочий объем: 944 см3
Карбюратор: электронный впрыск топлива Weber-Marelli
Трансмиссия: 6-ступенчатая
Колесная база: 56.3 дюйма
Высота сиденья: 32,8 дюйма.
Запас топлива: 6,0 галлона (включая резерв 1,0 галлона)
Заявленный сухой вес: 466 фунтов. 

Нарушенная активация IL-33/ST2 в децидуализирующихся стромальных клетках продлевает восприимчивость матки у женщин с невынашиванием беременности

Abstract

Децидуализация делает эндометрий временно восприимчивым к имплантируемой бластоцисте, хотя лежащие в его основе механизмы остаются не до конца изученными. Здесь мы показываем, что человеческие эндометриальные стромальные клетки (HESCs) быстро высвобождают IL-33, ключевой регулятор врожденных иммунных ответов, при децидуализации.Параллельно с этим дифференцирующиеся HESC активируют трансмембранный рецептор IL-33 ST2L и другие провоспалительные медиаторы, прежде чем вызвать глубокий противовоспалительный ответ, который включает подавление ST2L и усиление экспрессии растворимого рецептора-приманки sST2. Мы показываем, что HESC секретируют факторы, способствующие имплантации эмбриона у мышей, только во время провоспалительной фазы децидуального процесса. Нокдаун IL-33 в недифференцированных HESCs был достаточным, чтобы отменить этот провоспалительный децидуальный ответ.Кроме того, последовательная активация оси IL-33/ST2L/sST2 была нарушена при децидуализации HESC у женщин с привычным невынашиванием беременности. Сигналы от этих культур удлиняли окно имплантации, но также вызывали последующее прерывание беременности у мышей. Таким образом, активация IL-33/ST2 в HESCS вызывает аутовоспалительный ответ, который контролирует временную экспрессию генов рецептивности. Отсутствие контроля над этой реакцией предрасполагает к выкидышу, поскольку допускает внефазовую имплантацию в неблагоприятной среде матки.

Образец цитирования: Salker MS, Nautiyal J, Steel JH, Webster Z, Šućurović S, Nicou M, et al. (2012) Нарушенная активация IL-33/ST2 в децидуализирующихся стромальных клетках продлевает восприимчивость матки у женщин с невынашиванием беременности. ПЛОС ОДИН 7(12): е52252. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252

Редактор: Йорг Герман Фриц, Университет Макгилла, Канада

Поступила в редакцию: 12 сентября 2012 г.; Принято: 9 ноября 2012 г.; Опубликовано: 27 декабря 2012 г.

Авторское право: © 2012 Salker et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Отделом биомедицинских исследований в области репродуктивного здоровья, совместной инициативой университетских больниц Ковентри и Уорикширского национального фонда здравоохранения и Медицинской школы Уорика, а также Исследовательского фонда генезиса (MSS).Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Для успешной беременности эндометрий человека должен сначала вступить в контакт с компетентным эмбрионом, внедрить зародыш в децидуализирующуюся строму, а затем поддержать глубокое проникновение внеэмбрионального трофобласта в матку [1], [2]. Эти динамичные события требуют тщательно подготовленной специализированной микросреды матки.Процесс подготовки к беременности начинается с постовуляторного скачка уровня циркулирующего прогестерона, который, в свою очередь, подавляет эстроген-зависимую пролиферацию маточного эпителия, вызывает секреторную трансформацию маточных желез и рекрутирует маточные естественные киллеры (uNK), макрофаги и другие иммунные клетки. к эндометрию [3], [4], [5]. Впоследствии просветный эпителий экспрессирует эволюционно законсервированный репертуар молекул, необходимых для стабильного взаимодействия и прикрепления бластоцисты, что делает возможной имплантацию [6], [7], [8].Важно отметить, что рецептивность представляет собой преходящее состояние эндометрия, ограниченное несколькими днями средней секреторной фазы цикла и зависящее от паракринных сигналов от стромальных клеток, лежащих в основе эпителия просвета [9], [10]. Считается, что отсутствие экспрессии рецептивного фенотипа является основной причиной недостаточной фертильности и неудачного лечения ЭКО [11], [12]. И наоборот, пролонгированная рецептивность эндометрия способствует имплантации отсроченных или скомпрометированных эмбрионов и тесно связана с ранней потерей беременности [12], [13], [14].Таким образом, время и продолжительность так называемого «окна имплантации» являются основными эндометриальными детерминантами вероятности репродуктивного успеха.

Децидуализация обозначает процесс дифференцировки, посредством которого резидентные стромальные клетки эндометрия приобретают специализированный секреторный фенотип [15], [16]. Фактически, секретируемые факторы, такие как пролактин (PRL) и белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 1 (IGFBP1), широко используются для оценки качества децидуального ответа в стромальных клетках эндометрия человека (HESCs) [17].Следовательно, децидуализация наделяет стромальные клетки способностью создавать паракринные градиенты, необходимые для рецептивности матки и поддержки постимплантационной беременности. Децидуальные клетки также функционируют как привратники различных иммунных клеток на границе плода и матери. Например, дифференцирующиеся HESC секретируют интерлейкин 11 (IL-11) и IL-15, участвующие в рекрутировании и дифференцировке маточных естественных киллеров (uNK), которые, в свою очередь, являются богатым источником ангиогенных факторов [18], [19]. [20].С другой стороны, было показано, что децидуальные клетки, окружающие раннее зачатие, эпигенетически замалчивают ключевые гены хемокинов, тем самым защищая аллогенный плод от инфильтрации цитотоксическими Т-лимфоцитами [21]. Чтобы выполнить это множество функций, децидуальные клетки должны динамически адаптироваться и приспосабливать свой секретом к различным стадиям процесса имплантации [22]. Механизмы, которые контролируют эти временные изменения фенотипа децидуальных клеток в течение окна имплантации, в значительной степени неизвестны.Парадигма Th2/Th3 использовалась для описания изменения воспалительного микроокружения эндометрия на ранних сроках беременности [23], [24]. Хотя считается, что ответ Th2-типа, характеризующийся индукцией провоспалительных цитокинов (например, IL-2, IL-12 и интерферона-γ), лежит в основе рецептивности эндометрия и ранней имплантации, преобладание регуляторных или противовоспалительных (Th3 -типа) цитокинов (например, ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10), по-видимому, необходимы для поддержания беременности [25].

IL-33, член семейства IL-1, является ключевым регулятором воспалительных и иммунных процессов [26], [27], [28].Впервые он был идентифицирован как ядерный фактор в эндотелиальных клетках. Впоследствии было показано, что IL-33 является мощным провоспалительным сигналом опасности, или алармином, высвобождаемым из некротических клеток при травме или инфекции [29]. Как ядерный фактор, IL-33 может быть вовлечен в репрессию транскрипции и регуляцию уплотнения хроматина, способствуя нуклеосомно-нуклеосомным взаимодействиям [30]. Однако провоспалительные эффекты IL-33 требуют клеточного высвобождения и связывания с его рецептором клеточной поверхности, состоящим из ST2, члена семейства рецепторов IL-1 и кодируемого IL1LR1 , и вспомогательного IL-1R. белок (IL-1RAcP) [26], [31].Существуют две основные изоформы ST2: длинная трансмембранная форма (ST2L) и растворимый рецептор-ловушка (sST2), в котором отсутствуют как трансмембранный, так и внутриклеточный домены [26]. ST2L широко экспрессируется на эффекторных иммунных клетках, включая Т-лимфоциты, NK- и NKT-клетки, эозинофилы, базофилы и тучные клетки, что позволяет IL-33 управлять защитой хозяина от патогенов и врожденными иммунными ответами [32]. Секретируемый sST2 связывает и ингибирует IL-33, таким образом, выступая в качестве мощного противовоспалительного медиатора [26].

Здесь мы сообщаем, что активация пути IL-33/ST2 в децидуализирующихся HESC индуцирует самоограничивающийся аутовоспалительный ответ, который контролирует временную экспрессию генов восприимчивости матки.Мы также предоставляем доказательства того, что способность HESC сдерживать эту провоспалительную реакцию при децидуализации нарушена у пациенток, страдающих привычным невынашиванием беременности (ПНБ), что позволяет имплантацию эмбриона в неблагоприятной среде матки.

Методы

Отбор пациентов и сбор образцов

Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований Hammersmith and Queen Charlotte & Chelsea (1997/5065). Письменное информированное согласие было получено от всех пациенток перед забором эндометрия.Субъекты обращались в клинику по поводу задержки зачатия (контрольная группа) или RPL и обследовались в соответствии со стандартными клиническими протоколами. RPL определяли как три или более последовательных невынашивания беременности до 24 недель беременности. Биопсии Pipelle были получены на протяжении всего цикла или приурочены к средней секреторной фазе. Набор для прогнозирования овуляции (Assure Ovulation Predictor, Сан-Диего, Калифорния, США) использовали для получения образцов через 6–10 дней после предовуляторного всплеска ЛГ (от LH+6 до LH+10).

Первичные культуры HESC

HESC были выделены из тканей эндометрия, как описано ранее [33].Очищенные HESC размножали в поддерживающей среде DMEM/F-12, содержащей 10% покрытую декстраном фетальную бычью сыворотку, обработанную углем (DCC-FBS), и 1% раствор антибиотика-антимикотика. Конфлюэнтные монослои децидуализировали в среде DMEM/F-12, содержащей 2% DCC-FBS с 0,5 мМ 8-бром-цАМФ (8-br-cAMP; Sigma, Poole, UK) с 10 –6 М медроксипрогестерона ацетата (МПА) или без него. ; Sigma), чтобы индуцировать дифференцированный фенотип. Использовали рекомбинантный человеческий IL-33 в концентрации 0,1 нг/мл (R&D Systems, Великобритания). Все эксперименты проводили до третьего пассажа клеток.

Эксперименты на животных

мыши C57BL/6 были приобретены у Charles River Ltd (Маргейт, Великобритания), и все эксперименты проводились в соответствии с правилами Министерства внутренних дел Великобритании (PPL70/6867). Для примирования матки неполовозрелым самкам мышей вводили гормональную терапию, состоящую из 10 мг/кг/день β-эстрадиола (Sigma, Великобритания) в течение трех дней подряд с последующим однократным приемом 1 мг прогестерона (Sigma, Великобритания). Затем животных анестезировали, подвергали лапаротомии и в оба рога матки инъецировали в течение 5 мин 50 мкл культурального супернатанта из недифференцированных или децидуализированных первичных ГЭСК или контрольной (некондиционированной) среды.Шейка матки не пережата. Затем разрез закрывали, и через 24 часа животных подвергали эвтаназии. Рога матки разрезали и либо фиксировали в формалине, либо быстро замораживали и хранили при -80°С. Для оценки имплантации самок мышей C57BL/6 скрещивали со стерильными самцами, а день появления вагинальной пробки обозначали как 0 дней после коитуса (d.p.c.). Лапаротомия была выполнена через 2,5 дня после операции. В оба рога матки вводили кондиционированную или некондиционированную культуральную среду, как описано выше.Через 10 минут 10 бластоцист (эквивалентно 3,5 d.p.c.) перенесли в один обработанный рог матки. Матки собирали через 3 или 6 дней после операции, подсчитывали места ипсилатеральной имплантации и ткани фиксировали в формалине или быстро замораживали для дальнейшего анализа.

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT) и массивы ПЦР

Тотальную РНК экстрагировали из культур HESC с использованием Stat60 (Tel-Test, Friendswood, TX, USA). Качество РНК оценивали с помощью Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния, США). Равные количества тотальной РНК (2 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой нити Superscript для ОТ-ПЦР (Invitrogen), и полученную кДНК использовали в качестве матрицы в анализе qRT-PCR. Пары геноспецифических праймеров, разработанные с помощью программного обеспечения Primer3, доступны по запросу. L19 и циклофилин представляют собой нерегулируемые гены человека и мыши, соответственно, и их экспрессию использовали для нормализации вариаций во вводимой кДНК. Детекцию экспрессии генов проводили с помощью JumpStart-SYBR Green (Sigma) и системы обнаружения последовательности ABI stepONE Plus (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США).Уровни экспрессии образцов выражали в условных единицах, определенных методом ΔΔ C T . Все измерения проводились в трехкратной повторности. Анализ кривой плавления и электрофорез в агарозном геле подтвердили специфичность амплификации.

The RT 2 Profiler Медиаторы и рецепторы воспаления человека Массив ПЦР (SA Biosciences), содержащий 84 гена, связанных с воспалительным путем, а также гены «домашнего хозяйства» и контроли, использовали для анализа экспрессии генов, связанных с иммунитетом, в HESCs.2 мкг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора First Strand (SA Biosciences), объединяли с мастер-миксом SYBR Green/ROX PCR (SA Biosciences) и добавляли в каждую лунку планшета RT 2 Profiler PCR, содержащего предварительно выданные наборы праймеров для гена. Реакцию проводили на ABI-stepONE Plus. Анализ данных был основан на методе C T с нормализацией к четырем различным генам домашнего хозяйства. Измерения проводились в трех повторах на первичных культурах от 3 субъектов.

Трансфекция и окрашивание йодидом пропидия

первичных HESC трансфицировали малой интерферирующей РНК (siRNA) методом соосаждения с фосфатом кальция с использованием набора для трансфекции млекопитающих Profection (Promega, Madison, WI), как описано ранее [33]. Для молчания генов недифференцированные HESC временно трансфицировали 50 нМ следующих реагентов siRNA: IL1RL1-siGENOME SMARTpool, IL-33-siGENOME SMARTpool или siCONTROL Non-Targeting, приобретенных у Dharmacon (Лафайет, Колорадо, США).Параллельные культуры собирали либо в буфере RIPA для вестерн-блоттинга, либо промывали PBS, фиксировали холодным 70% этанолом, окрашивали йодидом пропидия (Sigma), обрабатывали рибонуклеазой-А (Qiagen, Германия) и подвергали анализу проточной цитометрией. Степень апоптоза в первичных культурах оценивали путем измерения фракции суб-G1 (<2N). Исследования трансфекции проводили в трех повторах и повторяли на первичных культурах от 3 субъектов.

Вестерн-блоттинг

Экстракты белков цельных клеток готовили путем лизиса клеток в буфере RIPA.Выход белка определяли с помощью набора для анализа белка Bio-Rad DC (Bio-Rad, США). Равные количества белка разделяли электрофорезом в 10% SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) перед влажным переносом на мембрану PVDF (Amersham Biosciences, UK). Сайты неспецифического связывания блокировали инкубацией в течение ночи с 5 % обезжиренного сухого молока в Трис-буферном солевом растворе с 1 % Твина (TBS-T; 130 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л Трис, pH 7,6 и 1 % Твин), как и ранее. описано [33]. Использовали следующие первичные антитела: анти-ST2 и анти-IL-33 Abcam (Кембридж, Великобритания), сайт расщепления против PARP (214/215) от BioSource International (Камарильо, Калифорния).Первичные антитела использовали в концентрации 1∶1000, за исключением антител к β-актину (Abcam), разведенных в концентрации 1∶100000. Белковые комплексы визуализировали с помощью набора для хемилюминесцентной детекции (GE Healthcare, Великобритания).

Иммуноферментный анализ (ELISA) растворимых ST2 и IL-33

Уровни растворимых ST2 и IL-33 в культуральных средах HESC определяли с помощью амплифицированного двухэтапного иммуноанализа сэндвич-типа (DuoSet®; R&D Systems, США) в соответствии с протоколом производителя.Результаты были получены с использованием метода стандартной кривой.

Тканевой микрочип и конфокальная микроскопия

Игольчатые стержни (диаметром 1 мм и глубиной 0,4 см) поверхностного слоя эндометрия были получены из фиксированных формалином и залитых парафином хронометрированных (LH+5 до +8) образцов эндометрия (n  = 10), которые были помещены в реципиент блок для построения тканевого микрочипа. Срезы размером 3 мкм окрашивали на IL-33 (1∶800; Sigma), как описано ранее [34]. Желудок использовали в качестве положительного контроля, а первичное антитело не использовали в качестве отрицательного контроля.Иммуноокрашивание визуализировали с помощью MIRAX Viewer (Zeiss, Германия). Иммуноцитохимию проводили на первичных HESC, культивируемых на предметных стеклах. Клетки либо не обрабатывали, либо обрабатывали 8-br-цАМФ в течение 12 ч (Sigma, Великобритания). Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде и пермеабилизировали 0,5% тритоном, а затем инкубировали в течение ночи при 4°C во влажной камере с антителом против IL33 (1∶400, Sigma). В качестве вторичного антитела использовалось Alexa Fluor® 488 (1∶200; Invitrogen). Предметные стекла монтировали с помощью proGOLD (Invitrogen) и окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации ядер.Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Leica SP5 II.

Анализ жизнеспособности клеток

Культивируемых HESC высевали в 96-луночные черные планшеты с прозрачным дном и выдерживали в 10% DCC/DMEM до слияния. Клетки трансфицировали с помощью или без миРНК, нацеленной на IL-33 или ST2, а затем последовательно децидуализировали или не обрабатывали в течение 4 дней. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ

Данные анализировали с помощью статистического пакета Graphpad Prism (Graphpad software Inc). При необходимости использовали критерий хи-квадрат Пирсона, критерий Стьюдента t и U-критерий Манна-Уитни. Логарифмические преобразования использовались, когда данные не были нормально распределены. Статистическую значимость принимали, когда P <0,05.

Результаты

Ось IL-33/ST2L/sST2 в децидуализации HESC

IL1RL1 был идентифицирован микрочиповым анализом как сильно индуцируемый в HESC, децидуализированных 8-br-cAMP и прогестином медроксипрогестерона ацетатом (MPA) в течение 72 часов [35].Он также был обнаружен в эндометрии павианов во время имплантационного окна [36]. Чтобы исследовать функцию этого рецептора в децидуальном процессе, мы сначала разработали праймеры для амплификации всех транскриптов ST2 или селективной мРНК ST2L (Fig. S1). Интересно, что в то время как децидуализация вызывала заметное и зависящее от времени увеличение общего количества транскриптов ST2 (рис. 1А), уровни мРНК ST2L следовали двухфазному характеру, характеризующемуся сильной индукцией через 2 дня лечения 8-br-цАМФ и МФК с последующим постепенным снижением (рис.1В, верхняя панель). Этот паттерн регуляции мРНК ST2L был воспроизведен на уровне белка (рис. 1В, нижняя панель). Анализ культуральных супернатантов показал, что HESCs секретируют возрастающие количества sST2 по мере развития децидуального процесса (Fig. 1C). Затем мы проверили, экспрессируют ли HESC также IL-33. Поразительно, экспрессия транскриптов IL-33 в децидуализирующихся HESCs была параллельна экспрессии ST2L с уровнями, достигающими пика через 2 дня дифференцировки (Fig. 1D, верхняя панель). Вестерн-блоттинг показал, что IL-33 в изобилии присутствует в недифференцированных HESCs, однако его клеточные уровни быстро снижаются при децидуализации (рис.1D, нижняя панель). Уровни IL-33 в культуральном супернатанте увеличились в 7 раз в течение 2 дней децидуализации, что указывает на то, что этот воспалительный цитокин/алармин активно высвобождается HESC в ответ на передачу сигналов цАМФ и МФК (рис. 1Е). В подтверждение конфокальная микроскопия подтвердила, что IL-33 является почти исключительно ядерным в недифференцированных клетках. Воздействия децидуализирующего сигнала в течение 12 ч было достаточно, чтобы индуцировать цитоплазматические фокусы IL-33, что свидетельствует об активной секреции (рис. 1F). Анализ микрочипов тканей выявил интенсивное, но гетерогенное ядерное окрашивание IL-33 как в эпителиальных, так и в стромальных клетках в среднесекреторном эндометрии, хотя были признаки цитоплазматической иммунореактивности в децидуализирующихся стромальных клетках, лежащих в просвете (рис.2). В совокупности данные показывают, что параллельная дифференцировка HESC повышает экспрессию ST2L и высвобождает IL-33 перед секрецией увеличивающихся количеств sST2.

Рисунок 1. Ось IL-33/ST2L/sST2 при децидуализации HESC.

( A ) Уровни общего транскрипта ST2 измеряли в первичных культурах HESC, обработанных 8-бром-цАМФ (цАМФ) и МФК в указанные моменты времени. ( B ) Уровни мРНК ST2L, выраженные в условных единицах (AU), определяли в первичных культурах, децидуализированных в течение 2–8 дней (верхняя панель).Все клеточные лизаты из параллельных культур исследовали на экспрессию ST2L (нижняя панель). β-актин служил в качестве контроля нагрузки. ( C ) Культуральный супернатант собирали каждые 48 часов и определяли уровни накопленного sST2 с помощью ELISA. ( D ) Индукция и высвобождение IL-33 в децидуализирующихся клетках. мРНК и белок IL-33 легко обнаруживались в недифференцированных HESC. Уровни мРНК IL-33 быстро повышались в ответ на цАМФ и МФК (верхняя панель), но уровни общего клеточного белка постепенно снижались при децидуализации (нижняя панель).( E ) IL-33 быстро накапливался в культуральном супернатанте в ответ на передачу сигналов цАМФ и MPA ( F ) HESC, культивированные на предметных стеклах камеры, подвергали децидуализации в течение 12 часов и окрашивали на предмет экспрессии IL-33 (зеленый). Ядра визуализировали с помощью DAPI (не показано). Наложенные изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии. Масштабная линейка: 25 мкм. Количественные данные представляют собой среднее значение (± стандартное отклонение) биологических трех повторных экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g001

Рисунок 2. Репрезентативная экспрессия IL-33 в среднесекреторном эндометрии человека.

Срезы тканей были депарафинированы, регидратированы и окрашены IL-33-специфическими антителами. Всего было проанализировано 12 биопсий от контрольных субъектов. ( A ) Сильная ядерная иммунореактивность IL-33 наблюдалась как в компартменте стромальных, так и эпителиальных клеток (исходное увеличение ×20). ( B ) Более высокое (× 50) увеличение указанной области также показывает диффузное цитоплазматическое окрашивание IL-33, особенно вблизи просветного эпителия ( C ). В некоторых образцах окрашивание IL-33 было очень неоднородным.Например, эпителиальные клетки, соседние с железой, могут быть сильно положительными и отрицательными в отношении экспрессии IL-33. (Шкала: 100 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g002

Конвергенция путей цАМФ и прогестерона приводит к децидуализации ГЭСК [5]. Чтобы изучить, как эти различные пути влияют на ось IL-33/ST2L/sST2, первичные культуры обрабатывали в течение 72 часов 8-br-цАМФ или МФК в присутствии или в отсутствие рекомбинантного IL-33.В то время как передача сигналов цАМФ стимулировала экспрессию IL-33, она снижала базальные уровни мРНК ST2 (рис. 3А и В). Рекомбинантный IL-33 незначительно усиливал индукцию транскриптов IL-33 в ответ на 8-br-цАМФ (фиг. 3А). И наоборот, MPA не влиял на уровни IL-33 в HESC, но стимулировал экспрессию транскриптов ST2 (рис. 3B и C). Интересно, что рекомбинантный IL-33 стимулировал секрецию sST2 за счет экспрессии мРНК ST2L (рис. 3C и D). Таким образом, цАМФ-зависимая экспрессия IL-33 взаимодействует с прогестинами, вызывая противовоспалительный ответ, примером чего является повышающая и понижающая регуляция sST2 и ST2L соответственно.

Рисунок 3. Индукция экспрессии ST2 и IL-33 регулируется по-разному.

Первичные культуры HESC обрабатывали либо 8-br-цАМФ, либо МФК в присутствии или в отсутствие рекомбинантного IL-33 в течение 72 часов и ( A-C ) IL-33, измеряли общие уровни транскриптов ST2 и ST2L. ( D ) Уровни секретируемого ST2, накопленные за 72 часа, измеряли с помощью ELISA. Данные представляют собой среднее значение (± стандартное отклонение) биологических трехкратных экспериментов с первичными культурами, полученными из 3 различных биопсий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g003

Временный провоспалительный децидуальный ответ, обеспечивающий рецептивность эндометрия

Характер индукции IL-33 в децидуализирующихся HESCs аналогичен таковому PROK1, провоспалительного имплантационного цитокина [13]. Мы предположили, что двухфазная регуляция может распространяться на другие медиаторы воспаления, экспрессируемые дифференцирующимися HESC. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали массив qRT-PCR для измерения экспрессии 84 хемокинов, цитокинов, интерлейкинов и их рецепторов в недифференцированных и децидуализирующихся культурах.Лечение 8-br-цАМФ и МФК в течение 2 дней было достаточным для значительного повышения активности 70 медиаторов воспаления (более чем в 1,5 раза, P <0,01; рис. 4 и таблица 1). При этом отсечении только 3 транскрипта ( CCL11 , IL-10 и TNF-α ) были подавлены на этой стадии децидуального процесса. К 8 дню дифференцировки 12 транскриптов оставались повышенными, но 34 теперь были ниже по сравнению с их экспрессией в недифференцированных клетках (таблица 1 и рис. S2A).Таким образом, высвобождение IL-33 и индукция его трансмембранного рецептора в HESCs является частью существенного, но временного дифференцированно-зависимого провоспалительного ответа, в котором участвуют многие хемокины, интерлейкины и другие медиаторы.

Рис. 4. Тепловая карта относительного изменения транскриптов, кодирующих медиаторы воспаления, при лечении 8-бром-цАМФ и МФК в течение 2 или 8 дней (D2 или D8 соответственно).

Изменение кратности относится к уровням транскриптов в недифференцированных клетках.Первичные культуры были созданы из 3 различных биопсий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g004

Мы предположили, что растворимые факторы, секретируемые стромальными клетками во время провоспалительной фазы децидуального процесса, могут служить сигналами, которые делают эндометрий восприимчивым. Для проверки этой гипотезы кондиционированную среду первичных культур HESC, децидуализированных 8-br-цАМФ и МФК, собирали каждые 48 ч в течение 10 дней. Просвет матки неполовозрелых самок мышей C57BL/6, примированных прогестероном и эстрадиолом, затем промывали при лапаротомии некондиционированной средой или культуральным супернатантом из недифференцированных HESC, или из клеток, децидуализированных в течение 4 или 10 дней.Животных умерщвляли через 24 ч и экспрессию группы генов восприимчивости матки исследовали с помощью анализа qRT-PCR. Растворимые факторы, накопленные в супернатанте первичных культур, децидуализированных в течение 4 дней, активировались в эндометрии мышей Lif , Bmp2 , Il-1β , Wnt4, Hb-egf, и Hoxa10 (рис. 5). Этот ответ сопровождался сильным увеличением транскриптов Il-33 и St2l . За исключением Hb-egf и Hoxa10, , способность культивируемых HESC генерировать паракринные сигналы, активирующие гены рецептивности, была снижена или утрачена к 10 дню децидуализации.Ингибирование экспрессии и активности Sgk1 в просветном эпителии является еще одной важной особенностью окна имплантации [37]. Кондиционированная среда из недифференцированных HESC сильно повышала уровни мРНК Sgk1 в матке мыши, тогда как эта индукция была менее выраженной в ответ на сигналы от HESC, децидуализированных в течение 4 дней (фиг. 5).

Рисунок 5. Экспрессия генов рецептивности в матке мыши в ответ на сигналы HESC.

В рога матки гормонально примированных самок мышей C57B/6 вводили либо некондиционированную среду (UM), культуральный супернатант недифференцированных HESC (D0), либо культуры, децидуализированные в течение 4 или 8 дней (D4 и D10 соответственно).qRT-PCR использовали для определения экспрессии в матке через 24 часа следующих транскриптов: ингибирующего лейкемию фактора ( Lif ), интерлейкина 1-β ( Il-1β ), гепарин-связывающего EGF ( Hb-egf ), кости морфогенетический белок 2 ( Bmp2 ), сайт интеграции MMTV 4 ( Wnt4 ), гомеобоксный белок 10 ( Hoxa10 ), IL-33, трансмембранный ST2 ( St2l ), сывороточный и глюкокортикоидный индуцируемая киназа 1 ( Sgk1 ). Уровни транскриптов нормализовали к уровням мРНК циклофилина-В ( Cyclo ) и выражали в произвольных единицах (A.У.). Результаты представляют собой среднее выражение (± SD). Всего в каждой лечебной группе было проанализировано 6 рогов матки. * Р <0,05; ** Р <0,01; *** Р <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g005

Чтобы проверить, контролируют ли децидуализирующие HESC имплантацию эмбриона, эксперименты по промыванию матки были повторены с псевдобеременными самками мышей, спариваемыми со стерильными самцами за 2,5 дня до операции. Приблизительно через 10 минут после люминальной инъекции среды, кондиционированной HESC, 10 культивируемых бластоцист [эквивалентно 3.через 5 дней после полового акта (d.p.c)] переносили в один рог матки. Количество мест имплантации определяли через 72 ч (эквивалентно 6,5 дпк). Из 60 эмбрионов, перенесенных в каждой лечебной группе, 42 (70%) и 45 (75%) эмбрионов не смогли имплантироваться после предварительного воздействия на просвет матки сигналов от недифференцированных HESC или клеток, децидуализированных в течение 10 дней, соответственно (рис. 6А и Б). Это контрастировало с 43 (72%) успешными имплантациями после промывки кондиционированной средой ГЭСК, дифференцированных с 8-br-цАМФ и МПА, в течение 4 дней.Таким образом, децидуализирующиеся HESC временно производят факторы, способствующие беременности в этой межвидовой модели. Кроме того, после воздействия на просвет матки факторов, секретируемых недифференцированными HESCs или клетками, децидуализированными в течение 10 дней, было отмечено несколько патологических особенностей, включая очаговое кровотечение и инфильтрацию иммунных клеток вокруг зачатия (рис. 6C). Напротив, места имплантации после воздействия растворимых сигналов от децидуальных клеток на 4-й день оказались гистологически нормальными.

Рис. 6.Децидуализирующиеся HESC временно продуцируют факторы, способствующие имплантации эмбриона в матку мыши.

( A ) Стерильные спаренные самки мышей C57BL/6 подвергали лапаротомии, и оба рога матки осторожно промывали культуральным супернатантом из недифференцированных HESC (D0) или из культур, децидуализированных в течение 4 или 10 дней (D4 и D10 соответственно). Затем в правый рог переносили десять эмбрионов (эквивалентно стадии 3,5 dpc). Каждая лечебная группа состояла из 6 животных. Количество мест имплантации в правом роге определялось 6.5 д.п.к. Скорость имплантации была значительно выше после воздействия сигналов от клеток D4 по сравнению с клетками HESCs D10 или D0 ( P <0,001). ( B ) Макроскопический вид матки на 6,5 d.p.c. (Масштабная линейка; 1 см). ( C ) Окрашивание репрезентативных мест имплантации H&E. Патологические особенности, такие как плохая децидуальная реакция с пикнотическими и кариорректическими ядрами стромальных клеток (стрелки), часто наблюдались в местах имплантации после воздействия растворимых факторов, секретируемых клетками D0 HESCs.Места имплантации в матке, предварительно обработанные кондиционированной средой D4 HESC, выглядели нормальными, показывая инвазию трофобласта (T) и развитие крупных децидуальных (D) клеток. Эпителиальные клетки также отсутствовали в этих местах имплантации. Петехии и очаговые кровотечения (указатели стрелок) и лейкоцитарные инфильтраты (*) наблюдались в предполагаемых местах имплантации в матке, предварительно обработанной супернатантами HESC D10. В этих участках часто обнаруживался просветный эпителий и небольшие недецидуализированные стромальные клетки, что свидетельствует о неудачной имплантации.(Шкала шкалы: 100 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g006

Передача сигналов аутокринного IL-33 в HESC способствует имплантации эмбрионов

Одновременная индукция ST2L и высвобождение накопленного IL-33 предполагает активацию аутокринного пути, возможно, участвующего в координации экспрессии провоспалительных генов в децидуализирующихся клетках. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали миРНК для подавления ST2L или IL-33 перед дифференцировкой первичных культур HESC (рис.7А). Нокдаун ST2L не только значительно ослаблял индукцию децидуальных маркеров, PRL и IGFBP1 , но также нарушал жизнеспособность децидуализирующихся клеток (Fig. 7B-E). Нокдаун IL-33, однако, селективно ингибировал экспрессию IGFBP1 в ответ на стимуляцию 8-br-cAMP и MPA; не влияя на жизнеспособность клеток (рис. 7B-E). Поэтому мы наблюдали за воспалительной децидуальной реакцией только после нокдауна IL-33. В то время как процедура влияла на экспрессию отдельных генов, сильная и скоординированная индукция хемокинов, цитокинов, интерлейкинов и их рецепторов поддерживалась в первичных культурах, трансфицированных нецелевыми олигонуклеотидами и обработанных 8-br-цАМФ и МФК в течение 48 часов. (Рисунок.8 и табл. 2). Сайленсинг IL-33 не только предотвращал индукцию многих провоспалительных генов в децидуализирующихся клетках, но и активно снижал экспрессию некоторых медиаторов воспаления, особенно интерлейкинов и хемокинов, до уровней ниже тех, которые присутствуют в недифференцированных HESC (рис. S2B).

Рисунок 7. Сайленсинг ST2 в децидуализирующихся HESC вызывает гибель клеток. ( A ) Нокаут Ил-33 в HESC.

Конфлюэнтные первичные культуры сначала трансфицировали нецелевой миРНК ST2 или IL-33, а затем обрабатывали 8-br-цАМФ и МФК в течение 72 часов.Лизаты цельных клеток подвергали иммунозондированию на анти-ST2L, анти-IL-33 и расщепленную поли (АДФ-рибозу) полимеразу (c-PARP). β-актин служил в качестве контроля нагрузки. ( B ) Тотальную РНК, полученную из параллельных культур, подвергали анализу qRT-PCR. Нокдаун ST2, но не IL-33, ингибировал экспрессию децидуальной мРНК PRL. ( C ) Напротив, ST2, а также нокдаун IL-33 ингибировали индукцию транскриптов IGFBP1 в децидуализирующихся клетках. ( D ) Жизнеспособность HESC, трансфицированных сначала нецелевой (NT) миРНК, IL-33 или ST2, нацеленной на миРНК, а затем децидуализированных, измеряли и выражали относительно (%) к числу жизнеспособных клеток в ложно-трансфицированных клетках. , недифференцированные клетки (пунктир).( E ) Процент мертвых или умирающих клеток (<2N;) и жизнеспособных клеток (G0/G1, S и G2/M) определяли с помощью проточной цитометрии фиксированных этанолом клеток, окрашенных йодидом пропидия. Результаты являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Данные представляют собой среднее значение (± стандартное отклонение) первичных культур, полученных из 3 различных биопсий. Биологически три повторных эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g007

Рисунок 8. Представление тепловой карты измененной экспрессии децидуальных медиаторов воспаления после нокдауна IL-33.

Три независимые первичные культуры трансфицировали нецелевой (NT) или IL-33 siRNA (si IL-33) перед обработкой 8-br-цАМФ и МФК в течение 2 дней. Изменение кратности относится к уровням транскриптов в недифференцированных клетках. Первичные культуры были созданы из 3 различных биопсий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g008

Затем мы изучили функциональные последствия нокдауна IL-33 в HESCs при имплантации эмбриона в матку мыши.Первичные культуры HESC трансфицировали нецелевыми олигонуклеотидами или киРНК IL-33 и обрабатывали 8-br-цАМФ и МФК в течение 4 дней. Кондиционированные среды, накопленные за последние 48 часов, использовали для промывания матки псевдобеременных самок мышей перед переносом бластоцисты. Нокдаун IL-33 перед децидуализацией HESC продуцировал супернатанты с тяжелыми последствиями для беременности. Эти супернатанты снижали частоту имплантации перенесенных эмбрионов с 90% (45 мест имплантации из 50 перенесенных эмбрионов) до 14% (7 мест имплантации из 50 перенесенных эмбрионов; P <0.001) (рис. 9А и В). В совокупности данные показывают, что нокдауна IL-33 достаточно, чтобы качественно преобразовать первоначальный провоспалительный децидуальный ответ в противовоспалительный ответ, аналогичный наблюдаемому при длительной дифференцировке (рис. S2B). Гистологическое исследование показало, что воздействие на матку этого измененного децидуального воспалительного ответа до переноса эмбриона поставило под угрозу последующее формирование функционального децидуально-плацентарного интерфейса в нескольких местах имплантации, появившихся через 6 дней (эквивалентно 9.5 д.п.к; Рис. 9С).

Рисунок 9. Нокдаун IL-33 в децидуализирующихся HESCs нарушает имплантацию эмбриона.

( A ) Самок мышей C57BL/6, скрещенных с Vas, подвергали лапаротомии, и оба рога матки осторожно промывали культуральным супернатантом из первичных культур HESC, сначала трансфицированных нецелевой (NT) или IL-33 siRNA (si IL-33 ), а затем децидуализировали для 4 (D4) с 8-бром-цАМФ и МФК. Затем в правый рог переносили десять эмбрионов (эквивалентно стадии 3,5 dpc).Каждая лечебная группа состояла из 5 животных. Количество мест имплантации в правом роге определяли на 9,5 d.p.c. Имплантация была резко снижена после воздействия культурального супернатанта из IL-33-дефицитных D4 HESC. *** Р <0,001. ( B ) Макроскопический вид матки на 9,5 дпц. (Шкала: 1 см). ( C ) Окрашивание репрезентативных мест имплантации H&E. На верхней панели показана нормальная ранняя беременность после смыва культурального супернатанта просвета матки из первичных HESC, трансфицированных NT siRNA.Обратите внимание на зачаток плаценты (P), слияние аллантоиса (A) с хорионом и ткань плода (F). Нижняя панель; воздействие культурального супернатанта из HESC с дефицитом IL-33, децидуализированных в течение 4 дней (D4), приводило к множеству патологических признаков на ранних сроках беременности, включая очаговое кровотечение на границе между плодом и матерью (стрелки). Неравномерность и розовый цвет амниотической жидкости свидетельствуют о коллапсе амниона и коагуляции его содержимого (*). (Шкала шкалы: 100 мкм).

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0052252.g009

Ось IL-33/ST2L/sST2 дерегулирована при децидуализации HESC из RPL

Децидуальный ответ очень различается между первичными культурами HESC, полученными от субъектов RPL и без RPL [13], [37]. Чтобы определить, включает ли аберрантный децидуальный ответ, связанный с ПНБ, также путь IL-33/ST2L, мы установили первичные культуры HESC от 8 пациентов с ПНБ и 12 контролей (таблица 3). Культуры пассировали один раз, выращивали до слияния и затем децидуализировали 8-br-цАМФ и МФК в течение либо 2, либо 8 дней.Как и ожидалось, общие уровни транскриптов ST2 заметно увеличились в дифференцирующихся HESC, и уровни были сопоставимы между RPL и контрольными группами (фиг. 10A). Напротив, индукция транскриптов ST2L достигла пика через 2 дня после обработки 8-br-цАМФ и МФК в контрольных образцах ( P <0,05). Этот двухфазный характер индукции отсутствовал в образцах RPL, и уровни мРНК ST2L оставались повышенными в децидуализированных клетках в течение 8 дней ( P <0,001) (фиг. 10B). Уровни секретируемого sST2 и IL-33 измеряли в дополнительных RPL (n = 15) и не-RPL (n = 16) первичных культурах, децидуализированных в течение 4 или 10 дней.Среду меняли каждые 48 часов. Интересно, что первичные культуры от пациентов с ПНБ секретировали значительно более низкие уровни sST2 при длительной (10-й день) децидуализации ( P <0,001) (рис. 10С). Еще более поразительной была разница в секреции IL-33 между двумя клиническими группами. В контрольных культурах примерно в 10 раз больше IL-33 секретировалось за 4 дня по сравнению с 10 днями децидуализации, тогда как для культур RPL было верно обратное ( P <0,0001) (фиг. 10D).

Рисунок 10.Нарушение регуляции активности IL-33/ST2 в децидуализирующихся HESC у субъектов с ПНБ связано с невынашиванием беременности на ранних сроках.

(A и B) Первичные культуры, пассированные один раз, от контрольных (n = 12) и RPL (n = 8) субъектов обрабатывали 8-Br-цАМФ и МФК (цАМФ/МФК) в течение 2 или 8 дней. Общие уровни транскриптов ST2 и ST2L, нормализованные к мРНК L19, измеряли и выражали в произвольных единицах (AU). Горизонтальные полосы указывают среднее выражение в каждой группе. Обратите внимание на логарифмические оси Y. * Р <0.05; *** Р <0,001. (C и D) Дополнительные культуры от контрольных (n = 15) и субъектов RPL (n = 16) обрабатывали 8-Br-цАМФ и МФК (цАМФ/МФК). Среду меняли каждые 48 часов. Накопленные уровни секретируемых sST2 и IL-33 измеряли на 4 и 8 день лечения. Горизонтальные полосы указывают среднее выражение в каждой группе. Обратите внимание на логарифмические оси Y. *** Р <0,001; **** Р <0,0001. (E) Мышиная модель имплантации использовалась для изучения последствий длительного и неупорядоченного провоспалительного ответа при децидуализации HESCs у пациентов с ПНБ.В каждой лечебной группе было перенесено в общей сложности 40 эмбрионов у 4 животных. Количество мест имплантации (левая панель) в правом роге определяли через 72 ч после переноса бластоцисты (эквивалентно 6,5 дпк). На правой панели показаны репрезентативные места имплантации. Обратите внимание на геморрагическую резорбцию (стрелки) и слабую реакцию децидуализации в группах, получавших супернатант HESC D0 и D10. (Шкала шкалы: 100 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.g010

Затем мы исследовали, влияет ли пролонгированная провоспалительная реакция при децидуализации HESC от пациентов с ПНБ на имплантацию эмбриона в матку мыши.Из 40 эмбрионов, перенесенных в каждой группе, 16 (40%) и 21 (52%) имплантировались после воздействия на матку секретируемых факторов из недифференцированных клеток и децидуализированных клеток в течение 4 дней соответственно (фиг. 10Е). Это было значительно ниже по сравнению с 29 (72,5%) эмбрионами, которые имплантировались после промывания кондиционированной средой из первичных культур RPL, децидуализированных в течение 10 дней ( P <0,05). Интересно, что хотя имплантация эмбриона была наименее нарушена в ответ на воздействие сигналов децидуализированных HESCs в течение 10 дней, приблизительно 90% беременностей обнаруживали дефекты фето-материнского интерфейса через 3 дня (Таблица 4).Таким образом, в то время как паракринные сигналы от культур RPL, децидуализированных в течение 10 дней, не могут сделать эндометрий рефрактерным, внефазовая среда матки при имплантации, по-видимому, ставит под угрозу последующую траекторию беременности.

Обсуждение

Исследования удаления генов на мышах сыграли важную роль в выявлении ключевых регуляторов имплантации. В этой растущей сети генов многие кодируют секретируемые факторы, включая факторы роста (например, Hb-egf), цитокины (например, Lif, IL-1β, Prok1 и IL-11) и различные морфогены (например,грамм. Ihh, Wnt4, Bmp2) [1], [38], [39]. Эти факторы не только передают сигналы преимплантационному эмбриону, но также устанавливают паракринные градиенты, которые контролируют дифференцировку специфических типов клеток в определенном пространственно-временном порядке. Например, передача сигналов Ihh, исходящая из рецептивного эпителия и действующая на нижележащую строму, необходима как для имплантации, так и для децидуализации [40], [41]. Мезенхимально-эпителиальная передача сигналов одинаково важна для имплантации. Это было элегантно проиллюстрировано недавним исследованием, демонстрирующим, что прогестерон, действуя на свой рецептор в стромальных клетках, индуцирует основной фактор транскрипции спираль-петля-спираль Hand2 [42].Подавляя выработку факторов роста фибробластов, которые опосредуют митогенные эффекты эстрогена на эпителий, Hand2 в стромальных клетках позволяет соседним эпителиальным клеткам выходить из клеточного цикла и вступать в путь дифференцировки, ведущий к окну имплантации [42]. Таким образом, последовательная активация двунаправленных паракринных сигнальных каскадов между стромальным и эпителиальным компартментами в мышином эндометрии запускает фенотип рецептивного эндометрия и связывает его с децидуальной реакцией при имплантации эмбриона [2], [43].

Децидуализация стромального компартмента в эндометрии человека также строго контролируется. Однако этот процесс дифференцировки больше не находится под первичным контролем имплантирующегося эмбриона, как это имеет место у большинства млекопитающих. Вместо этого он запускается во время средней секреторной фазы каждого цикла в ответ на локальные факторы, такие как простагландин E2, которые активируют путь цАМФ [5]. После начала фенотип сохраняется до тех пор, пока уровень прогестерона остается высоким. Теперь мы показываем, что передача сигналов цАМФ управляет экспрессией IL-33 в HESC, тогда как прогестины активируют транскрипты ST2.Присутствие IL-33 в эндометрии человека не является неожиданным, поскольку этот цитокин обильно экспрессируется в различных тканях слизистых оболочек и эпителиальных барьеров [28], [44]. Его ядерная экспрессия в сочетании с отсутствием пептидного сигнала для экспорта привела к представлению о том, что IL-33 высвобождается в первую очередь при повреждении ткани или инфекции и, связываясь с ST2L на иммунных клетках, отвечает за инициирование воспаления ткани [28], [45]. ]. Неожиданно мы обнаружили, что децидуализирующиеся HESCs активно секретируют IL-33.Примечательно, что недавние исследования показали, что жизнеспособные клетки могут высвобождать IL-33, например, в ответ на клеточное растяжение или механическое напряжение [46]. Поэтому не исключено, что глубокие изменения формы клеток и динамики актина при децидуализации запускают ядерный экспорт и секрецию IL-33 нетрадиционным путем. Связывание IL-33 с ST2L на клеточной поверхности дифференцирующихся HESCs устанавливает аутокринный путь, который запускает реакцию острой фазы, характеризующуюся скоординированной индукцией интерлейкинов, хемокинов, С-реактивного белка и некоторых других медиаторов воспаления.Активность STL2 в децидуализирующихся клетках по своей природе является самоограничивающейся, поскольку IL-33 в сочетании с непрерывной передачей сигналов прогестина снижает уровни трансмембранных рецепторов и стимулирует секрецию противовоспалительного рецептора-приманки sST2. Переход от провоспалительной к противовоспалительной фазе децидуального процесса дополнительно характеризуется подавлением многих провоспалительных генов ниже базального уровня в недифференцированных стромальных клетках и индукцией цитокинов Th3 IL-5 и IL-10.

Несколько линий доказательств показали, что активация пути IL-33/ST2 в HESC имеет решающее значение для успешной беременности.Во-первых, только во время провоспалительной фазы дифференцирующиеся HESC секретируют факторы, которые усиливают экспрессию генов мышиной восприимчивости, что делает возможным эффективную имплантацию трансплантированных мышиных бластоцист. Во-вторых, мы обнаружили, что имплантация в матку мыши активно нарушается при воздействии сигналов от недифференцированных HESC, от децидуализирующихся клеток в противовоспалительной фазе и от децидуализирующихся клеток, впервые трансфицированных IL-33 siRNA. Важно отметить, что в то время как некоторые эмбрионы действительно имплантировались в этих условиях, большая часть полученных в результате мест имплантации демонстрировала патологические признаки, включая очаговое кровотечение и чрезмерную инфильтрацию иммунными клетками.Примечательно, что мыши с дефицитом либо ST2 [47], либо IL-33, как сообщается, фертильны (личное общение с доктором А. Маккензи, Кембриджский университет), хотя, насколько нам известно, ранние случаи беременности еще не исследовались на этих животных моделях. Хотя это спекулятивно, это может быть связано с межвидовыми различиями в материнском и эмбриональном контроле децидуального процесса или указывать на степень избыточности в первичном триггере проимплантационного воспалительного ответа. В-третьих, мы показали, что последовательная активация оси IL-33/ST2L/sST2 нарушена в первичных HESC от субъектов RPL и, вероятно, вызывает длительное окно имплантации.Опять же, многие места имплантации показали патологические особенности, подчеркивая, что периимплантационная среда имеет глубокие последствия для последующей траектории развития зачатия. Таким образом, длительный и беспорядочный аутовоспалительный ответ в резидентных стромальных клетках, по-видимому, вызывает значительное побочное повреждение, приводящее к кровотечению, чрезмерному набору местных иммунных клеток и последующей гибели плода. В соответствии с нашими выводами, аберрантная передача сигналов от оси IL-33/ST2L/sST2 была связана с поздними осложнениями беременности, такими как преэклампсия [48] и выкидыш [49].

ПНБ, определяемый здесь как 3 или более последовательных выкидышей, является распространенным заболеванием, которым страдают 1–2% пар [50], [51]. Это является причиной значительной физической и психологической заболеваемости и связано с повышенной вероятностью акушерских осложнений и неблагоприятного перинатального исхода при последующей продолжающейся беременности [51]. Наши результаты подтверждают, что клеточный ответ на идентичные сигналы дифференцировки сильно различается между первичными культурами, созданными из RPL, и контрольными субъектами.Кроме того, данные обеспечивают новое понимание природы и патологических последствий аберрантной децидуализации, хотя лежащий в основе молекулярный механизм требует дальнейшего выяснения. Появляющиеся данные указывают на то, что глубокие изменения в структуре хроматина, примером которых является перераспределение транскрипционно-репрессивных и пермиссивных гистоновых меток по всему геному, предшествуют экспрессии децидуального фенотипа в HESCs [52]. Следовательно, возможно, что первичный дефект в RPL может заключаться в эпигенетическом программировании эндометриальных стромальных клеток или их стволовых клеток/клеток-предшественников костного мозга [53].

Таким образом, ограничивая окно имплантации, постоянно меняющаяся среда эндометрия выравнивается в соответствии с требованиями имплантации бластоцисты. Пролонгированная или неограниченная рецептивность эндометрия влечет за собой очевидный риск имплантации эмбрионов с задержкой развития или скомпрометированных эмбрионов [13]. Кроме того, асинхронность между развитием эндометрия и эмбриона на ранних сроках беременности может вызвать ряд патологических событий, ведущих к выкидышу или предрасполагающих к акушерским осложнениям, связанным с дефектной плацентацией, таким как преэклампсия и задержка роста плода [12], [14].Наши результаты показывают, что рецептивность матки контролируется активацией ауторегуляторных петель обратной связи в децидуализирующихся стромальных клетках, лежащих в основе просветного эпителия, которые запускают последовательную экспрессию про- и противовоспалительных генных сетей. Хотя наши наблюдения показывают, что стромальные клетки могут выполнять эту функцию независимо от местных иммунных клеток, необходимы эксперименты по комплементации, чтобы определить регулирующую роль других типов клеток эндометрия в процессе имплантации.Мы также представили доказательства того, что неспособность дифференцирующихся HESCs перейти от прорецепторного к постимплантационному фенотипу предрасполагает к последующему невынашиванию беременности. Клинически путь IL-33/ST2 считается основной новой мишенью для терапевтических вмешательств при ряде заболеваний, включая болезнь Альцгеймера [54], гельминтозы [55], сердечно-сосудистые заболевания [56], ожирение [57], астму [54]. 58] и другие аутоиммунные заболевания [59], [60]. Наши результаты показывают, что нацеливание на тот же путь в матке является многообещающей стратегией регуляции рецептивности эндометрия.

Дополнительная информация

Рисунок S2.

Нокдаун IL-33 в HESC, децидуализированных в течение 2 дней, вызывает воспалительную реакцию, сходную с той, что наблюдается в клетках, децидуализированных в течение 8 дней. ( A ) Количество транскриптов со значительной повышенной или пониженной регуляцией в каждой из указанных категорий после децидуализации в течение 2 или 8 дней (D2 и D8 соответственно) по сравнению с недифференцированными клетками. ( B ) Количество транскриптов со значительно повышенной или пониженной регуляцией в каждой из указанных категорий после 2 дней децидуализации первичных культур HESC, трансфицированных либо нецелевой (NT), либо IL-33 siRNA (si IL-33) .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052252.s002

(TIF)

Благодарности

Мы благодарны всем женщинам, принявшим участие в этом исследовании. Эта работа была поддержана Отделом биомедицинских исследований в области репродуктивного здоровья, совместной инициативой университетских больниц Ковентри и Уорикшира NHS Trust и Уорикской медицинской школы, а также Genesis Research Trust (MSS)

.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MSS JJB.Выполнены эксперименты: MSS JN JHS ZW SS MN YS KM SJ MC. Проанализированы данные: MSS MN YWC JHS YS. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: YA SQ JJB. Написал статью: MSS ESL JJB BAC BM.

Каталожные номера

  1. 1. Ван Х, Дей С.К. (2006)Дорожная карта имплантации эмбрионов: подсказки на моделях мышей. Обзоры природы Генетика 7: 185–199.
  2. 2. Bazer FW, Spencer TE, Johnson GA, Burghardt RC, Wu G (2009) Сравнительные аспекты имплантации. Репродукция 138: 195–209.
  3. 3. Brosens JJ, Gellersen B (2006)Смерть или выживание – прогестерон-зависимые решения судьбы клеток в строме эндометрия человека. Журнал молекулярной эндокринологии 36: 389–398.
  4. 4. Геллерсен Б., Бросенс ​​И.А., Бросенс ​​Дж.Дж. (2007)Децидуализация человеческого эндометрия: механизмы, функции и клинические перспективы. Семинары по репродуктивной медицине 25: 445–453.
  5. 5. Геллерсен Б., Бросенс ​​Дж. (2003)Взаимодействие циклического АМФ и рецептора прогестерона в эндометрии человека: децидуализирующее дело.Журнал эндокринологии 178: 357–372.
  6. 6. Achache H, Revel A (2006)Маркеры рецептивности эндометрия, путь к успешной имплантации эмбриона. Обновление репродукции человека 12: 731–746.
  7. 7. Aghajanova L, Hamilton AE, Giudice LC (2008) Восприимчивость матки к имплантации человеческого эмбриона: гистология, биомаркеры и транскриптомика. Семинары по биологии клетки и развития 19: 204–211.
  8. 8. Diedrich K, Fauser BC, Devroey P, Griesinger G (2007) Роль эндометрия и эмбриона в имплантации человека.Обновление репродукции человека 13: 365–377.
  9. 9. Дей С.К., Лим Х., Дас С.К., Риз Дж., Париа Б.К. и др. (2004) Молекулярные сигналы имплантации. Эндокринные обзоры 25: 341–373.
  10. 10. Harper MJ (1992) Окно имплантации. Клиническое акушерство и гинекология Байьера 6: 351–371.
  11. 11. Эверс Дж. Л. (2002) Женское бесплодие. Ланцет 360: 151–159.
  12. 12. Текленбург Г., Салкер М., Хейнен С., Маклон Н.С., Бросенс ​​Дж.Дж. (2010)Молекулярная основа привычного невынашивания беременности: нарушение естественного отбора эмбрионов.Молекулярная репродукция человека 16: 886–895.
  13. 13. Салкер М., Текленбург Г., Молохия М., Лавери С., Трю Г. и др. (2010) Естественный отбор эмбрионов человека: нарушение децидуализации эндометрия отключает взаимодействие эмбриона и матери и вызывает повторяющееся невынашивание беременности. PloS один 5: e10287.
  14. 14. Wilcox AJ, Baird DD, Weinberg CR (1999)Время имплантации зачатия и потеря беременности. Медицинский журнал Новой Англии 340: 1796–1799.
  15. 15.Cloke B, Huhtinen K, Fusi L, Kajihara T, Yliheikkila M, et al. (2008) Рецепторы андрогенов и прогестерона регулируют различные генные сети и клеточные функции при децидуализации эндометрия. Эндокринология 149: 4462–4474.
  16. 16. Джонс М.С., Фуси Л., Хайэм Дж.Х., Абдель-Хафиз Х., Хорвиц К.Б. и др. (2006) Регуляция пути SUMO повышает чувствительность дифференцирующихся стромальных клеток эндометрия человека к прогестерону. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 103: 16272–16277.
  17. 17. Аль-Саббах М., Фуси Л., Хайэм Дж., Ли И., Лей К. и др. (2011) Активные формы кислорода, полученные из NADPH-оксидазы, опосредуют децидуализацию стромальных клеток эндометрия человека в ответ на передачу сигналов циклического AMP. Эндокринология 152: 730–740.
  18. 18. Ван С., Танака Т., Накамура Х., Умесаки Н., Хираи К. и др. (2003)Гранулированные клетки метриальной железы в мышиной матке: локализация, кинетика и функциональная роль в ангиогенезе во время беременности. Исследования и техника микроскопии 60: 420–429.
  19. 19. Чжан Дж., Чен З., Смит Г.Н., Крой Б.А. (2011)Трансформация сосудов, запускаемая естественными клетками-киллерами: материнская забота до рождения? Клеточная и молекулярная иммунология 8: 1–11.
  20. 20. Ласкарин Г., Стрбо Н., Богович Крнчич Т., Юретич К., Леди Батай Н. и др. (2005)Физиологическая роль IL-15 и IL-18 в контакте матери и плода. Химическая иммунология и аллергия 89: 10–25.
  21. 21. Нэнси П., Тальяни Э., Тай К.С., Асп П., Леви Д.Э. и соавт.(2012)Сайленсинг хемокинового гена в децидуальных стромальных клетках ограничивает доступ Т-клеток к материнско-плодовому интерфейсу. Наука 336: 1317–1321.
  22. 22. Guzeloglu-Kayisli O, Kayisli UA, Taylor HS (2009)Роль факторов роста и цитокинов во время имплантации: эндокринные и паракринные взаимодействия. Семинары по репродуктивной медицине 27: 62–79.
  23. 23. Вегманн Т.Г., Лин Х., Гилберт Л., Мосманн Т.Р. (1993)Двунаправленные взаимодействия цитокинов в отношениях матери и плода: является ли успешная беременность феноменом Th3? Иммунология сегодня 14: 353–356.
  24. 24. Chaouat G, Tranchot Diallo J, Volumenie JL, Menu E, Gras G и др. (1997) Иммунная супрессия и баланс Th2/Th3 во время беременности: (очень) личная дань уважения Тому Вегманну. Американский журнал репродуктивной иммунологии 37: 427–434.
  25. 25. Wilczynski JR (2005)Баланс цитокинов Th2/Th3 – инь и ян репродуктивной иммунологии. Европейский журнал акушерства, гинекологии и репродуктивной биологии 122: 136–143.
  26. 26. Kakkar R, Lee RT (2008)Путь IL-33/ST2: терапевтическая цель и новый биомаркер.Обзоры Nature Открытие лекарств 7: 827–840.
  27. 27. Миллер А.М., Лью Ф.Ю. (2011)Путь IL-33/ST2 – новая терапевтическая мишень при сердечно-сосудистых заболеваниях. Фармакология и терапия 131: 179–186.
  28. 28. Палмер Г., Габай С. (2011) Биология интерлейкина-33 с потенциальным пониманием болезней человека. Обзоры природы Ревматология 7: 321–329.
  29. 29. Haraldsen G, Balogh J, Pollheimer J, Sponheim J, Kuchler AM (2009) Интерлейкин-33 – цитокин двойной функции или новый алармин? Тенденции в иммунологии 30: 227–233.
  30. 30. Карьер В., Руссель Л., Ортега Н., Лакорре Д.А., Америх Л. и др. (2007) IL-33, IL-1-подобный цитокиновый лиганд для рецептора ST2, представляет собой хроматин-ассоциированный ядерный фактор in vivo. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 104: 282–287.
  31. 31. Палмер Г., Липски Б.П., Смитгалл М.Д., Майнингер Д., Сиу С. и соавт. (2008) Дополнительный белок рецептора IL-1 (AcP) необходим для передачи сигналов IL-33, а растворимый AcP усиливает способность растворимого ST2 ингибировать IL-33.Цитокин 42: 358–364.
  32. 32. Миллер А.М. (2011)Роль IL-33 в воспалении и заболевании. Журнал воспаления 8: 22.
  33. 33. Brosens JJ, Hayashi N, White JO (1999) Рецептор прогестерона регулирует децидуальную экспрессию пролактина в дифференцирующихся стромальных клетках эндометрия человека. Эндокринология 140: 4809–4820.
  34. 34. Кононен Дж., Бубендорф Л., Каллиониеми А., Барлунд М., Шрамл П. и соавт. (1998)Тканевые микрочипы для высокопроизводительного молекулярного профилирования образцов опухолей.Природная медицина 4: 844–847.
  35. 35. Такано М., Лу З., Гото Т., Фуси Л., Хайэм Дж. и др. (2007) Транскрипционная перекрестная связь между фактором транскрипции forkhead box O1A и рецептором прогестерона координирует регуляцию клеточного цикла и дифференцировку в стромальных клетках эндометрия человека. Молекулярная эндокринология 21: 2334–2349.
  36. 36. Шервин Дж. Р., Шарки А. М., Камео П., Маврогианис П. М., Каталано Р. Д. и др. (2007)Идентификация новых генов, регулируемых хорионическим гонадотропином, в эндометрии павианов во время окна имплантации.Эндокринология 148: 618–626.
  37. 37. Salker MS, Christian M, Steel JH, Nautiyal J, Lavery S и др. (2011) Нарушение регуляции сывороточной и глюкокортикоид-индуцируемой киназы SGK1 в эндометрии вызывает репродуктивную недостаточность. Природная медицина.
  38. 38. Сингх М., Чаудхри П., Асселин Э. (2011)Связывание восприимчивости эндометрия и имплантации: сеть гормонов, цитокинов и факторов роста. Журнал эндокринологии 210: 5–14.
  39. 39. Koot YE, Teklenburg G, Salker MS, Brosens JJ, Macklon NS (2012)Молекулярные аспекты неудачи имплантации.Биохимика и биофизика акта.
  40. 40. Matsumoto H, Zhao X, Das SK, Hogan BL, Dey SK (2002)Индийский еж как чувствительный к прогестерону фактор, опосредующий эпителиально-мезенхимальные взаимодействия в матке мыши. Биология развития 245: 280–290.
  41. 41. Такамото Н., Чжао Б., Цай С.Ю., ДеМайо Ф.Дж. (2002)Идентификация индийского ежа как гена, чувствительного к прогестерону, в мышиной матке. Молекулярная эндокринология 16: 2338–2348.
  42. 42. Li Q, Kannan A, DeMayo FJ, Lydon JP, Cooke PS, et al.(2011) Антипролиферативное действие прогестерона на эпителий матки опосредовано Hand2. Наука 331: 912–916.
  43. 43. Nallasamy S, Li Q, Bagchi MK, Bagchi IC (2012)Гены гомеобокса Msx критически регулируют имплантацию эмбриона, контролируя паракринную передачу сигналов между стромой матки и эпителием. Генетика PLoS 8: e1002500.
  44. 44. Лью Ф.Ю., Питман Н.И., Макиннес И.Б. (2010)Функции IL-33, связанные с заболеванием: новый ребенок в семье IL-1. Обзоры природы Иммунология 10: 103–110.
  45. 45. Чжао В., Ху З. (2010) Загадочная обработка и секреция интерлейкина-33. Клеточная и молекулярная иммунология 7: 260–262.
  46. 46. Kakkar R, Hei H, Dobner S, Lee RT (2012) Интерлейкин 33 как механически чувствительный цитокин, секретируемый живыми клетками. Журнал биологической химии 287: 6941–6948.
  47. 47. Хосино К., Кашивамура С., Курибаяши К., Кодама Т., Цудзимура Т. и др. (1999) Отсутствие T1/ST2, связанных с рецептором интерлейкина 1, не влияет на развитие Т-хелперных клеток 2 типа и их эффекторную функцию.Журнал экспериментальной медицины 190: 1541–1548.
  48. 48. Гранн И., Сауткомб Дж. Х., Снайдер Дж. В., Таннетта Д. С., Чайлд Т. и др. (2011) ST2 и IL-33 при беременности и преэклампсии. PloS один 6: e24463.
  49. 49. Kaitu’u-Lino TJ, Tuohey L, Tong S (2012)Интерлейкин-33 материнской сыворотки и растворимый ST2 на ранних сроках беременности и их связь с выкидышем. Журнал репродуктивной иммунологии 95: 46–49.
  50. 50. Quenby S, Vince G, Farquharson R, Aplin J (2002) Повторяющийся выкидыш: дефект в природном контроле качества? Репродукция человека 17: 1959–1963.
  51. 51. Рай Р., Риган Л. (2006) Повторяющийся выкидыш. Ланцет 368: 601–611.
  52. 52. Гримальди Г., Кристиан М., Куэнби С., Бросенс ​​Дж. Дж. (2012)Экспрессия эпигенетических эффекторов при децидуализации стромальных клеток эндометрия человека. Молекулярная репродукция человека.
  53. 53. Gargett CE, Ye L (2012)Реконструкция эндометрия из стволовых клеток. Плодородие и бесплодие 98: 11–20.
  54. 54. Чапюи Дж., Хот Д., Хансманнель Ф., Кердраон О., Феррейра С. и др.(2009) Транскриптомные и генетические исследования идентифицируют IL-33 как ген-кандидат для болезни Альцгеймера. Молекулярная психиатрия 14: 1004–1016.
  55. 55. Humphreys NE, Xu D, Hepworth MR, Liew FY, Grencis RK (2008) IL-33, мощный индуктор адаптивного иммунитета к кишечным нематодам. Журнал иммунологии 180: 2443–2449.
  56. 56. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J (2010)Интерлейкин-33, новый член семейства цитокинов IL-1/IL-18, в кардиологии и кардиохирургии.Торакальный и сердечно-сосудистый хирург 58: 443–449.
  57. 57. Миллер А.М., Асквит Д.Л., Хьюбер А.Дж., Андерсон Л.А., Холмс В.М. и др. (2010) Интерлейкин-33 оказывает защитное действие при воспалении жировой ткани при ожирении у мышей. Исследование тиражей 107: 650–658.
  58. 58. Ягами А., Орихара К., Морита Х., Футамура К., Хашимото Н. и др. (2010) IL-33 опосредует воспалительные реакции в клетках легочной ткани человека. Журнал иммунологии 185: 5743–5750.
  59. 59.Белтран С.Дж., Нуньес Л.Е., Диас-Хименес Д., Фарфан Н., Кандия Э. и др. (2010) Характеристика новой системы ST2/IL-33 у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника. Воспалительные заболевания кишечника 16: 1097–1107.
  60. 60. Мок М.Ю., Хуанг Ф.П., Ип В.К., Ло И., Вонг Ф.Ю. и др. (2010)Уровни IL-33 и растворимого ST2 в сыворотке и их связь с активностью заболевания при системной красной волчанке. Ревматология 49: 520–527.

Synchro Tapper ST2: Устройство для нарезания резьбы с сервоприводом

Synchro Tapper ST2

Высокоточное устройство для нарезания резьбы с сервоприводом, обеспечивающее повторяемость и точность Synchro Tapper ST2 — это устройство для нарезания резьбы с сервоприводом, способное к повторяемому нарезанию резьбы с высокой точностью в пределах ±0.03 мм в конце полного хода. прецизионное нарезание резьбы в пределах ±0,03 мм. Высокоскоростное нарезание резьбы до 4000 мин -1 . Вторая контрольная точка значительно сокращает время цикла.

Спецификации + 91 926 91 928 Номер модели Касание емкости 91 934 Инсульт + 91 947 Ускоренный ход 91 947 Свинец подачи 91 947 Общий ход 91 927 +
Скорость вращения двигателя Винт основного тона +
, которые могут быть обработаны.
Вес
одноосный
Ускоренный ход Свинец корма Алюминиевый
(АЦП)
Сталь
(S45C)
мин Макс. 4000 При обработке M1-M5:
1 – 4000
При обработке M6:
1 – 3000
M1

M6
(M6)
M1
.5)
Макс. 60 Макс. 60 Макс. 60 0,6
переменного тока серво
двигатель
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,6
0,7
0,8
1,0
100
80
72
64
56
48
44
40
36
32
28
27
26
24
13

Примечание: №
5-кратный диаметр резьбы. Значение в круглых скобках показывает значения при использовании касания рукой 2.
2. Выбор скорости вращения при резке должен основываться на типе обрабатываемого материала, характеристиках резания, диаметре и материале метчиков, скорости резания и т. д. использовал.
4. Скорость ускоренного подвода и скорость рабочей подачи различаются в зависимости от шага нарезания резьбы и скорости вращения. За подробностями обращайтесь в ближайший офис продаж.
5. Максимальный вес навесного оборудования указан ниже. Горизонтальная обработка: 8 кг, вертикальная (вниз) обработка: 6 кг
6. При обработке в вертикальном (вверх) направлении примите меры для защиты синхронизатора от воды и пыли. За подробностями обращайтесь в ближайший офис продаж.

Различные типы бетона и их прочность

Главная » Типы бетона » Типы бетона и их прочность

Люди используют бетон для самых разных целей; его можно использовать для фундаментов, полов, стен и многого другого.Но не все бетонные смеси одинаковы, и в зависимости от того, чего вы хотите достичь, вам нужно получить бетонную смесь, подходящую для этой цели.

Бетонные смеси могут использовать ряд материалов для придания различных качеств. Как правило, все они включают цемент, воду и некоторую смесь песка и камня.

В The Concrete Network мы предлагаем различные бетонные смеси, предназначенные для коммерческих и бытовых целей. Мы можем посоветовать вам, какие типы бетона лучше всего подходят для вашего проекта, и даже подобрать смесь в соответствии с вашими точными требованиями.Для получения дополнительной информации или размещения заказа просто свяжитесь с нами сегодня.

Нужен дружеский и профессиональный совет?
Call Concrete Network сейчас включен 0800 031 8047

Вас также может заинтересовать

Типы коммерческого бетона

C7/8 / поколение 0

Характеристики: Используемая в самых разных коммерческих и бытовых проектах, эта влажная тощая смесь достаточно универсальна для использования во всем, от фундамента до бордюров.

Для чего его используют?

  • заполнение полости
  • бордюр
  • внутренние фундаменты
  • сгибание

C10 / 1-е поколение

Характеристики: еще одна чрезвычайно универсальная смесь, этот тип бетона может использоваться в строительстве и общих проектах, включая сельскохозяйственные и дренажные приложения.

Для чего его используют?

  • ступенчатый фундамент
  • жалюзи для пола
  • дренаж
  • засыпка траншей

C15 / ГЕНЕРАЛ 2

Характеристики: Если в перекрытиях нет закладных металлов, идеально подойдет этот тип бетона.Он особенно популярен для голой отделки, где ничего не будет использоваться для его покрытия.

Для чего его используют?

  • ступенчатый фундамент
  • мощение
  • дорожек

C20 / ГЕНЕРАЛ 3

Характеристики: Чаще всего используется там, где грунт может быть недостаточно устойчивым, этот бетон можно использовать в качестве плитного фундамента для всего, от домов до караванов.

Для чего его используют?

  • фундаменты
  • мощение
  • основания для сарая и гаража
  • расширения

С25/СТ 2

Характеристики: В зависимости от ваших потребностей, этот бетон можно использовать для настила пола или в качестве массовой заливки под фундаменты и фундаменты. Из-за своей прочности его иногда можно использовать в сельскохозяйственных целях.

Для чего его используют?

  • фундаменты
  • патио
  • засыпка траншей
  • пристройки к дому

С30/ПАВ1/СТ 3

Характеристики: Применяется при строительстве дорожных покрытий и легких наружных работах. Смеси PAV1 обеспечивают повышенную защиту от циклов замерзания-оттаивания.

Для чего его используют?

  • мощение
  • усиленные стойки
  • основания для дома
  • пристройки к дому

С35/ПАВ2

Характеристики: Этот сверхпрочный бетон, характеризующийся способностью выдерживать большие нагрузки, может использоваться для фундаментов плит и плит для поверхностей, используемых большегрузными транспортными средствами.PAV2 содержит добавку для защиты от циклов замерзания-оттаивания при использовании на открытом воздухе.

Для чего его используют?

  • фундаменты коммерческих зданий
  • легкие складские помещения

С40

Характеристики: Прочная смесь, этот бетон можно использовать для строительства фундаментов, где будут присутствовать большие нагрузки или движение транспорта. Его также можно использовать для опорных балок в строительстве.

Для чего его используют?

  • мощение
  • LHGV парки
  • фундамент септика

Типы бытового бетона

Стандартный товарный бетон

Характеристики: Один из наиболее часто производимых бетонов, смесь изготавливается на бетонном заводе и доставляется на строительную площадку в традиционном барабанном смесителе. Важно заказывать этот бетон точно и с расчетом приготовленной смеси.

Для чего его используют?

  • подвальные постройки
  • больших рабочих площадок
  • везде, где мало времени и места

Объемный бетон

Характеристики: В качестве дозирующей установки используется объемный смеситель – полностью мобильный. Это позволяет вам платить только за то, что вы используете, настраивая дизайн смеси в соответствии с приложением и условиями площадки.

Для чего его используют?

  • многосайтовые проекты
  • подвал строит
  • крупных сайтов

Самоуплотняющийся бетон — SCC

Характеристики: В эту смесь добавлены химикаты для более быстрого расхода, что позволяет ей выравниваться и уплотняться. Этот бетон легко заливается на место без необходимости механического уплотнения.

Для чего его используют?

  • фундаменты
  • сборные конструкции
  • сайтов с ограниченным временем и рабочей силой

Декоративный бетон

Характеристики: С помощью декоративного бетона можно получить целую гамму цветов и текстур. Это делает его идеальным для любых проектов, где вы хотите оказать эстетическое воздействие.

Для чего его используют?

  • декоративный пол
  • мощение
  • архитектурных особенностей

Быстротвердеющий бетон

Характеристики: Когда времени мало, будь то ремонт конструкций или просто завершение строительства, быстротвердеющий бетон является идеальной смесью.Этот материал схватывается быстрее, чем большинство типов бетона, поэтому он также полезен в зимних условиях, когда холод не позволяет использовать обычный бетон.

Для чего его используют?

  • ремонт бетона
  • дорожные работы
  • столбы забора

Рулонный уплотненный бетон

Характеристики: Этот бетон, способный выдерживать большие нагрузки, идеально подходит для дорог.Он требует меньше отделки и опалубки и укладывается аналогично асфальту. При его производстве образуется меньше выбросов, что обеспечивает экологические преимущества.

Для чего его используют?

  • тротуары
  • дорожные работы
  • РД аэропорта
  • автостоянки и промышленные покрытия

Фибробетон

Характеристики: Этот бетон, содержащий мелкие волокна, обладает большей прочностью, долговечностью и целостностью.Конструкции, построенные из этого бетона, также должны меньше трескаться и смещаться.

Для чего его используют?

  • промышленное покрытие
  • отечественных проектов
  • легкие коммерческие проекты

Проницаемый бетон (проницаемый)

Характеристики: Пористая бетонная смесь, пропускающая воду и тем самым снижающая риск затопления.Его можно использовать для ограничения отходов воды как более устойчивого и экологически чистого материала.

Для чего его используют?

  • бассейны
  • устойчивых проектов
  • автостоянок
  • плоские конструкции

Жидкий бетон

Характеристики: с добавлением пластификаторов, которые облегчают заливку этого бетона, он известен высокой точностью и гладкостью отделки.


Пенобетон

Характеристики: Обладая высокими тепловыми качествами и возможностью смешивания с рядом добавок, пенобетон является универсальным материалом с многочисленными областями применения.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.